Nghiên cứu xây dựng quy trình chẩn đoán Helicobacter Pylori bằng Nested PCR từ dịch dạ dày (Luận văn thạc sĩ)

Nghiên cứu xây dựng quy trình chẩn đoán Helicobacter Pylori bằng Nested PCR từ dịch dạ dày (Luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu xây dựng quy trình chẩn đoán Helicobacter Pylori bằng Nested PCR từ dịch dạ dày (Luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu xây dựng quy trình chẩn đoán Helicobacter Pylori bằng Nested PCR từ dịch dạ dày (Luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu xây dựng quy trình chẩn đoán Helicobacter Pylori bằng Nested PCR từ dịch dạ dày (Luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu xây dựng quy trình chẩn đoán Helicobacter Pylori bằng Nested PCR từ dịch dạ dày (Luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu xây dựng quy trình chẩn đoán Helicobacter Pylori bằng Nested PCR từ dịch dạ dày (Luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu xây dựng quy trình chẩn đoán Helicobacter Pylori bằng Nested PCR từ dịch dạ dày (Luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu xây dựng quy trình chẩn đoán Helicobacter Pylori bằng Nested PCR từ dịch dạ dày (Luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu xây dựng quy trình chẩn đoán Helicobacter Pylori bằng Nested PCR từ dịch dạ dày (Luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu xây dựng quy trình chẩn đoán Helicobacter Pylori bằng Nested PCR từ dịch dạ dày (Luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu xây dựng quy trình chẩn đoán Helicobacter Pylori bằng Nested PCR từ dịch dạ dày (Luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu xây dựng quy trình chẩn đoán Helicobacter Pylori bằng Nested PCR từ dịch dạ dày (Luận văn thạc sĩ)

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TRẦN NGỌC ANH NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHẨN ĐỐN HELICOBACTER PYLORI BẰNG NESTED PCR TỪ DỊCH DẠ DÀY LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG THÁI NGUYÊN - 2019 Số hóa Trung tâm Học liệu Cơng nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn ii ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TRẦN NGỌC ANH NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHẨN ĐỐN HELICOBACTER PYLORI BẰNG NESTED PCR TỪ DỊCH DẠ DÀY Ngành: Công nghệ Sinh học Mã số: 84 20 201 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG Người hướng dẫn khoa học: TS NGUYỄN PHÚ HÙNG THÁI NGUYÊN - 2019 Số hóa Trung tâm Học liệu Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan số liệu kết trình bày luận văn trung thực chưa công bố cơng trình Mọi kết thu không chỉnh sửa, chép từ nghiên cứu khác Mọi trích dẫn luận văn ghi rõ nguồn gốc Tác giả Trần Ngọc Anh Số hóa Trung tâm Học liệu Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn ii LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới: Ban Giám hiệu, phòng Đào tạo, trường Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên Các thầy cô cán Khoa Công nghệ Sinh học tận tình dạy dỗ, truyền dạy kiến thức kinh nghiệm nghiên cứu khoa học cho chúng em năm qua Em xin chân thành cảm ơn thầy giáo TS Nguyễn Phú Hùng, người thầy định hướng nghiên cứu tận tình hướng dẫn, bảo cho em suốt thời gian em thực hồn thành luận văn Trong suốt q trình thực đề tài, em nhận nhiều quan tâm giúp đỡ từ gia đình, bạn bè, đồng nghiệp anh, chị nhóm nghiên cứu, người ln động viên, khích lệ em, tạo cho em động lực niềm say mê nghiên cứu khoa học Em vơ biết ơn tất tình cảm tốt đẹp mà người dành cho em Thái Nguyên, tháng 11 năm 2019 Tác giả Trần Ngọc Anh Số hóa Trung tâm Học liệu Cơng nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i MỤC LỤC III DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT V DANH MỤC CÁC BẢNG VI DANH MỤC CÁC HÌNH VII MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề Mục tiêu nghiên cứu Nội dung nghiên cứu gồm CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Vi khuẩn Helicobacter pylori 1.1.1 Lịch sử nghiên cứu H pylori 1.1.2 Đặc điểm hình thái học H pylori 1.1.3 Cơ chế gây bệnh H pylori 1.2 Gen mã hoá CagA (cytotoxine associated gene A) 1.3 Các phương pháp chẩn đoán vi khuẩn H pylori 1.3.1 Các xét nghiệm xâm hại qua nội soi dày tá tràng (invasive test) 1.3.2 Các thử nghiệm không xâm lấn 19 1.4 Nested PCR chẩn đoán H pylori 23 1.4.1 Khái niệm Nested PCR 23 1.4.2 Ứng dụng Nested PCR chẩn đoán H pylori 24 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 2.1 Vật liệu nghiên cứu 26 2.1.1 Mẫu bệnh phẩm 26 2.1.2 Hóa chất, dụng cụ thiết bị 26 2.2 Địa điểm thời gian 27 Số hóa Trung tâm Học liệu Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn iv 2.3 Phương pháp nghiên cứu 27 2.3.1 Phương pháp thu nhận mẫu bệnh phẩm dịch dày 27 2.3.2 Phương pháp tách chiết DNA tổng số từ mẫu bệnh phẩm 27 2.3.3 Phương pháp tách chiết DNA tổng số từ mẫu chủng vi khuẩn 28 2.3.4 Phương pháp đo DNA tổng số 29 2.3.5 Phương pháp Nested PCR 29 2.3.6 Phương pháp điện di DNA gel agarose 33 2.3.7 Phương pháp xử lý số liệu 34 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 35 3.1 Kết tách DNA từ chủng vi khuẩn Helicobacter pylori dịch dày 35 3.2 Khuếch đại DNA đặc trưng genome H pylori kỹ thuật Nested PCR 36 3.3 Xác định độ nhạy kỹ thuật Nested PCR phát H pylori 38 3.3 Xác định gen CagA vi khuẩn H pylori Nested PCR 39 3.4 Áp dụng kỹ thuật Nested PCR để đánh giá mức độ nhiễm H pylori chủng H pylori mang gen CagA mẫu bệnh phẩm 41 3.5 Xây dựng quy trình chẩn đốn mức độ phịng thí nghiệm 44 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO 47 Số hóa Trung tâm Học liệu Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn v DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Campylobacter Like Organism test Clotest Cytotoxine associated gen A CagA Deoxyribonucleic acid DNA Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay ELISA Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay ELISA Heptose - bisphosphate HBP Immuno Globulin A IgA Immuno Globulin G IgG Immuno Globulin M IgM Nuclear factor kappa B NFkB Pathogenicity island PAI Ribonucleic acid RNA Urea Breath Test UBT Vacuolating toxin gene A VacA Số hóa Trung tâm Học liệu Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn vi DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Các cặp mồi sử dụng cho phản ứng Nested PCR 31 Bảng 2.2 Thành phần phản ứng PCR vòng 31 Bảng 2.3 Thành phần phản ứng cho vòng 31 Bảng 2.4 Chu kì nhiệt cho vòng phản ứng Nested- PCR 32 Bảng 2.5 Các cặp mồi sử dụng cho phản ứng Nested PCR phát gen CagA 32 Bảng 2.6 Thành phần phản ứng PCR cho vòng 33 Bảng 2.7 Chu kì nhiệt cho vịng phản ứng Nested- PCR 33 Bảng 3.1 Nồng độ DNA tổng số tách chiết từ mẫu bệnh phẩm chủng H pylori đối chứng 35 Bảng 3.2 Kết phân tích từ mẫu bệnh phẩm bệnh nhân 41 Số hóa Trung tâm Học liệu Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn vii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Vi khuẩn H pylori Hình 1.2 Mẫu thử Clotest Hình 1.3 Vi khuẩn H pylori đĩa ni cấy phân lập 11 Hình 1.4 Viêm dày lympho 14 Hình 1.5 Viêm dày hạt 16 Hình 1.6 Nguyên lý test thở 13C 14C 20 Hình 1.7 Nested PCR 24 Hình 3.1 Kết tách chiết DNA tổng số 35 Hình 3.2 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR vòng khuếch đại DNA đặc trưng vi khuẩn H pylori 37 Hình 3.3 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR vòng khuếch đại DNA đặc trưng vi khuẩn H.pylori 37 Hình 3.4 Độ nhạy phản ứng Nested PCR khuếch đại đoạn DNA đặc trưng genome H pylori 38 Hình 3.5 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR gen CagA vịng 39 Hình 3.6 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR gen CagA vòng .40 Hình 3.7 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR khuếch đại DNA đặc trưng vi khuẩn H pylori 40 Hình 3.8 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR khuếch đại DNA đặc trưng vi khuẩn H pylori 40 Hình 3.9 Quy trình chẩn đốn H pylori phương pháp Nested PCR áp dụng cho phịng thí nghiệm 45 Số hóa Trung tâm Học liệu Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Helicobacter pylori (H pylori) vi khuẩn thường gặp gây nhiễm trùng đường tiêu hóa Sự phát H pylori Marshall Warren năm 1882 mở kỉ nguyên điều trị bệnh lý dày tá tràng H pylori xem nguyên nhân gây viêm, loét dày lứa tuổi Theo thống kê Tổ chức Y tế giới, 50% dân số bị nhiễm loại vi khuẩn [46] Tỷ lệ nhiễm H pylori giảm vùng châu Á - Thái Bình Dương, Việt Nam tỷ lệ nhiễm vi khuẩn cao [2] Tỷ lệ nhiễm H pylori trẻ em bị viêm dày 70% bệnh nhân loét hành tá tràng 90% [3] Ở Việt Nam chưa có theo dõi quy mơ, tồn diện, chủ yếu số liệu thống kê dựa nghiên cứu rải rác cộng đồng nhỏ Có nhiều phương pháp để giúp cho chẩn đốn nhiễm H pylori dựa theo điều kiện cụ thể sở y tế Các phương pháp chẩn đoán có tính xâm lấn thơng qua nội soi gồm thử nghiệm urease, nuôi cấy vi khuẩn, xác định acid nhân vi khuẩn, chẩn đốn mơ bệnh học, phản ứng chuỗi PCR Các phương pháp không xâm lấn bao gồm: Nghiệm pháp thở C13 C14, chẩn đoán huyết thanh, test nhanh huyết thanh, test huyết phát kháng thể kháng CagA, tìm kháng thể kháng H pylori nước tiểu, Immunoblot, dùng PCR chẩn đoán H pylori phân, phát kháng nguyên phân Mỗi phương pháp cho ưu nhược điểm riêng Hiện nay, PCR kỹ thuật chẩn đoán tiên tiến chưa phổ biến rộng rãi Việt Nam chẩn đốn nhiễm H pylori Ngồi việc chẩn đốn nhiễm H pylori trước điều trị, PCR dùng để theo dõi sau điều trị tiệt trừ H pylori Số hóa Trung tâm Học liệu Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn 38 đặc hiệu bắt cặp cặp mồi thứ hai với đoạn DNA nhân lên phản ứng PCR thứ nhất, cho phép phát mẫu có lượng DNA thấp so với PCR truyền thống mẫu bệnh phẩm Đó sở để giải thích việc PCR vịng (tương đương với PCR thơng thường) chưa thấy xuất sản phẩm đặc hiệu PCR lần cho phép khuếch đại đoạn DNA đặc hiệu từ khn sản phẩm PCR vịng 3.3 Xác định độ nhạy kỹ thuật Nested PCR phát H pylori Hình 3.4 Độ nhạy phản ứng Nested PCR khuếch đại đoạn DNA đặc trưng genome H pylori A) Điện di sản phẩm PCR vòng 1, B) Điện di sản phẩm PCR vòng M: Marker 100bp, giếng 1, 2, 3, tương đương với nồng độ: 10fg/µl; 0,1ng/µl; 1ng/µl 10ng/µl Tổng thể tích phản ứng 50 µl Để xác định độ nhạy phản ứng Nested PCR, từ mẫu DNA dương tính với H pylori xác định mục 3.2, chúng tơi tiến hành pha lỗng DNA ban đầu theo nồng độ 10fg/µl; 0,1ng/µl; 1ng/µl 10ng/µl phản ứng PCR thực điều kiện thể tích, chu kỳ phản ứng Kết điện di sản phẩm PCR vịng cho thấy (hình 3.4A), tất giếng từ - không khuếch đại đoạn DNA đặc hiệu genome H pylori Như thấy rằng, dù tăng lượng DNA ban đầu lên đến 10ng/µl tương ứng với 50ng/phản ứng chưa đủ hàm lượng DNA khuôn để khuếch đại đoạn DNA đặc hiệu genome H pylori Cùng với kết chạy PCR vịng mục 3.2, khẳng định lượng DNA thực vi khuẩn H pylori có DNA tổng số thu từ dịch dày thấp Từ kết sản phẩm PCR vòng 1, DNA thu tiếp tục pha lỗng theo nồng độ 10fg/µl; 0,1ng/µl; 1ng/µl 10ng/µl để tiến hành khuếch đại đoạn DNA genome phản ứng PCR vòng với cặp mồi HpF2/HpR2 Kết điện di hình 3.4B cho thấy nồng độ 0,1ng/µl DNA (sản phẩm PCR Số hóa Trung tâm Học liệu Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn 39 vịng 1) đến 10 ng/µl cho sản phẩm phẩm khuếch đại đoạn DNA đặc hiệu, kích thước 200 bp Ở ngưỡng nồng độ thấp (10fg/µl), phản ứng PCR vịng khơng thể khuếch đại đoạn DNA genome H pylori Như vậy, nói ngưỡng phát phản ứng Nested PCR nghiên cứu từ 0,1ng/µl Cũng kỹ thuật Nested PCR cặp mồi này, Gilali cộng phát 11 mẫu sản phẩm từ thịt bị nhiễm H pylori tổng số 150 mẫu kiểm tra [20] 3.3 Xác định gen CagA vi khuẩn H pylori Nested PCR Tiếp theo việc phát H pylori, tiếp tục xác định có hay khơng gen CagA mẫu bệnh phẩm dịch dày Để thực điều này, tiến hành phản ứng Nested PCR để khuếch đại đoạn gen CagA Hình 3.5 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR gen CagA vòng Các giếng từ tương ứng với chủng 1,2,3 M: Marker 1kb, ĐC+: Đối chứng dương Kết trình bày hình 3.5 cho thấy, với cặp mồi thứ (PCR vịng 1), có mẫu đối chứng có đoạn DNA khuếch đại với kích thước xấp xỉ 430bp theo tính tốn lý thuyết Từ kết PCR vòng 1, sản phẩm PCR mẫu bệnh phẩm 1,2,3 đối chứng pha loãng nồng độ 1ng/µl tiến hành PCR vịng với cặp mồi CagAF2/CagAR2 Kết điện di sản phẩm PCR vòng trình bày hình 3.6 Hình 3.6 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR gen CagA vòng M: Marker 1kb Các giếng từ -3 mẫu bệnh phẩm Số hóa Trung tâm Học liệu Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn 40 Từ kết điện di hình 3.6 cho thấy rằng, mẫu bệnh phẩm đối chứng cho kết dương tính với gen CagA Hình 3.7 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR khuếch đại DNA đặc trưng vi khuẩn H pylori (vòng 2) từ số mẫu bệnh phẩm M: Marker 100bp; 23 – 29: số mẫu bệnh phẩm Kết hình 3.7 điện di sản phẩm PCR khuếch đại DNA đặc trưng vi khuẩn H pylori (vòng 2) mẫu bệnh phẩm 23 đến mẫu bệnh phẩm 29 cho thấy có mẫu bệnh số 24, 29 âm tính với gen CagA, mẫu cịn lại cho kết dương tính với gen CagA Tương tự với hình 3.8, hình ảnh điện di sản phẩm PCR khuếch đại DNA đặc trưng vi khuẩn H pylori (vòng 2) mẫu bệnh phẩm đến mẫu dương tính với CagA, mẫu số âm tính Kết cho thấy phản ứng Nested PCR khuếch đại cách hiệu gen CagA mẫu bệnh phẩm dịch dày Hình 3.8 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR khuếch đại DNA đặc trưng vi khuẩn H pylori (vòng 2) từ số mẫu bệnh phẩm M: Marker 1kb Báo cáo trước Hirai sử dụng cặp mồi để phát chủng dương tính với gen CagA mẫu phân [26] Tương tự vậy, kỹ thuật Nested PCR với độ nhạy cao, nghiên cứu sử dụng để chẩn đoán chủng H pylori mang gen CagA mẫu bệnh phẩm gồm mẫu sinh thiết dày, mẫu nước tiểu [48] Số hóa Trung tâm Học liệu Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn 41 3.4 Áp dụng kỹ thuật Nested PCR để đánh giá mức độ nhiễm H pylori chủng H pylori mang gen CagA mẫu bệnh phẩm Từ kết nghiên cứu trình bày phần nêu trên, tiến hành áp dụng Nested PCR vào việc phân tích 35 mẫu bệnh phẩm dịch dày thu nhận từ trình nội soi bệnh viện Đại học Y Dược Thái Nguyên Sau tiến hành so sánh với kết nhuộm soi từ bệnh viện Kết phân tích trình bảng 3.2 Bảng 3.2 Kết phân tích từ mẫu bệnh phẩm bệnh nhân TT Mã BN Tuổi Kết H pylori Dương tính Âm tính Kết CagA Dương tính BN1 65 v v BN2 29 v v BN3 38 v v BN4 52 v v BN5 56 v BN6 37 v BN7 BN8 BN9 v v 67 v v 38 v v 10 BN10 40 v v 11 BN11 43 v v 12 BN12 61 v v 13 BN13 52 14 BN14 30 v v 15 BN15 26 v v Âm tính v Số hóa Trung tâm Học liệu Cơng nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn 42 TT Mã BN Tuổi Kết H pylori Dương tính Âm tính Kết CagA Dương tính 16 BN16 61 v 17 BN17 13 v 18 BN18 33 v v 19 BN19 72 v v 20 BN20 25 v v 21 BN21 56 v 22 BN22 45 v v 23 BN23 28 v v 24 BN24 38 25 BN25 33 v v 26 BN26 54 v v 27 BN27 63 v v 28 BN28 57 v v 29 BN29 51 30 BN30 54 v v 31 BN31 51 v v 32 BN32 29 v v 33 BN33 65 v v 34 BN34 70 v v 35 BN35 61 v Âm tính v v v v v v Tổng 30 27 Phần trăm 85,7% 14,3% 90% 10% Ghi Tính tổng số mẫu dương tính với H pylori Số hóa Trung tâm Học liệu Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn 43 Kết phân tích 35 bệnh nhân lấy mẫu dịch dày qua nội soi cho thấy, tỷ lệ bệnh nhân dương tính với vi khuẩn H pylori chiếm 85,7%, tỷ lệ âm tính chiếm 14,3% Nhiều nghiên cứu có mối liên quan rõ rệt mức độ nhiễm H pylori mức độ tổn thương mô bệnh học, nhiễm H pylori nặng tổn thương viêm nặng mức độ hoạt động viêm mạnh đặc biệt bệnh lý dày tá tràng gây nên chủng CagA(+) Khi tải lượng vi khuẩn cao liên quan có ý nghĩa đến tăng tổn thương cấp tính tăng sinh niêm mạc biểu mô kéo dài thay đổi đáp ứng hàng rào bảo vệ dẫn đến loét loạn sản niêm mạc dày [52] Realtime-PCR sử dụng thông thường để định lượng DNA H pylori mẫu sinh thiết, Realtime-PCR khơng nhạy cảm Nested PCR thường dựa dụng cụ thương mại, đắt đặc biệt hai gen nhắm mục tiêu Phương pháp PCR vịng đơn thơng thường để phát H pylori đặc biệt sau điều trị tiệt trừ phát mầm bệnh thực Nested PCR phương pháp trước tương đối việc phát số lượng thấp Do đó, Nested PCR đề xuất theo tiêu chuẩn vàng với điều kiện PCR quan tâm Nested PCR thực Mishra cộng báo cáo 62,5% bệnh nhân dương tính với H pylori nhắm mục tiêu gen Hsp60 [39] Nested PCR nhắm mục tiêu gen Hsp60 dường phương pháp thay tốt phương pháp khơng xâm lấn để phát nhiễm H pylori mẫu phân xét nghiệm xâm lấn nội soi không khả thi Một số nghiên cứu thực để chẩn đoán H pylori nhắm mục tiêu 16S rRNA, kháng nguyên 26-kDa, Hsp60, ureA, glmM, VacA gen CagA Sự phát triển thử nghiệm thương mại để phát H pylori chắn cung cấp phương pháp chẩn đốn xác thuận tiện Nghiên cứu Nguyễn Văn Số hóa Trung tâm Học liệu Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn 44 Ngoan nhiễm H pylori mức độ nhẹ chiếm 44,3%, vừa 32,9% nặng 23,1% [4] Theo Nguyễn Thị Việt Hà nghiên cứu 143 trẻ viêm dày có nhiễm H pylori, có 11,2% bệnh nhân có nhiễm H pylori (+++), 31,5% bệnh nhân nhiễm H pylori (++) 57,3% nhiễm H pylori (+) [1] Theo Nguyễn Hoài Chân cộng sự, tỉ lệ bệnh nhân nhiễm H pylori (++) chiếm tỉ lệ cao 55,1%, nhiễm H pylori (+) chiếm 20,5% 24,4% bệnh nhân nhiễm H pylori (+++) [5] Tỷ lệ mang gen CagA chiếm 90%, tỷ lệ âm tính chiếm 10% Gần đây, số nghiên cứu khác Việt Nam cho thấy gen CagA có tỷ lệ từ 71- 92% người bị nhiễm H pylori [2] Tỷ lệ CagA(+) bệnh nhân ung thư dày Kumar S, Kumar A, Trần Ngọc Ánh 100%; 80,9% [1] Tỷ lệ vi khuẩn mang gen CagA H pylori báo cáo từ vùng khác giới từ 50 - 70% nước châu Âu chiếm > 90% châu Á [5] 3.5 Xây dựng quy trình chẩn đốn mức độ phịng thí nghiệm Quy trình thực phản ứng Nested PCR áp dụng chẩn đốn mức phịng thí nghiệm Bước đầu chúng tơi ứng dụng thành công kỹ thuật để chẩn đoán 35 mẫu bệnh phẩm dịch dày bệnh nhân Trên sở đó, chúng tơi đề xuất quy trình chung để chẩn đốn cho mẫu bệnh phẩm dịch dày mức độ phịng thí nghiệm gồm bước sau: - Bước 1: Thu nhận mẫu bệnh phẩm đưa phòng xét nghiệm - Bước 2: Ly tâm thu cặn tế bào Tách chiết DNA trực tiếp bệnh phẩm bệnh nhân theo quy trình hướng dẫn nhà sản xuất Qiagen - Bước 3: Đo DNA mát quang phổ Nanodrop - Bước 4: Với mẫu bệnh phẩm, tiến hành kiểm tra chạy vòng PCR với thành phần phản ứng chu trình nhiệt - Bước 5: Điện di kiểm tra gel agarose 1,5% với marker Đọc kết máy phát tia UV Dựa kết điện di thu được, tiến hành phân Số hóa Trung tâm Học liệu Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn 45 tích băng DNA xuất để xác định xem mẫu bệnh phẩm có dương tính với vi khuẩn H pylori hay khơng, dương tính có mang gen CagA hay khơng Tồn quy trình chẩn đốn thực sơ đồ hóa sau: Lấy mẫu bệnh phẩm dịch dày thông qua nội soi từ bệnh nhân Ly tâm thu cặn tế bào, Tách chiết DNA kit Qiagen mini kit Đo DNA máy quang phổ Nanodrop PCR lần (cho đoạn DNA đặc trưng H pylori gen CagA) PCR lần (cho đoạn DNA đặc trưng H pylori gen CagA) Điện di kiểm tra gel agarose 2% Phân tích kết điện di đưa kết luận Hình 3.9 Quy trình chẩn đoán H pylori phương pháp Nested PCR áp dụng cho phịng thí nghiệm Số hóa Trung tâm Học liệu Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn 46 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Đã tách chiết DNA tổng số từ mẫu bệnh phẩm từ chủng đối chứng, đó, mẫu bệnh phẩm thu hàm lượng DNA thấp, độ tinh thấp (tỷ số 260/280 từ 0,87-0,94) Đã xác định có mặt vi khuẩn H pylori mẫu bệnh phẩm phản ứng Nested-PCR Đã xác định có mặt gen CagA mẫu vi khuẩn H.pylori dương tính mẫu bệnh phẩm Nested PCR Phân tích 35 mẫu bệnh phẩm tỷ lệ dương tính với H pylori 85,7%, tỷ lệ dương tính với gen CagA 90% Thiết lập quy trình (sơ đồ) chẩn đoán H pylori kỹ thuật Nested PCR Đối với phương pháp Nested PCR xác định sớm vi khuẩn H pylori với lượng vi khuẩn nhỏ Kiến nghị Ứng dụng kỹ thuật chẩn đoán vi khuẩn H pylori kỹ thuật Nested PCR từ dịch dày Số hóa Trung tâm Học liệu Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Nguyễn Thị Việt Hà (2013), "Tìm hiểu mối liên quan số lượng vi khuẩn với biểu lâm sàng, nội soi mô bệnh học bệnh nhân viêm, loét dày tá tràng Helicobacter pylori.", Tạp chí y học thực hành 2, pp 89-92 Vũ Minh Hồn, Nguyễn Trọng Thơng Vũ Thị Ngọc Thanh (2012), "Nghiên cứu độc tính cấp ảnh hưởng cao Vị quản khang thể trạng hệ thống tạo máu động vật thực nghiệm", Tạp chí Y học thực hành 8(838), p 10 Nguyễn Gia Khánh Nguyễn Văn Bàng (2009), "Nhiễm Helicobacter pylori trẻ em, lâm sàng điều trị", Nhà xuất y học, pp 128-155 Nguyễn Văn Ngoan (2004), "Nghiên cứu đặc điểm lâm sàng, nội soi, mô bệnh học kết điều trị viêm dày mạn tính có nhiễm Helicobacter pylori trẻ em", Luận án tiến sỹ y học, Đại học Y Hà Nội, Hà Nội Nguyễn Hoài Chân, Nguyễn Gia Khánh, Phạm Thị Thu Hương (2012), "Nghiên cứu số đặc điểm nội soi tổn thương mô bệnh học trẻ em đau bụng tái diễn có hội chứng dày - tá tràng", Tạp chí Nhi khoa 5(3), pp 20-25 Tài liệu tiếng Anh Abe T et al (2011), "Impact of Helicobacter pylori CagA diversity on gastric mucosal damage: an immunohistochemical study of East-Asiantype CagA", J Gastroenterol Hepatol 26(4), pp 688-93 Backert S and Tegtmeyer N (2017), "Type IV Secretion and Signal Transduction of Helicobacter pylori CagA through Interactions with Host Cell Receptors", Toxins (Basel) 9(4) Bhatti T R et al (2011), "Lymphocytic gastritis in pediatric celiac disease", Pediatr Dev Pathol 14(4), pp 280-3 Số hóa Trung tâm Học liệu Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn 48 Carmack Sw et al (2009), "Lymphocytic disorders of the gastrointestinal tract: a review for the practicing pathologist", Adv Anat Pathol 16(5), pp 290-306 doi 10.1097/PAP.0b013e3181b5073a 10 Delgado J S, Landa E, and Ben-Dor D (2013), "Granulomatous gastritis and Helicobacter pylori infection", Isr Med Assoc J 15(6), pp 317-8 11 Digestives, Infections J Gut (2002), "Risk factors for atrophic chronic gastritis in a European population: results of the Eurohepygast study" 50, pp 779-785 12 Dolak Werner et al (2017), "A multicenter prospective study on the diagnostic performance of a new liquid rapid urease test for the diagnosis of Helicobacter pylori infection", Gut Pathogens 9, p 78 13 Drumm Brendan et al (2000), "Helicobacter pylori infection in children: a consensus statement", Journal of pediatric gastroenterology and nutrition 30(2), pp 207-213 14 Du Y et al (2006), "Helicobacter pylori and Schistosoma japonicum coinfection in a Chinese population: helminth infection alters humoral responses to H pylori and serum pepsinogen I/II ratio", Microbes Infect 8(1), pp 52-60 15 El Demellawy D, Otero C, and Radhi J (2009), "Primary gastric lymphoma with florid granulomatous reaction", J Gastrointestin Liver Dis 18(1), pp 99-101 16 Elitsur Yoram et al (2008), "Does Helicobacter pylori protect children from reflux disease?", Journal of clinical gastroenterology 42(2), pp 215-216 17 Fox J G et al (2007), "Accelerated progression of gastritis to dysplasia in the pyloric antrum of TFF2 -/- C57BL6 x Sv129 Helicobacter pyloriinfected mice", Am J Pathol 171(5), pp 1520-8 18 Fuentebella J et al (2009), "Abdominal pain, gastrointestinal bleeding, and weight loss in a 17-year-old male", Dig Dis Sci 54(4), pp 722-4 19 Gall A et al (2017), "TIFA Signaling in Gastric Epithelial Cells Initiates the cag Type Secretion System - Dependent Innate Immune Response to Helicobacter pylori Infection", MBio 8(4) Số hóa Trung tâm Học liệu Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn 49 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 Gilani Ali et al (2017), "VacA and CagA genotypes status and antimicrobial resistance properties of Helicobacter pylori strains isolated from meat products in Isfahan province, Iran" 18(2), p 97 Goodwin CS and Armstrong JA (1990), "Microbiological aspects of Helicobacter pylori (Campylobacter pylori)", European Journal of Clinical Microbiology and Infectious Diseases 9(1), pp 1-13 Han S H, Joo M, and Kim K M (2013), "High proportion of granzyme B+ intraepithelial lymphocytes contributes to epithelial apoptosis in Helicobacter pylori - associated lymphocytic gastritis", Helicobacter 18(4), pp 290-8 Haot J et al (1990), "Lymphocytic gastritis prospective study of its relationship with varioliform gastritis", Gut 31(3), pp 282-5 Hatakeyama Masanori (2017), "Structure and function of Helicobacter pylori CagA, the first-identified bacterial protein involved in human cancer", Proceedings of the Japan Academy Series B, Physical and Biological Sciences 93(4), pp 196-219 Hayashi T et al (2017), "Differential Mechanisms for SHP2 Binding and Activation Are Exploited by Geographically Distinct Helicobacter pylori CagA Oncoproteins", Cell Rep 20(12), pp 2876-2890 Hirai Itaru et al (2009), "A method for assessment of Helicobacter pylori genotype using stool specimens" 56(1), pp 63-66 Inagaki-Ohara K et al (1997), "Potential for involvement of Fas antigen/Fas ligand interaction in apoptosis of epithelial cells by intraepithelial lymphocytes in murine small intestine", Lab Invest 77(5), pp 421-9 Ismail Hawazen et al (2016), "A newly developed nested PCR assay for the detection of Helicobacter pylori in the oral cavity" 50(1), pp 17-22 Ji Rui et al (2010), "Confocal laser endomicroscopy for diagnosis of Helicobacter pylori infection: a prospective study", Journal of gastroenterology and hepatology 25(4), pp 700-705 Số hóa Trung tâm Học liệu Cơng nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn 50 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 Joo Mee (2017), "Rare Gastric Lesions Associated with Helicobacter pylori Infection: A Histopathological Review", Journal of pathology and translational medicine 51(4), pp 341-351 Kim Y S et al (2009), "A Case of H pylori - associated Granulomatous Gastritis with Hypertrophic Gastropathy", Gut Liver 3(2), pp 137-40 Konturek JW (2003), "Discovery by Jaworski of Helicobacter pylori and its pathogenetic role in peptic ulcer, gastritis and gastric cancer", Journal of physiology and pharmacology 54(S3), pp 23-41 Koyama S and Nagashima F (2003), "Idiopathic granulomatous gastritis with multiple aphthoid ulcers", Intern Med 42(8), pp 691-5 Link Alexander et al (2017), "Helicobacter pylori VacA genotype is a predominant determinant of immune response to Helicobacter pylori CagA", World Journal of Gastroenterology 23(26), pp 4712-4723 Marshall Barry J and Warren J Robin (1984), "Unidentified curved bacilli in the stomach of patients with gastritis and peptic ulceration", The Lancet 323(8390), pp 1311-1315 Mishra Shrutkirti et al (2008), "Detection of Helicobacter pylori in stool specimens: comparative evaluation of nested PCR and antigen detection" 2(03), pp 206-210 Nagase L et al (2015), "Dramatic increase in SHP2 binding activity of Helicobacter pylori Western CagA by EPIYA-C duplication: its implications in gastric carcinogenesis", Sci Rep 5, p 15749 Negash Markos et al (2018), "Evaluation of SD BIOLINE H pylori Ag rapid test against double ELISA with SD H pylori Ag ELISA and EZSTEP H pylori Ag ELISA tests", BMC Clinical Pathology 18, p Nielsen J A et al (2014), "Lymphocytic gastritis is not associated with active Helicobacter pylori infection", Helicobacter 19(5), pp 349-55 Nishikawa H and Hatakeyama M (2017), "Sequence Polymorphism and Intrinsic Structural Disorder as Related to Pathobiological Performance of the Helicobacter pylori CagA Oncoprotein", Toxins (Basel) 9(4) Số hóa Trung tâm Học liệu Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn 51 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 Nomura A M et al (2002), "Helicobacter pylori CagA seropositivity and gastric carcinoma risk in a Japanese American population", J Infect Dis 186(8), pp 1138-44 Oberhuber G et al (1998), "High proportion of granzyme B-positive (activated) intraepithelial and lamina propria lymphocytes in lymphocytic gastritis", Am J Surg Pathol 22(4), pp 450-8 Oberhuber G et al (1996), "Evidence that intestinal intraepithelial lymphocytes are activated cytotoxic T cells in celiac disease but not in giardiasis", Am J Pathol 148(5), pp 1351-7 Ohnishi N et al (2008), "Transgenic expression of Helicobacter pylori CagA induces gastrointestinal and hematopoietic neoplasms in mouse", Proc Natl Acad Sci U S A 105(3), pp 1003-8 Olbermann P et al (2010), "A global overview of the genetic and functional diversity in the Helicobacter pylori cag pathogenicity island", PLoS Genet 6(8), p e1001069 Pajares Javier P Gisbert and José María (2005), "Helicobacter pylori Rescue Therapy After Failure of Two Eradication Treatments", HELICOBACTER 5(10), pp 363-372 Palli D et al (2007), "CagA+ Helicobacter pylori infection and gastric cancer risk in the EPIC-EURGAST study", Int J Cancer 120(4), pp 859-67 Paniagua Gloria Luz et al (2009), "Frequency of vacA, cagA and babA2 virulence markers in Helicobacter pylori strains isolated from Mexican patients with chronic gastritis" 8(1), p 14 Pellicano R et al (2005), "How accurate is the culture of Helicobacter pylori in a clinical setting? An appraisal", Panminerva medica 47(3), pp 191-194 Shiota S, Suzuki R, and Yamaoka Y (2013), "The significance of virulence factors in Helicobacter pylori", J Dig Dis 14(7), pp 341-9 Stein S C et al (2017), "Helicobacter pylori modulates host cell responses by CagT4SS-dependent translocation of an intermediate Số hóa Trung tâm Học liệu Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn 52 52 53 54 55 56 57 metabolite of LPS inner core heptose biosynthesis", PLoS Pathog 13(7), p e1006514 Varbanova M and Malfertheiner P (2011), "Bacterial load and degree of gastric mucosal inflammation in Helicobacter pylori infection", Dig Dis 29(6), pp 592-599 Viala J et al (2004), "Nod1 responds to peptidoglycan delivered by the Helicobacter pylori cag pathogenicity island", Nat Immunol 5(11), pp 1166-74 Vilaichone R K et al (2004), "Molecular epidemiology and outcome of Helicobacter pylori infection in Thailand: a cultural cross roads", Helicobacter 9(5), pp 453-9 Wongphutorn Phattharaphon et al (2018), "Detection and genotyping of Helicobacter pylori in saliva versus stool samples from asymptomatic individuals in Northeastern Thailand reveals intra-host tissue-specific H pylori subtypes" 18(1), p 10 Yamane T et al (2010), "Isolated granulomatous gastritis showing discoloration of lesions after Helicobacter pylori eradication", Dig Endosc 22(2), pp 140-3 Yee J K C (2017), "Are the view of Helicobacter pylori colonized in the oral cavity an illusion?", Experimental & Molecular Medicine 49(11), p e397 Số hóa Trung tâm Học liệu Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn ... HỌC KHOA HỌC TRẦN NGỌC ANH NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN HELICOBACTER PYLORI BẰNG NESTED PCR TỪ DỊCH DẠ DÀY Ngành: Công nghệ Sinh học Mã số: 84 20 201 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG... pylori từ mẫu bệnh phẩm thấp nhiều so với dày Trong nghiên cứu hướng tới việc xây dựng quy trình chẩn đốn H pylori Nested PCR từ dịch dày nhằm giảm tính xâm lấn so với phương pháp phân tích từ. .. khuẩn H pylori phản ứng Nested PCR Nội dung 4: Đánh giá tỷ lệ dương tính với vi khuẩn H pylori gen CagA từ mẫu bệnh phẩm Nested PCR Nội dung 5: Xây dựng quy trình chẩn đốn H pylori Nested PCR Số