PHÂN LẬP VÀ NHÂN DIỆN VI KHUẨN STAPHYLOCOCCUS TRONG MẪU THỰC PHẨM THỊT HEO

CHỦ ĐỀ: PHÂN LẬP VÀ NHÂN DIỆN VI KHUẨN STAPHYLOCOCCUS TRONG MẪU THỰC PHẨM THỊT HEOLỜI MỞ ĐẦUI.TỔNG QUAN VỀ VI KHUẨN STAPHYLOCOCCUS AUREUSII.PHÂN LẬP VI SINH VẬT:1.CHỌN MẪU THỰC PHẨM PHÂN LẬP, VÀ TĂNG SINH VI SINH VẬT.A.MẪU THỰC PHẨM ĐỂ PHÂN LẬP: THỊT HEOB.TĂNG SINH VI SINH VẬT:2.PHƯƠNG PHÁP PHÂN LẬP VÀ MÔI TRƯỜNG PHÂN LẬP.A.MÔI TRƯỜNG PHÂN LẬP: B.PHƯƠNG PHÁP PHÂN LẬP:III.NHẬN DIỆN VSV:1.ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI, CẤU TRÚC:2.ĐẶC ĐIỂM SINH TRƯỞNG VÀ PHÁT TRIỂN3.PHÂN BỐ:4.ĐẶC ĐIỂM SINH HÓA:IV.Ý NGHĨA SỰ HIỆN DIỆN CỦA STAPHYLOCOCCUS AREUS TRONG MẪU THỰC PHẨM THỊT HEO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG BỘ MÔN VI SINH VẬT THỰC PHẨM BÀI BÁO CÁO Chủ Đề: Phân lập nhận diện vi khuẩn Staphylococcus aureus mẫu thực phẩm Nha Trang, ngày 13 tháng năm 20 Mục lục LỜI MỞ ĐẦU .2 I TỔNG QUAN VỀ VI KHUẨN STAPHYLOCOCCUS AUREUS II PHÂN LẬP VI SINH VẬT: A B A B CHỌN MẪU THỰC PHẨM PHÂN LẬP, VÀ TĂNG SINH VI SINH VẬT MẪU THỰC PHẨM ĐỂ PHÂN LẬP: THỊT HEO TĂNG SINH VI SINH VẬT: PHƯƠNG PHÁP PHÂN LẬP VÀ MÔI TRƯỜNG PHÂN LẬP MÔI TRƯỜNG PHÂN LẬP: PHƯƠNG PHÁP PHÂN LẬP: III NHẬN DIỆN VSV: ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI, CẤU TRÚC: ĐẶC ĐIỂM SINH TRƯỞNG VÀ PHÁT TRIỂN PHÂN BỐ: ĐẶC ĐIỂM SINH HÓA: IV Ý NGHĨA SỰ HIỆN DIỆN CỦA STAPHYLOCOCCUS AREUS TRONG MẪU THỰC PHẨM THỊT HEO LỜI MỞ ĐẦU Trong xã hội tình trạng ngộ độc thực phẩm giới Việt Nam cao Tình trạng chưa có dấu hiệu dừng lại ngày tăng Qua kiểm tra cho thấy hầu hết vụ ngộ độc thực phẩm vi sinh vật gây Đây điều cảnh báo có cách thức phòng ngừa xảy vụ ngộ độc tập thể gây nguy hiểm dẫn đến tử vong Các vụ ngộ độc thực phẩm có nhiều nguyên nhân do: hóa chất, chất thực phẩm chứa sẵn số chất độc,… Nhưng quan trọng hết từ vi sinh vật, hầu hết vụ ngộ độc thực phẩm thường Salmonella, E.coli, Staphylococcus aureus số loài khác gây Đặc biệt Staphylococcus aureus - nguyên nhân gây ngộ độc cao Điều đáng lưu ý quan tâm chủng có khả tiết số độc tố bền với nhiệt khó bị phân hủy nhiệt độ cao Hơn nữa, chúng lại có khả kháng methiciline, penicilline gặp điều kiện thuận lợi lây lan gây nên bệnh nguy hiểm Chính mà nhóm chúng em xin báo cáo đề tài: “Phân lập nhận diện vi khuẩn Staphylococus aureus mẫu thực phẩm” I Tổng quan vi khuẩn Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus (tụ cầu vàng) thuộc giống Staphylococcus, mang tính chất chung Staphylococcus S aureus vi khuẩn hình cầu, khơng di động, gram dương, đường kính 0,5-1,5 µm, đứng riêng lẻ đôi, chuỗi ngắn chùm không giống chùm nho,chúng thường cư trú da người động vật máu nóng Staphylococcus vi khuẩn hiếu khí hay kị khí tùy tiện, có trao đổi chất, hô hấp lên men Phân loại: chia làm nhóm: - (+) với Coagullase: enzym đặc hiệu chủng Staphylococus aureus - (-) với Coagullase nhạy kháng sinh Nabovicine - (-) với Coagullase kháng kháng sinh Nabovicine II Phân lập vi sinh vật: Chọn mẫu thực phẩm phân lập, tăng sinh vi sinh vật a Mẫu thực phẩm để phân lập: thịt heo b Tăng sinh vi sinh vật: Cân xác 25g mẫu túi PE vô trùng, thêm 225ml môi trường SPW(pepton water), buộc kín đồng mẫu tay vòng 10 phút, sau ủ tăng sinh Phương pháp phân lập môi trường phân lập a Môi trường phân lập: - Môi trường thạch máu (Blood agar): thành phần mơi trường hòa tan nước đun hòa tan hoàn toàn Khử trùng nhiệt độ 121oC 15` Làm nguội môi trường đến 45-50oC thêm 5% máu cừu bê loại bỏ sợi huyết thêm chất chống đơng citrate Hòa tan máu vào môi trường phân phố vào đĩa petri Môi trường phải pha chế trước ngày để kiểm tra khả bị nhiễm Môi trường không nên đổ dày để quan sát vòng tan máu - Mơi trường Baird Parker Agar (BP): sau pha chế đầy đủ thành phần môi trường, đem khử trùng 121 oC 15` làm nguội đến 50 oC Sau bổ sung egg yolk vào mơi trường - Môi trường TSA b Phương pháp phân lập: Pha mẫu Mẫu sau ủ tăng sinh,lấy pha lỗng mẫu:chuẩn bị dãy pha lỗng mẫu thích hợp tùy theo mức nhiễm mẫu, cho cấy thể tích xác định lên đĩa thạch Baird Parker xuất khoảng 10 – 100 khuẩn lạc / đĩa Phân lập môi trường chọn lọc: - Cấy 0,1 ml mẫu ngun pha lỗng vào đĩa mơi trường thạch Baird Parker.Dùng que cấy tam giác thủy tinh ( gạt thủy tinh) trải mẫu lên bề mặt môi trường khô Thực lập lại đĩa môi trường thạch Baird Parker cho loại pha lỗng Thực tương tự với mơi trường thạch máu Lật ngược đĩa, ủ 37 ± 1oC trong24 – 48 môi trường Baird Parker 24 môi trường thạch máu - Sau 24 giờ, khuẩn lạc S aureus môi trường thạch Baird Parker có đường kính 0,5 – mm, lồi , đen bóng, có vòng sáng rộng khoảng – 2mm bao quanh - Đánh dấu mặt đáy đĩa khuẩn lạc có đặc điểm tiếp tục ủ 48 Sau 48 khuẩn lạc S aureus có đường kính khoảng – 1,5mm, có màu đen bóng, lồi, có vòng trắng đục hẹp vòng sáng rộng khoảng – 4mm quanh khuẩn lạc Khuẩn lạc số dòng S aureus khơng tạo vòng sáng quanh khuẩn lạc Cần đếm đánh dấu hai loại khuẩn lạc - Trên môi trường thạch máu sau 24 ủ S aureus cho khuẩn lạc bóng lống, đục, lồi, có màu xám hay vàng nhạt, đường kính khoảng – 2µm Hầu hết S aureus có vùng tan máu, nhiên số dòng khơng tạo vùng tan máu Hình 1: khuẩn lạc s aureus đặc trưng mt BP  Khẳng định: - Dùng que cấy vòng cấy khuẩn lạc đặc trưng khuẩn lạc không đặc trưng từ môi rường Baird Parker lên môi trường thạch TSA, ủ 37 ± 1oC 24 - Cấy sinh khối vi khuẩn từ môi trường TSA vào ống nghiệm chứa huyết tương rã đông, ủ 37 ± 1oC Theo dõi kết phản ứng đông huyết tương sau khoảng thời gian 2,4,6,8 24 - Tính tỉ lệ khẳng định dựa số khuẩn lạc đặc trưng không đặc trưng Thực tương tự với khuẩn lạc đặc trưng môi trường thạch máu - Kết thử nghiệm (+) có khối đơng huyết tương hình thành (mọi mức độ đông kết xem (+)) Kết (-) khơng có hình thành khối đông, hỗn dịch đồng ống không cấy Hình 2: kết thủ nghiệm coagulase  Kết quả: Mật độ S aureus mẫu thực phẩm tính sau: 10(NtHt + NaHa) Mật độ(CFU/g hay CFU/ml) = F1 + F2 Trong đó:  F: độ pha loãng  Nt: tổng số khuẩn lạc đặc trưng  Na: tổng số khuẩn lạc không đặc trưng  Ht: tỷ số số khuẩn lạc đặc trưng cho thử nghiệm khẳng định (+) so vớikhuẩn lạc đặc trưng Ha: tỷ số số khuẩn lạc không đặc trưng cho thử nghiệm khẳng định (+)  sovới số khuẩn lạc không đặc trưng III Nhận diện vsv: Đặc điểm hình thái, cấu trúc: Staphylococcus aureus thuộc giống Staphylococcus, mang tính chất chung Staphylococcus S.aureus vi khuẩn hình cầu, khơng di động, gram dương, đường kính 0,5-1,5 µm, tế bào xếp thành hình chùm nho, khơng di động, vi khuẩn hiếu khí hay kị khí tùy tiện Đ ặ điểm sinh trưởng phát Hình 3: hình thái S aureus triển c Hình 4: Tụ cầu Staphylococcus aureus gram dương kính hiển vi - Nhiệt độ tăng trưởng 7-48 độ C nhiệt độ tối ưu 37 độ C - Enterotoxin sản xuất tối ưu 35-40 độ C - Tăng trưởng tối ưu pH từ 6-7 pH tối thiểu tối đa 9.8-10 - Nó tăng trưởng dễ dàng mơi trường có 5-7% NaCl vài chủng có khả tăng trưởng môi trường lên đến 20% NaCl - Staphylococus aureus bền vững nồng độ đường cao, nhiên bị ức chế nồng độ đường 60%, có khả bám dính tốt Phân bố: - S aureus cư trú người động vật, có sữa bò bị bệnh, thịt heo tươi, đất, vết thương sưng mũ - Đầu tiên phát triển với số lượng thấp, sau phát triển lên số lượng lớn khơng có bước gia nhiệt hợp lý để phá hủy chúng hòan tồn - Dễ dàng phát triển sản phẩm không qua xử lý nhiệt, sản phẩm làm tay sản phẩm làm lạnh không hợp lý - Nguổn thực phẩm gây bệnh chủ yếu: thịt heo, bánh mì, trứng, thịt bò,thịt gà Đặc điểm sinh hóa: - Phát triển tôt môi trường tổng hợp, đặc biệt môi trường thạch máu tây… huyết thanh, sinh betahemolysin môi trường thạch máu - Phản ứng indol, NH3, thủy phân gelatine, đông huyết tương - Trên môi trường thạch khuẩn lạc có hình tròn trơn bóng, đục mờ - Trên mơi trường lỏng tế bào dạng cặn, vòng dãn mờ ống nghiệm bề mặt môi trường - Tụ cầu có hệ thống enyme phong phú, enzyme chuẩn đốn là:  Coagulase có khả làm đông huyết tương người động vật chống đông Đây tiêu chuẩn quan trọng để phân biệt tụ cầu vàng với tụ cầu khác  Coagulase có hai loại: loại tiết môi trường(coagulase tự do), loại bám vào vách tế bào(coagulase cố định)  Catalase dương tính: enzyme thủy phân H2O2, catalase có tất tụ cầu mà khơng có liên cầu IV  Lên men đường mannitol  Desoxyribonuclease enzyme phân giải DNA Ý nghĩa diện Staphylococcus areus mẫu thực phẩm thịt heo Khả nhiễm vào thực phẩm gây bệnh S aureus lớn chúng phân bố khắp nơi có khả sinh độc tố Tụ cầu nhiễm thực phẩm vào chủ yếu qua đường chế biến có cơng đoạn tiếp xúc trực tiếp với người Sự diện với mật độ cao S aureus thực phẩm cho thấy điều kiện vệ sinh trình chế biến kém, kiểm sốt nhiệt độ cơng đoạn chế biến khơng tốt Tuy nhiên, điều khơng đủ chứng thực phẩm gây độc, điều xảy S aureus phân lập tạo độc tố Ngược lại, với lượng nhỏ S aureus tạo độc tố gây ngộ độc  Staphylococcus aureus gây hội chứng nhiễm trùng nhiễm độc:  Hội chứng nhiễm độc: tác dụng hay nhiều độc tố vi khuẩn mà có khơng cần có diện vi khuẩn Các biểu nhiễm độc bao gồm: hội chứng shock độc tố( TSST: Toxic Shock Syndrome Toxin), hội chứng tróc da tụ cầu hay ngộ độc thức ăn tụ cầu Quá trình nhiễm độc: Xâm nhập Sinh độc tố Hấp thụ độc tố Lây nhiễm  Hội chứng nhiễm trùng: biểu nhiễm trùng vi khuẩn tăng sinh, xâm nhập hay phá hủy mô ký chủ, gây đá ứng viêm chỗ toàn thân Chúng sản xuất yếu tố độc lực giúp vi khuẩn tồn phát triển thể ký chủ  Các yếu tố độc lực Staphylococus aureus:  Protein bề mặt: thúc đẩy trình gắn kết vào tế bào vật chủ  Yếu tố xâm lấn: giúp tế bào vận chuyển xâm lấn vào tổ chức mơ tế bào vật chủ, có khả phân hủy cấu trúc màng tế bào  Độc tố đường ruột chủng Staphylococus: Staphylococial enterotoxin – bền với nhiệt độ (không phân hủy cách gia nhiệt) Việc ngộ độc chủng gây xét có khả tạo độc tố, phụ thuộc vào nồng độ cà hoạt lực (nồng độ cao, hoạt lực thấp khơng có khả ngộ độc ngược lại )  ... QUAN VỀ VI KHUẨN STAPHYLOCOCCUS AUREUS II PHÂN LẬP VI SINH VẬT: A B A B CHỌN MẪU THỰC PHẨM PHÂN LẬP, VÀ TĂNG SINH VI SINH VẬT MẪU THỰC PHẨM ĐỂ PHÂN LẬP: THỊT HEO ... Nabovicine - (-) với Coagullase kháng kháng sinh Nabovicine II Phân lập vi sinh vật: Chọn mẫu thực phẩm phân lập, tăng sinh vi sinh vật a Mẫu thực phẩm để phân lập: thịt heo b Tăng sinh vi sinh... enzyme phân giải DNA Ý nghĩa diện Staphylococcus areus mẫu thực phẩm thịt heo Khả nhiễm vào thực phẩm gây bệnh S aureus lớn chúng phân bố khắp nơi có khả sinh độc tố Tụ cầu nhiễm thực phẩm vào chủ