cơ sở khoa học và ứng dụng của sinh học phân tử vào xét nghiệm huyết thống

CƠ SỞ KHOA HỌC VÀ ỨNG DỤNG CỦA SINH HỌC PHÂN TỬ VÀO XÉT NGHIỆM HUYẾT THỐNG Giảng viên hướng dẫn: PGS-TS Khuất Hữu Thanh I CƠ SỞ KHOA HỌC SINH HỌC PHÂN TỬ VÀO XÉT NGHIỆM HUYẾT THỐNG II CÁC PHƯƠNG PHÁP ỨNG DỤNG SINH HỌC PHÂN TỬ VÀO XÉT NGHIỆM HUYẾT THỐNG PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG PHẢN ỨNG PCR PHƯƠNG PHÁP GIẢI TRÌNH TỰ GEN PHƯƠNG PHÁP LAI PHÂN TỬ CƠ SỞ SINH HỌC PHÂN TỬ VÀO XÉT NGHIỆM HUYẾT THỐNG   Trong thể người chứa hàng tỷ tế bào Những tế bào hầu hết có nhân ( trừ số tế bào khơng có nhân, ví dụ tiểu cầu) Nhân tế bào mang vật liệu di truyền ( gọi gen) nằm nhiễm sắc thể (NST) Theo quy luật di truyền, đứa trẻ sinh thừa hưởng 23 nhiễm sắc thể đơn từ cha 23 nhiễm sắc thể đơn từ mẹ, tạo thành 23 cặp nhiễm sắc thể tồn theo suốt đời Mỗi người mang dấu vết di truyền riêng biệt - Xác định DNA thực việc phân tích DNA hai cá nhân (có nghi ngờ quan hệ huyết thống) để xác định thông tin di truyền họ Việc so sánh thông tin di truyền xác định mối quan hệ huyết thống họ Hệ gen tập hợp toàn gen Hệ gen người Các trường hợp xét nghiệm DNA - Dựa vào nhiễm sắc thể Y Đàn ông truyền nhiễm sắc thể Y cho trai họ qua nhiều đời, xét nghiệm DNA huyết thống dựa vào nhiễm sắc thể Y theo dòng nội - Dựa vào nhiễm sắc thể X Dựa vào sở khoa học, người nam mang gene XY, người mẹ mang gene XX, sinh người gái, nhiễm sắc thể X thừa hưởng từ mẹ nhiễm sắc thể X thừa hưởng từ cha Do người cha truyền nhiễm sắc thể X cho người gái nên xét nghiệm dựa vào nhiễm sắc thể X kết luận - Dựa vào DNA ty thể DNA ty thể truyền từ mẹ sang (cả trai gái) qua nhiều hệ có đột biến Các trường hợp xét nghiệm DNA huyết thống dựa vào NST Y - Anh – em trai muốn xét nghiệm mối quan hệ huyết thống trường hợp khơng có mẫu xét nghiệm người cha đẻ - Ơng nội – cháu trai trường hợp khơng có mẫu người cha đẻ - Bác trai (chú) – cháu trai trường hợp không lấy mẫu xét nghiệm người cha đẻ - Anh – em trai bác ruột – ruột - Những trường hợp cách xa qua nhiều hệ như: Ông nội – cha – trai – cháu trai… cho kết xét nghiệm xác Xét nghiệm thực để kiểm tra hai người có cha hay không s Các trường hợp tiến hành xét nghiệm DNA huyết thống dựa vào NST X • Chị – em gái khác mẹ, kiểm tra DNA có cha hay khơng • Chị – em gái mẹ, kiểm tra DNA có cha hay khơng (Trường hợp khuyến khích người mẹ tham gia xét nghiệm) • Bà nội – cháu gái có nghi vấn mối quan hệ huyết thống Những trường hợp tiến hành xét nghiệm DNA huyết thống dựa vào DNA ty thể • • • • • • • Dám định hài cốt liệt sĩ Mẹ – gái có nghi vấn mối quan hệ huyết thống Bà ngoại – cháu gái có mối quan hệ huyết thống hay khơng Dì – cháu gái, bác gái (chị gái ruột mẹ) – cháu gái,… Xét nghiệm DNA huyết thống anh trai – em gái Chị – em gái có nghi vấn mẹ Người anh trai em gái có người mẹ đẻ muốn xác định có cha đẻ hay không Xét nghiệm thực người cha giả định cung cấp mẫu làm xét nghiệm Xét nghiệm khuyến khích tham gia người mẹ để loại trừ DNA người mẹ khỏi hai nhằm nâng cao độ xác suất xác xét nghiệm Các phương pháp lai phân tử 1.Cơ sở lai phân tử Khái niệm lai phân tử: + Khi phân tử DNA mạch đôi đun lên nhiệt độ vượt nhiệt độ nóng chảy Tm hai mạch sẻ tách rời phá vỡ liên kết H hai mạch + Sau hai mạch tách rời nhiệt độ phản ứng làm giảm từ từ cộng với điều kiện thí nghiệm thích hợp, chúng sẻ bắt cặp trở lại, tượng gọi lai phân tử Đặc điểm lai phân tử: + Đặc hiệu tuyệt đối: tái bắt cặp xảy hai trình tự hồn tồn bổ sung với + Các trình tự bổ sung DNA, RNA dẫn đến hình thành phân tử DNA – RNA, RNA – RNA hay phân tử lai DNA – DNA CÁC KIỂU LAI PHÂN TỬ Phân loại - Lai pha lỏng ( dùng quang phổ kế, nuclease S1 , sắc kí hydroxylapatite) - Lai pha rắn ( thường sử dụng hơn) : + Southern blot +Nouthern blot +Western blot +Dot ( slot ) blot 2.1 Lai pha lỏng • Nguyên tắc: +Các mạch đơn nằm môi trường lỏng dung dịch đệm +Sự lai phân tử xảy trình tự gặp chuyển động nhiệt nhiệt độ môi trường thấp Tm vài độ • 2.1.1 Phương pháp dùng quang phổ kế - DNA hấp thụ ánh sáng yếu DNA mạch đôi - Sự chuyển từ dạng mạch đôi sang dạng mạch đơn xác định dễ dàng thông qua việc đo biến động giá trị mật độ quang (OD) bước sóng 260 nm - Giá trị mật độ quang tăng lên phân tử mạch đôi chuyển thành mạch đơn, tượng có tên gọi phản ứng siêu sắc (hyperchromic effect)  Phương pháp dùng quang phổ kế Nhuộm tím phân tử DNA, đem chúng đun nóng làm lạnh từ từ kết phân tử DNA trở nên tím đậm Nếu hạ nhiệt độ cách đột ngột chúng trở nên đậm Đó tượng mạch đơn DNA hấp thụ tia UV mạnh DNA mạch đơi • 2.1.2 Phương pháp sử dụng nuclease S1 • - Nuclease S1 enzyme thủy giải nucleic acid mạch đơn DNA hay RNA số điều kiện thực nghiệm • • - Dung dịch phản ứng lai trích phần đem xử lý với nuclease S1 - Các mạch đơn bị thủy giải, NA lại tương ứng với phân tử lai thu nhận qua phương pháp tủa đem định lượng • 2.1.3 Phương pháp sắc ký hydroxylapatite • Hydroxylapatite tinh thể phosphat calci • Kỹ thuật sử dụng mồi đánh dấu (đoạn nucleotide kháng thể ) để lai với DNA, RNA với protein tế bào mà khơng cần tách chiết • Sau bị đốt nóng chúng làm lạnh để mạch đơn va chạm ngẫu nhiên Các hỗn hợp ủ khoảng 120h 600 dung dịch đệm Natri phosphat • Ở nồng độ muối cao nucleic mạch đôi gắn vào giá thể này, phần nucleic không gắn thu nhận • 2.2 Lai pha rắn • * Nguyên tắc: - Giống với nguyên tắc lai pha lỏng Khác chỗ trình tự bổ sung cố định giá thể rắn *Ưu điểm: -Dễ dàng thao tác tách trình tự khơng lai khỏi phân tử -ngăn tái bắt cặp hai mạch phân tử *Nhược điểm: -Phân tích định lượng phân tử lai xác hiệu lai thấp -Vận tốc lai so với lai pha lỏng • 2.2.1 Phương pháp Southern blot • Nguyên tắc: Màng lai nitrocelluse có khả tiếp nhận DNA biết từ lâu sử dụng nghiên lai nucleic acid khác vào thập niên 1950 1960 *** Các bước tiến hành: • Cắt DNA enzyme giới hạn • Điện di sản phẩm cắt gel • Làm biến tính DNA • Chuyển DNA lên màng lai • Lai DNA cố định với mẫu dị DNA có đánh dấu • Định vị phân tử lai DNA-mẫu dị • Lai DNA cố định màng với mẫu dò (probe) DNA có đánh dấu - Q trình dựa nguyên tắc bổ sung DNA màng lai với mẫu dò Để đánh giá người ta thường sử dụng P32, biotin/streptavidin vài mẫu dò phát quang sinh học 2.2.2 Phương pháp Nouthern blot    + RNA (RNA tổng số mRNA) phân tách điện di gel agarose + RNA sau phân tách chuyển lên màng lai (các phân tử RNA giữ nguyên vị trí gel) + RNA cố định màng lai với mẫu dò DNA sợi đơn (hoặc RNA)có đánh dấu phóng xạ gắn với enzyme tạo phân tử lai RNA-DNA RNA-RNA sợi kép +vị trí mẫu dị xác định phương pháp phóng xạ tự ghi đánh dấu phóng xạ Trong trường hợp mẫu dị gắn với enzyme đem ủ với chất khơng màu Enyme liên kết với sẻ biến đổi thành sản phẩm màu nhìn thấy phát ánh sáng mà phát phim X quang cách trực tiếp • 2.2.3 Phương pháp Western blot • Là phương pháp có độ nhạy cao dựa tính đặc hiệu kháng nguyên-kháng thể để phát protein điện di gel SDS-PAGE chuyển lên màng lai • Phương pháp cho phép xác định có mặt, trọng lượng phân tử, định lượng protein có mặt mẫu khác * Các bước thực hiện: • Protein phân tách điện di gel SDS-PAGE • Các pr chuyển sang màng lai nitrocellulose, giữ nguyên vị trí phân tách gel • Ủ màng lai với kháng thể sơ cấp • Tiếp tục ủ màng lai hỗn hợp phản ứng đặc hiệu với enzyme • Đặt phim nhạy cảm với tia X lên màng lai để phát điểm sáng phát enzyme • 2.2.4 Phương pháp Dot blot – Slot blot +Lai theo phương pháp Dot blo phương pháp sàng lọc nhanh thường thực với mẫu dò ASO để phân biệt khác alen vị trí nu • Phương pháp không cần điện di thạch mà thấm trực tiếp từ để xác định đoạn nu khác Quy trình thực kỹ thuật qua bước sau: + Bước 1: dung dịch ADN biến tính nhiệt độ hay dung dịch Kali để tách ADN sợi kép thành ADN sợi đ + Bước 2: Gắn ADN đích biến tính lên màng lai + Bước 3: đưa màng lai chứa ADN đích vào dung dịch chứa ADN dị + Bước 4: sau khoảng 20 – 24h ADN dò sẻ gắn vào ADN đích tạo thành chuổi kép + Bước 5: Rửa màng lai Để khơ tự nhiên sau phân tích tự chụp phóng xạ Ngồi cịn gắn ADN dị lên màng lai, ADN đích để dung dịch bước tương tự  Phương pháp lai chỗ (In Situ Hybridization) +Phương pháp lai chổ vừa phương pháp di truyền tế bào vừa phương pháp di truyền phân tử + Phương pháp thường dùng lai NST kì NST nhân tế bào gian kỳ với ADN dò đánh dấu đồng vị phóng xạ phóng xạ huỳnh quang + Quang sát có mặt đoạn ADN đích đoạn ADN lai tự chụp hình phóng xạ kính hiễn vi huỳnh quang + Bằng phương pháp chuỗi nhẹ kappa globulin miễn dịch xác định có locus nhánh ngắn NST số ...I CƠ SỞ KHOA HỌC SINH HỌC PHÂN TỬ VÀO XÉT NGHIỆM HUYẾT THỐNG II CÁC PHƯƠNG PHÁP ỨNG DỤNG SINH HỌC PHÂN TỬ VÀO XÉT NGHIỆM HUYẾT THỐNG PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG PHẢN ỨNG PCR PHƯƠNG PHÁP... Dựa vào nhiễm sắc thể Y Đàn ông truyền nhiễm sắc thể Y cho trai họ qua nhiều đời, xét nghiệm DNA huyết thống dựa vào nhiễm sắc thể Y theo dòng nội - Dựa vào nhiễm sắc thể X Dựa vào sở khoa học, ... PHÁP SỬ DỤNG PHẢN ỨNG PCR PHƯƠNG PHÁP GIẢI TRÌNH TỰ GEN PHƯƠNG PHÁP LAI PHÂN TỬ CƠ SỞ SINH HỌC PHÂN TỬ VÀO XÉT NGHIỆM HUYẾT THỐNG   Trong thể người chứa hàng tỷ tế bào Những tế bào hầu hết có nhân