NGHIÊN cứu tác DỤNG hỗ TRỢ điều TRỊ BỆNH gút TRÊN THỰC NGHIỆM của VIÊN NANG cần tây KHÓA LUẬN tốt NGHIỆP dược sĩ

Kết quả đánh giá tác dụng hạ acid uric huyết thanh, chống viêm, giảm đau thực nghiệm của viên nang cần tây .... Về tác dụng hạ acid uric huyết thanh, chống viêm, giảm đau thực nghiệm của

HÀ NỘI - 2019

MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 2

1.1 Tổng quan về bệnh gút 2

1.1.1 Khái niệm 2

1.1.2 Dịch tễ học bệnh gút 2

1.1.3 Quá trình sinh tổng hợp acid uric 2

1.1.4 Cơ chế bệnh sinh bệnh gút 3

1.1.5 Triệu chứng lâm sàng của bệnh gút 4

1.1.6 Thuốc sử dụng trong điều trị bệnh gút và tăng acid uric máu 4

1.2 Tổng quan về hạt cần tây 7

1.2.1 Đặc điểm thực vật và phân bố loài Apium graveolens L 7

1.2.2 Thành phần hóa học 8

1.2.3 Tác dụng sinh học 10

1.2.4 Một số sáng chế liên quan đến tác dụng điều trị bệnh gút của hạt cần tây 13

1.2.5 Độc tính 15

1.2.6 Một số sản phẩm điều trị bệnh gút từ hạt cần tây trên thị trường 15

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

2.1 Đối tượng nghiên cứu 16

2.1.1 Nguyên liệu nghiên cứu 16

2.1.2 Phương tiện nghiên cứu 16

2.2 Nội dung nghiên cứu 17

2.3 Phương pháp nghiên cứu 17

2.3.1 Thiết kế liều thử tác dụng dược lý 17 2.3.2 Phương pháp đánh giá tác dụng hạ acid uric huyết thanh, chống viêm, giảm đau

thực nghiệm 18

2.3.3 Phương pháp xác định độc tính cấp và độc tính bán trường diễn 22

2.3.4 Phương pháp xử lý số liệu 24

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 25

3.1 Kết quả đánh giá tác dụng hạ acid uric huyết thanh, chống viêm, giảm đau thực nghiệm của viên nang cần tây 25

3.1.1 Kết quả đánh giá tác dụng hạ acid uric huyết thanh thực nghiệm 25

3.1.2 Kết quả đánh giá tác dụng chống viêm trên mô hình gây viêm màng hoạt dịch khớp gối bằng tinh thể natri urat 25

3.1.3 Kết quả đánh giá tác dụng giảm đau của viên nang cần tây trên mô hình gây đau do viêm (Randall-Selitto Test) 27

3.2 Kết quả xác định độc tính cấp và độc tính bán trường diễn của viên nang cần tây27 3.2.1 Kết quả xác định độc tính cấp 27

3.2.2 Kết quả xác định độc tính bán trường diễn 28

CHƯƠNG 4 BÀN LUẬN 39

4.1 Về tác dụng hạ acid uric huyết thanh, chống viêm, giảm đau thực nghiệm của viên nang cần tây 39

4.1.1 Tác dụng hạ acid uric huyết thanh thực nghiệm 39

4.1.2 Tác dụng chống viêm thực nghiệm trên mô hình gây viêm màng hoạt dịch khớp gối bằng tinh thể natri urat 40

4.1.3 Tác dụng giảm đau trên mô hình gây đau do viêm (Randall – Sellito Test) 41

4.1.4 Liên quan giữa thành phần hóa học và tác dụng hạ acid uric, chống viêm của viên nang cần tây 41

4.2 Về kết quả xác định độc tính cấp và độc tính bán trường diễn của viên nang cần tây 42

4.2.1 Về độc tính cấp 42

4.2.2 Về độc tính bán trường diễn 43

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 45

TÀI LIỆU THAM KHẢO 46

LỜI CẢM ƠN

Trước tiên, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và lời cảm ơn chân thành

nhất đến PGS TS Nguyễn Thu Hằng và PGS TS Nguyễn Thùy Dương, những

người đã trực tiếp hướng dẫn, tận tình chỉ bảo và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu Nhà trường, các phòng ban, cùng toàn thể các thầy cô giáo Trường Đại Học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện cho tôi trong thời gian học tập và nghiên cứu

Tôi cũng xin gửi lời cả ơn chân thành tới các thầy, cô, các anh chị đang công tác tại Bộ môn Dược liệu và Bộ môn Dược lực, cùng các bạn và các em sinh viên đang nghiên cứu khoa học tại bộ môn đã luôn tạo điều kiện và nhiệt tình giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài Đặc biệt tôi xin được gửi lời cảm ơn sâu sắc đến Dược sĩ

Nguyễn Văn Phương, người đã đồng hành, đóng góp ý kiến và giúp đỡ tôi trong thời

gian qua

Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình và người thân, những người luôn bên cạnh và ủng hộ hết lòng, là nguồn cổ vũ tinh thần lớn lao đối với tôi trong thời gian thực hiện khóa luận này

Hà Nội, ngày 19 tháng 5 năm 2019

Sinh viên

Hoàng Thị Quỳnh

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

3nB 3 - n – butylphtalid

AST Aspartat aminotransaminase

ALT Alanin aminotransaminase

APTT

COX

Thời gian thromboplastin từng phần hoạt hóa Cyclo-oxygenase

BSR British Society for Rheumatology - Hiệp Hội Thấp Khớp Anh

EULAR European League Against Rheumatism - Liên Đoàn Chống Thấp Khớp

Châu Âu GC/MS Sắc ký khí – khối phổ

HPRT

LD50

Hypoxanthin phosphoribosyl transferase Liều tối thiểu gây chết 50% động vật thí nghiệm Na-CMC

PRPP Phosphoribosyl pyrophosphat

PT Thời gian prothrombin

TT Thời gian thrombin

DANH MỤC CÁC BẢNG

STT Kí

1 1.1 Một số hợp chất flavonoid trong hạt cần tây 9

2 2.1 Thang điểm đánh giá mức độ viêm dựa trên triệu chứng 20

3 3.1

Ảnh hưởng của viên nang cần tây đến nồng độ acid uric huyết thanh chuột nhắt trắng trên mô hình gây tăng acid uric cấp bằng kali oxonat

25

4 3.2 Kết quả đánh giá tác dụng chống viêm trên mô hình gây viêm

màng hoạt dịch khớp gối bằng tinh thể natri urat 26

5 3.3 Kết quả đánh giá tác dụng giảm đau của viên nang cần tây trên

mô hình gây đau do viêm (Randall-Sellito Test) 27

6 3.4 Ảnh hưởng của viên nang cần tây liều lặp lại 28 ngày đến các

7 3.5 Ảnh hưởng của viên nang cần tây liều lặp lại 28 ngày đến các

8 3.6

Ảnh hưởng của viên nang cần tây liều lặp lại 28 ngày đến tỷ lệ khối lượng các cơ quan so với khối lượng cơ thể của chuột nhắt trắng

34

9 3.7 Ảnh hưởng của viên nang cần tây liều lặp lại 28 ngày đến mô

10 3.8 Ảnh hưởng của viên nang cần tây liều lặp lại 28 ngày đến mô

11 3.9 Ảnh hưởng của viên nang cần tây liều lặp lại 28 ngày đến mô

12 3.10 Ảnh hưởng của viên nang cần tây liều lặp lại 28 ngày đến mô

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

STT Kí

1 1.1 Quá trình sinh tổng hợp acid uric trong cơ thể 3

2 1.2 Khung cấu trúc của flavonoid trong hạt cần tây 8

2.1 Qui trình đánh giá tác dụng hạ acid uric máu trên mô hình gây

tăng acid uric cấp thực nghiệm bằng kali oxonat 19

3 2.2 Qui trình đánh giá tác dụng chống viêm trên mô hình gây viêm

màng hoạt dịch khớp gối bằng tinh thể natri urat 20

4 2.3 Qui trình đánh giá tác dụng giảm đau trên mô hình gây đau do

5 3.1 Ảnh hưởng của viên nang cần tây đến khối lượng cơ thể chuột

6 3.2 Ảnh hưởng của viên nang cần tây đến khối lượng cơ thể chuột

ĐẶT VẤN ĐỀ

Gút là bệnh rối loạn chuyển hóa protein làm tăng lượng acid uric trong cơ thể, được đặc trưng bởi những cơn đau sưng dữ dội và thường để lại hậu quả rất nặng nề cho bệnh nhân như hư khớp gối, biến dạng khớp, suy thận… nếu không được chẩn đoán kịp thời và điều trị đúng [1] Bệnh đang có xu hướng gia tăng trong một vài thập

kỷ gần đây, nhất là ở những nước phát triển [76] Tỷ lệ mắc bệnh gút chung trên thế giới là 0,1% - 10% và có sự khác biệt khá lớn giữa các quốc gia [44] Tại Việt Nam, tỷ

lệ mắc bệnh gút khoảng 0,14% dân số và đang có xu hướng ngày càng gia tăng [54] Bệnh có mối liên hệ chặt chẽ với việc tăng nồng độ acid uric máu

Các thuốc hóa dược hiện nay vẫn đóng vai trò chính trong điều trị bệnh gút với mục tiêu là hạ acid uric máu và chống viêm Ưu điểm của thuốc hóa dược là tác dụng nhanh, sử dụng thuận tiện Nhưng bên cạnh đó, các thuốc này thường đi kèm một số tác dụng không mong muốn như loét dạ dày, suy gan, thận, độc với tủy xương, hội chứng Stevens-Johnson, shock phản vệ…[90], [95] Vì vậy, việc nghiên cứu phát triển các thuốc điều trị bệnh gút hiệu quả và an toàn hơn là cần thiết Trong quá trình nỗ lực tìm kiếm, bên cạnh các thuốc hóa dược, thuốc có nguồn gốc tự nhiên vẫn luôn là đối tượng quan tâm của các nhà nghiên cứu

Cần tây (Apium graveolens L.) là loại cây rau ăn được trồng rất phổ biến trên thế

giới và đã được di thực về trồng tại Việt Nam Hạt cần tây được sử dụng theo kinh nghiệm dân gian để chữa các bệnh về khớp [13] Trong y học hiện đại, hạt cần tây được đánh giá là dược liệu tiềm năng để phát triển sản phẩm phòng và điều trị bệnh gút do tác dụng hạ acid uric [15], chống viêm, giảm đau [17] của dược liệu này đã được chứng minh trên thực nghiệm Tại một số quốc gia, các sản phẩm từ hạt cần tây

đã được phát triển để điều trị hoặc hỗ trợ điều trị bệnh gút với các dạng bào chế đa dạng, linh hoạt từ viên nang, viên nén tới bột, trà [101] Tuy nhiên, tại Việt Nam cho đến nay chưa có sản phẩm điều trị hoặc hỗ trợ điều trị bệnh gút từ hạt cần tây Hiện nay, nhóm nghiên cứu tại Bộ môn Dược liệu đã bào chế viên nang cứng có thành phần

là cao chiết giàu flavonoid từ hạt cần tây Để phát triển thành sản phẩm hỗ trợ điều trị bệnh gút, viên nang cần tây cần được đánh giá tác dụng và tính an toàn trên thực

nghiệm Do đó, đề tài “Nghiên cứu tác dụng hỗ trợ điều trị bệnh gút trên thực nghiệm của viên nang cần tây” được thực hiện với hai mục tiêu sau:

1 Đánh giá tác dụng hạ acid uric máu, chống viêm, giảm đau trên thực nghiệm của viên nang cần tây

2 Xác định độc tính cấp và độc tính bán trường diễn của viên nang cần tây

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về bệnh gút

1.1.1 Khái niệm

Gút là bệnh rối loạn chuyển hóa purin làm tăng lượng acid uric trong cơ thể, được biểu hiện bằng những cơn đau sưng dữ dội [1] Khi nồng độ acid uric bão hòa ở dịch ngoại bào sẽ gây lắng đọng các tinh thể monosodium urat ở các mô Tùy theo vị trí tinh thể urat bị tích lũy mà bệnh biểu hiện bởi một hay nhiều triệu chứng lâm sàng: viêm khớp và cạnh khớp cấp và/hoặc mạn tính, thường được gọi là viêm khớp do gút; hạt tophi ở mô mềm; bệnh thận do gút hoặc sỏi tiết niệu [80]

1.1.2 Dịch tễ học bệnh gút

Gút là bệnh phổ biến nhất trong nhóm bệnh về viêm khớp và đang có xu hướng gia tăng trong một vài thập kỷ gần đây, nhất là ở những nước phát triển [76]

Tỷ lệ mắc bệnh gút ở hầu hết các nước phát triển là hơn 1%, đặc biệt là ở Bắc

Mỹ và Châu Âu Trong đó, Hy Lạp là nước có tỷ lệ mắc bệnh gút cao nhất ở châu Âu, với tỉ lệ mắc ở độ tuổi lớn hơn 20 tuổi là 4,75% Tại Anh, tỉ lệ mắc bệnh gút năm 2012

là 2,49% Trong đó, tỉ lệ mắc ở nam giới là 3,97% và ở nữ giới là 1,05% [45] Tại Úc,

từ năm 2008 – 2013, tỉ lệ mắc bệnh gút là 1,54% Trong đó, tỷ lệ mắc bệnh ở nam giới

là 2,67% và ở nữ giới là 0,53% Tỉ lệ mắc tăng theo tuổi ở cả nam và nữ [77] Theo một nghiên cứu năm 2000, tỷ lệ mắc bệnh gút ở Việt Nam ước tính khoảng 0,14% dân

số và đang có xu hướng ngày càng tăng [54]

Các yếu tố nguy cơ trong bệnh gút được chia làm hai nhóm: nhóm yếu tố bất biến (giới tính, tuổi, gen) và nhóm yếu tố khả biến (chế độ ăn uống, sử dụng thuốc, các bệnh đi kèm như suy thận, tăng huyết áp, các bệnh liên quan đến chuyển hóa…) [92] Bệnh thường gặp ở nam giới hơn so với nữ giới, nhất là nữ giới thời kỳ mãn kinh, nguyên nhân do estrogen (hormon sinh dục nữ giới) đã làm tăng quá trình bài tiết acid uric ra nước tiểu [76]

1.1.3 Quá trình sinh tổng hợp acid uric

Acid uric là sản phẩm của quá trình thoái giáng các nucleo-protein có chứa nhân purin (adenin, guanin) trong cơ thể với sự tham gia của các enzym: phosphoribosyl pyrophosphatase (PRPP), nucleosid phosphorylase, xanthin oxidase (XO) [28], [32] Quá trình sinh tổng hợp acid uric trong cơ thể được trình bày tóm tắt ở sơ đồ hình 1.1 [41]

Hình 1.1 Quá trình sinh tổng hợp acid uric trong cơ thể [41]

Khi nồng độ acid uric trong huyết thanh cao hơn nồng độ bão hòa (khoảng 6,8 mg/dL) dẫn tới tích lũy tinh thể urat tại các mô, tạo nên các hạt microtophi Sự lắng đọng các hạt này ở các vị trí khác nhau gây nên các tổn thương khác nhau Khi các hạt này tại sụn khớp vỡ ra sẽ khởi phát quá trình viêm gây cơn gút cấp Sự lắng đọng vi tinh thể cạnh khớp, trong màng hoạt dịch, trong mô sụn và mô xương sẽ dẫn đến bệnh xương khớp mạn tính do gút [41], [42]

1.1.5 Triệu chứng lâm sàng của bệnh gút

Cơn gút cấp thường xuất hiện đột ngột ban đêm, bệnh nhân thức dậy do đau ở khớp, va chạm nhẹ cũng gây đau, thường gặp ở khớp bàn - ngón chân cái (chiếm 60 - 70%): khớp sưng to, đỏ, phù nề, căng bóng, nóng, đau dữ dội và ngày càng tăng, thay đổi thứ tự: bàn chân, cổ chân, gối, bàn tay, cổ tay, khuỷu, hiếm thấy ở khớp háng, vai, cột sống Ngoài ra, túi thanh dịch, gân, bao khớp cũng có thể bị thương tổn Toàn thân sốt nhẹ, mệt mỏi, mắt nổi tia đỏ, khát nước nhiều nhưng đái ít và đỏ, táo bón Các dấu hiệu viêm có thể kéo dài nhiều ngày, thường từ 5-7 ngày rồi các dấu hiệu viêm giảm dần: đỡ đau, đỡ nề, bớt đỏ Hết cơn gút cấp, khớp trở lại hoàn toàn bình thường [4]

1.1.6 Thuốc sử dụng trong điều trị bệnh gút và tăng acid uric máu

1.1.6.1 Thuốc chống viêm

➢ Colchicin

Colchicin có tác dụng giảm đau và chống viêm đặc hiệu với cơn gút cấp hoặc đợt cấp của gút mạn tính Colchicin được chỉ định trong cơn gút cấp và cần dùng càng sớm càng tốt; dự phòng cơn gút cấp ở bệnh nhân gút mạn và được sử dụng như một test thăm dò trong chẩn đoán [4], [12] Phối hợp colchicin với một thuốc nhóm chống viêm không steroid (nếu không có chống chỉ định với nhóm thuốc này) để đạt hiệu quả cắt cơn gút [4]

Với mục đích chống viêm, giảm đau trong cơn gút cấp hoặc đợt cấp của gút mạn tính, colchicin không nên sử dụng liều cao vì có tác dụng không mong muốn đường tiêu hóa, nên sử dụng liều 1 mg/ngày hoặc 0,5 mg x 2 - 4 lần/ngày [4], [39]

Ở những bệnh nhân suy thận, khuyến cáo sử dụng liều khởi đầu thấp hơn hoặc kéo dài khoảng cách giữa các liều Theo EULAR 2016, colchicin không nên sử dụng ở bệnh nhân có eGFR < 30 ml/phút/1,73m2 [75] Ở bệnh nhân đang sử dụng các thuốc

ức chế cytochrom P450 3A4 (như ritonavir, clarithromycin, itraconazol, ketaconazol

và diltiazem) hoặc các chất ức chế p-glycoprotein (như ciclosporin), liều colchicin nên

được giảm 50% hoặc 75% tùy theo tương tác thuốc [39]

Tác dụng không mong muốn: colchicin có chỉ số điều trị hẹp do ức chế tubulin,

có thể biểu hiện gây độc tính toàn thân nếu quá liều: rối loạn tiêu hóa (buồn nôn, nôn, đau bụng, tiêu chảy); mề đay, phát ban dạng sởi, giảm bạch cầu, tiểu cầu, rối loạn thần kinh cơ Liều cao gây ức chế tủy xương, viêm dây thần kinh, độc với gan, thận, gây đông máu nội mạch rải rác, rụng tóc…[2], [4]

➢ Thuốc chống viêm không steroid (NSAIDs)

Các NSAIDs thường được sử dụng trong điều trị cơn viêm khớp gút cấp như diclofenac, indomethacin, naproxen, ibuprofen, piroxicam…, các nhóm thuốc ức chế chọn lọc COX-2 (celecoxib, etoricoxib…) Các NSAIDs thường được chỉ định đơn trị liệu hay phối hợp với colchicin nhằm giảm đau trong các cơn gút cấp [4], [12], [42] Cần thận trọng, cân nhắc khi dùng đối với người cao tuổi và người có bệnh mắc kèm, chỉ nên sử dụng thuốc trong thời gian ngắn và với liều thấp Thuốc cần tránh dùng đối với bệnh nhân bị suy gan, suy thận, suy tim, viêm loét dạ dày - tá tràng tiến triển hay đang dùng thuốc kháng kết tập tiểu cầu hay chống đông [12], [39] Ở những bệnh nhân có nguy cơ cao gặp các biến chứng trên tiêu hóa, nên kê đơn kèm theo thuốc ức chế bơm proton (PPI) [75]

Tác dụng không mong muốn của các thuốc chống viêm không steroid chủ yếu liên quan đến tác dụng ức chế tổng hợp prostaglandin như: gây kích ứng, đau thượng

vị, nặng hơn có thể loét dạ dày tá tràng, xuất huyết tiêu hóa; kéo dài thời gian chảy máu do ức chế kết tập tiểu cầu, giảm tiểu cầu và giảm prothrombin; giảm sức lọc cầu thận, tăng kali máu và viêm thận kẽ, gây độc với gan… [12]

➢ Glucocorticoid

Glucocorticoid đường uống (prednisolon liều 30 - 35 mg/ngày) được khuyến cáo

sử dụng trong thời gian ngắn (3 - 5 ngày) nếu bệnh nhân sử dụng NSAIDs và colchicin không hiệu quả hoặc có chống chỉ định [31] Tuy nhiên, việc sử dụng glucocorticoid cần rất hạn chế và chỉ nên dùng ngắn ngày Đường tại chỗ (tiêm glucocorticoid trực tiếp vào ổ khớp viêm) phải được thực hiện bởi thầy thuốc chuyên khoa cơ xương khớp sau khi loại trừ viêm khớp nhiễm khuẩn [4], [12]

Tác dụng không mong muốn: phù, tăng huyết áp do giữ natri và nước; loét dạ dày, tá tràng; nhược cơ, teo cơ, mỏi cơ; loãng xương, xốp xương; rối loạn phân bố mỡ; suy thượng thận cấp khi ngừng thuốc đột ngột, vết thương chậm lên sẹo, dễ nhiễm

trùng; tăng đường huyết hoặc làm nặng thêm bệnh đái tháo đường Các tác dụng không mong muốn khác như: đục thủy tinh thể, mất ngủ… [2]

➢ Các thuốc ức chế Interleukin 1

Tinh thể urat gây viêm thông qua hoạt hóa phức hợp gây viêm NALP 3, từ đó hoạt hóa hoạt động của caspalase-1, tăng tạo thành và giải phóng IL-1β Như vậy, tác dụng gây viêm của tinh thể urat phụ thuộc vào IL-1β và có thể bị ức chế bởi các chất

ức chế IL-1β Các thuốc ức chế IL-1 được cho là có hiệu quả trong điểu trị cơn gút cấp

như anakinra, cankinumab và rilonacept [42], [75]

1.1.6.2 Thuốc hạ acid uric máu

➢ Thuốc ức chế tổng hợp acid uric

❖ Allopurinol

Allopurinol được lựa chọn ưu tiên trong điều trị gút mạn tính Không nên chỉ định allopurinol trong cơn gút cấp mà nên chỉ định khi tình trạng viêm khớp đã thuyên giảm, sau 1-2 tuần sử dụng colchicin [4] Liều khởi đầu của allopurinol là 50 - 100 mg/ngày, sau đó tăng 100mg mỗi 2 – 4 tuần (tối đa 900 mg/ngày) cho đến khi đạt được nồng độ acid uric mục tiêu Allopurinol cần điều chỉnh liều theo mức lọc cầu thận, nếu không đạt được nông độ acid uric huyết thanh mục tiêu ở mức liều này nên chuyển sang sử dụng febuxostat [42], [75]

Tác dụng không mong muốn thường gặp của allopurinol là nổi ban trên da (ban dát sần hoặc ngứa, thỉnh thoảng là ban xuất huyết) Các phản ứng mẫn cảm trầm trọng hơn có thể xảy ra bao gồm ban tróc vảy, hội chứng Stevens-Johnson và hoại tử biểu bì nhiễm độc Phản ứng quá mẫn có thể nặng, thậm chí gây tử vong, đặc biệt có nguy cơ cao ở những bệnh nhân suy gan hoặc thận Các nghiên cứu về gen đã phát hiện cặp allen HLAB*5801 liên quan đến tình trạng dị ứng da nặng do allopurinol [31], [90] Các tác dụng không mong muốn khác: tăng phosphatase kiềm, AST, ALT, gan to

có hồi phục, phá hủy tế bào gan, viêm gan, suy gan, vàng da; giảm bạch cầu hoặc tăng bạch cầu, chứng mất bạch cầu hạt, giảm tiểu cầu, xuất huyết, ức chế tủy xương, thiếu máu tan máu; buồn nôn, nôn, đau bụng, tiêu chảy, táo bón, tắc nghẽn ruột, viêm trực tràng, rối loạn vị giác, chảy máu đường tiêu hóa, viêm tụy xuất huyết [2]

❖ Febuxostat

Febuxostat là thuốc ức chế xanthin oxidase mới, không có nhân purin, có tác dụng làm giảm sinh tổng hợp acid uric Febuxostat được chỉ định kết hợp với

allopurinol hoặc thay thế khi chống chỉ định hoặc không dung nạp hay không đạt được nồng độ acid uric huyết thanh mục tiêu Febuxostat không cần chỉnh liều ở bệnh nhân suy thận [12], [37] Liều khởi đầu là 80 mg/ngày, có thể tăng đến 120 mg/ngày sau 4

tuần cho đến khi đạt được nồng độ acid uric mục tiêu [75]

➢ Thuốc tăng thải acid uric qua thận

Các thuốc trong nhóm bao gồm: probenecid, sulfinpyrazon, benzbromaron, lesinurad Các thuốc này có tác dụng tăng đào thải acid uric qua nước tiểu do cạnh tranh với acid uric trên hệ thống vận chuyển anion ở ống thận Chỉ định nhóm này cần xét nghiệm acid uric niệu Chống chỉ định khi acid uric niệu trên 600 mg/24 giờ, suy thận, sỏi thận, người cao tuổi, gút mạn có hạt tophi [2] Có thể kết hợp allopurinol với thuốc tăng thải acid uric Benzbromaron không được lưu hành tại một số quốc gia do gây độc tính nghiêm trọng trên gan [31]

➢ Thuốc tiêu acid uric

Trong cơ thể các loài động vật có vú đều có enzym uricase giúp chuyển urat thành allatoin dễ tan và dễ bài tiết ra khỏi cơ thể, do đó nồng độ urat máu của các loài này thường thấp và không bị gút [41] Các thuốc trong nhóm tiêu acid uric có thể sẽ được sử dụng ngắn hạn trong thời gian đầu của cơn gout cấp để làm cạn nhanh dự trữ urat trong cơ thể (điều trị tấn công), sau đó tiếp tục bằng các loại thuốc hạ acid uric máu khác để ngăn chặn việc tích tụ lại acid uric (điều trị duy trì) Một số thuốc tiêu acid uric gồm: rasburicase, PEG uricase, … [42]

Rasburicase là enzym uricase tái tổ hợp sẵn có và đang được sử dụng để phòng ngừa hội chứng phân giải khối u Tuy nhiên quá trình sử dụng rasburicase kéo dài để đáp ứng yêu cầu điều trị gút mạn tính bị hạn chế bởi tính sinh kháng nguyên của thuốc PEG uricase hiện là thuốc được sử dụng cho các bệnh nhân bị cơn gút cấp nặng hoặc không dung nạp các thuốc điều trị gút thông thường [40]

1.2 Tổng quan về hạt cần tây

1.2.1 Đặc điểm thực vật và phân bố loài Apium graveolens L

Tên Việt Nam: Cần tây

Tên tiếng Anh: Celery

Tên khoa học: Apium graveolens L., họ Cần (Apiaceae)

1.2.1.1 Đặc điểm thực vật

Cây thảo, có mùi thơm, sống 1-2 năm, thân mọc đứng, có rãnh dọc, phân nhánh, cao khoảng 15 - 150 cm Lá thuôn dài hoặc hình trứng, dài 7 - 18 cm, rộng 3,5 - 8 cm,

xẻ 3 thùy hình tam giác Thùy cuối có răng cưa hoặc khía, dài 1,2 - 2,5 cm, rộng 0,8 - 2,5 cm Lá phía trên có cuống ngắn, phiến hình tam giác, xẻ sâu 3 thùy, thùy cuối hình trứng Lá ở gốc có cuống, bẹ to rộng, hình tam giác, xẻ 3 - 5 thùy hình tam giác, đầu

tù, mép khía răng to, không lông Cụm hoa dạng tán, rộng 1,5 - 4,0 cm, mọc đối diện với lá, gồm nhiều tán dài, ngắn không đều, các tán ở đầu có cuống dài hơn các tán bên trong và có kích thước 4 - 15 mm Tán kép mang 8 - 12 tán, tán hoa có 7 - 25 hoa, kích thước 6 - 9 mm theo chiều ngang Hoa phía ngoài có 3-8 (-16) cánh hoa mảnh, kích thước 0,5 - 2,5cm, cuống dài 1 - 1,5 mm Quả (thường được gọi là hạt [26]) dạng trứng, hơi dẹt, tròn hai đầu, nhẵn, có 5 cánh lồi chạy dọc thân, đường kính 1,3 - 1,5

mm, chiều dài 1-2 mm Mùa ra hoa và quả vào tháng 4 - 6 [5], [53]

1.2.1.2 Phân bố

Cây có nguồn gốc ở khu vực bờ biển Đại Tây Dương và Địa Trung Hải, được trồng rộng rãi ở các nước phương Tây Tại Việt Nam, cần tây được di thực, trồng ở nhiều nơi làm rau ăn [5]

là apigenin và apiin [48]

Hình 1.2 Khung cấu trúc của flavonoid trong hạt cần tây

Nhóm flavonoid được đánh giá là thành phần có liên quan đến tác dụng điều trị bệnh gút của hạt cần tây [66], [67], [68] Một số hợp chất flavonoid quan trọng trong hạt cần tây được trình bày tóm tắt ở bảng 1.1

Bảng 1.1 Một số hợp chất flavonoid trong hạt cần tây

β-selinen (48,22%), limonen (24,32%) [22], [34]

Căn cứ vào cấu trúc, các thành phần trong tinh dầu hạt cần tây gồm 3 nhóm: dẫn xuất phthalid, terpen và các chất có cấu trúc khác Trong đó, đáng chú ý là các hợp chất thuộc nhóm dẫn xuất phthalid như 3-n-butyl phthalid, sedanolid, sedanenolid [24], [57]

1.2.2.3 Coumarin

Theo các tài liệu đã công bố, cho đến nay, 20 hợp chất furanocoumarin đã được phát hiện trong hạt cần tây [16], [23] Một số hợp chất điển hình như: umbelliferon,

psoralen, bergapten, xanthotoxin và isopimpinellin [33]

1.2.2.4 Lipid

Hàm lượng lipid trong hạt cần tây dao động trong khoảng 15,0% - 25,4%, trong

đó chủ yếu là triester của acid petroselinic (38,7%) và các acid béo không no khác như acid oleic, acid linoleic… [59], [82]

1.2.3 Tác dụng sinh học

1.2.3.1 Tác dụng hạ acid uric và ức chế xanthin oxidase

Cao ethanol chiết từ hạt cần tây cả 3 liều 250 mg/kg, 500 mg/kg và 1000 mg/kg, uống liên tục trong 5 ngày có tác dụng làm giảm nồng độ acid uric huyết thanh trên chuột nhắt so với lô chứng lần lượt là 59,3%; 52,6% và 43,8% Mặt khác, cao cần tây liều 250 mg/kg, 500 mg/kg làm giảm hoạt độ xanthin oxidase (XO) gan chuột thí nghiệm tương ứng 12,1% và 10,5% [63]

Dịch chiết ethanol 70% của cần tây được nghiên cứu với 3 mức liều 250 mg/kg,

500 mg/kg và 1000 mg/kg, uống liên tục trong 14 ngày Kết quả cho thấy dịch chiết từ cần tây liều 500 mg/kg và 1000 mg/kg có tác dụng làm giảm nồng độ acid uric huyết thanh trên chuột nhắt so với lô chứng Mặt khác, dịch chiết trên ở cả 3 liều 250 mg/kg,

500 mg/kg và 1000 mg/kg làm giảm hoạt độ xanthin oxidase (XO) gan chuột thí nghiệm tương ứng 83,2%; 78,2% và 49,2% [30]

Một nghiên cứu khác được tiến hành trên chuột, sử dụng dịch chiết hạt cần tây với ethanol 95% sau khi tinh chế bằng dung môi hữu cơ (ethyl acetat, cloroform ) và sắc kí cột Kết quả, sau 7 ngày sử dụng dịch chiết trên với mức liều 3,3 g/kg trên mô hình gây tăng acid uric cấp bằng kali oxonat, nồng độ acid uric trong máu của lô thử giảm 42,7% so với lô chứng [69] Trên mô hình tương tự song thay đổi quy trình chiết xuất, sử dụng phương pháp chiết hồi lưu với dung môi ethanol 80% (1 giờ/lần x 3 lần), nồng độ acid uric lô thử giảm 17,74% so với lô chứng sau 6 tuần uống dịch chiết cần tây với mức liều 2,25 g/kg [36] Ngoài ra, dịch chiết methanol với mức liều 500 mg/kg

có tác dụng làm giảm nồng độ acid uric huyết thanh so với lô chứng tại thời điểm 3 giờ

và 6 giờ sau khi gây tăng acid uric cấp bằng kali oxonat [19]

Dịch chiết ethanol toàn phần và các phân đoạn dịch chiết từ hạt cần tây đã được

đánh giá tác dụng ức chế enzym xanthin oxidase in vitro Kết quả cho thấy phân đoạn cloroform và phân đoạn ethyl acetat từ hạt cần tây đều thể hiện tác dụng ức chế XO in vitro một cách rõ rệt ở cả 3 nồng độ thí nghiệm 10 µg/ml, 50 µg/ml và 100 µg/ml

Dịch chiết ethanol toàn phần hạt cần tây chỉ thể hiện tác dụng ức chế XO ở 2 nồng độ cao là 50 µg/ml và 100 µg/ml [10]

1.2.3.2 Tác dụng chống viêm

Trên mô hình gây phù bàn chân chuột bằng carrageenan, cao ethanol chiết từ hạt cần tây liều 250 mg/kg và 500 mg/kg đều có tác dụng ức chế phù bàn chân chuột so với lô chứng tại thời điểm 1 giờ sau khi gây viêm Tỷ lệ ức chế phù của lô thử so với

lô chứng lần lượt là 37,6% và 60,6% [8]

Trên mô hình gây viêm màng hoạt dịch khớp gối bằng tinh thể natri urat, cao ethanol chiết từ hạt cần tây liều 250 mg/kg uống liên tục trong 5 ngày làm giảm triệu chứng viêm so với lô chứng tại thời điểm 4 và 5 giờ sau khi gây viêm (p < 0,01 và p < 0,05) Cao cần tây liều 500 mg/kg uống liên tục trong 5 ngày làm giảm triệu chứng viêm so với lô chứng tại cả ba thời điểm 4; 5 và 6 giờ sau khi gây viêm [8]

Dịch chiết ethanol 70% từ hạt cần tây liều 25 mg/kg, 50 mg/kg và 100 mg/kg đều

có tác dụng ức chế phù bàn chân chuột trên mô hình gây phù bàn chân chuột bằng carrageenan Trong đó, dịch chiết sử dụng với mức liều 100 mg/kg có tác dụng tương đương với aspirin liều 300 mg/kg thể trọng chuột [21]

Dịch chiết nước và hexan từ hạt cần tây với các mức liều 100 mg/kg, 200 mg/kg,

300 mg/kg, 400 mg/kg và 500 mg/kg có tác dụng chống viêm trên mô hình gây phù tai chuột bằng xylen Trong đó, dịch chiết hexan với mức liều 200 mg/kg có tác dụng tương đương với dexamethason liều 15 mg/kg [74]

Một nghiên cứu về kết hợp NSAIDs và dịch chiết từ hạt cần tây cho thấy, khi kết hợp ibuprofen liều 15 mg/kg hoặc ketoprofen liều 1 mg/kg với dịch chiết ethanol từ hạt cần tây có tác dụng ức chế phù bàn chân chuột lần lượt là 61% và 46% Tác dụng này cao hơn rõ rệt so với khi sử dụng đơn độc ibuprofen hoặc ketoprofen với tỉ lệ ức chế lần lượt là 19% và 12% [73]

1.2.3.3 Tác dụng giảm đau

Dịch chiết ethanol từ hạt cần tây liều 500 mg/kg và dịch chiết ethanol đã được tinh chế bằng CO2 siêu tới hạn liều 70 mg/kg có tác dụng giảm đau trên mô hình Randall-Selitto Trong đó, dịch chiết sử dụng với mức liều 70 mg/kg có tác dụng tương đương với ibuprofen liều 200 mg/kg thể trọng chuột [73]

Trên mô hình gây quặn đau bằng acid acetic (phương pháp Koster), cao ethanol chiết từ hạt cần tây liều 250 mg/kg làm giảm số cơn quặn đau của chuột nhắt trắng so

với lô chứng trong khoảng thời gian từ phút thứ 10 đến 15; từ phút 15 đến 20; từ phút

20 đến 25 [8]

1.2.3.4 Tác dụng chống ngưng tập tiểu cầu và kéo dài thời gian đông máu

Dịch chiết ethanol hạt cần tây thể hiện tác dụng ức chế rõ rệt sự ngưng tập tiểu

cầu in vitro gây ra bởi ADP so với mẫu chứng ở nồng độ rất thấp (0,05 mg/ml) (p <

0,05) và ở các nồng độ 0,10 mg/ml; 1,00 mg/ml; 2,00 mg/ml và 3,00 mg/ml dịch chiết hạt cần tây thể hiện tác dụng mạnh hơn dung dịch aspirin 81 µg/ml (p < 0,01) với %

ức chế tương ứng là 54,08%; 63,78%; 67,35% và 72,44% (% ức chế của aspirin 81 µg/ml là 47,88%) [9] Trong đó, apigenin, một hợp chất flavonoid, đóng vai trò quyết định đến tác dụng ức chế ngưng tập tiểu cầu của dịch chiết hạt cần tây [38], [82] Dịch chiết ethanol hạt cần tây ở các nồng độ 6,0 mg/ml; 7,5 mg/ml và 10,0 mg/ml có tác dụng kéo dài thời gian đông máu PT, APTT và TT so với mẫu chứng [9]

1.2.3.5 Tác dụng hạ huyết áp

Dịch chiết n-hexan, methanol và ethanol 80% của hạt cần tây đều có tác dụng

làm giảm huyết áp và tăng nhịp tim so với lô chứng trên chuột Ở mức liều 300 mg/kg,

dịch chiết n-hexan, methanol và ethanol 80% của hạt cần tây làm giảm huyết áp tương

ứng 38, 24 và 23 mmHg, đồng thời làm tăng nhịp tim tương ứng là 60, 25 và 27 nhịp/phút Mức liều được quy đổi cho người trưởng thành nặng 60 kg là 3000 mg [56]

Cơ chế có thể liên quan đến tác dụng chẹn kênh calci của 3-n-butylphthalid (3nB), một thành phần quan trọng trong tinh dầu hạt cần tây [82]

Trong một thử nghiệm lâm sàng trên 30 bệnh nhân tăng huyết áp trung bình và nhẹ, sử dụng dịch chiết hạt cần tây chuẩn hóa chứa 85% 3-n-butylphthalid với mức liều 150mg/ngày trong 6 tuần làm giảm huyết áp tâm thu và huyết áp tâm trương lần lượt 8,2 mmHg và 8,5 mmHg [49]

1.2.3.6 Tác dụng chống ung thư

Hạt cần tây chiết bằng CO2 siêu tới hạn có tác dụng chống ung thư in vitro trên

dòng tế bào Hs746T (ung thư dạ dày) Ở mức liều 300 µg/ml, dịch chiết cần tây ức chế 23,1% quá trình tăng trưởng tế bào Hs746T thông qua tăng cường biểu hiện gen Cx43, một gen đóng vai trò quan trọng trong chu trình tự chết tế bào (apoptosis) [35]

Một số nghiên cứu in vitro và in vivo đã chỉ ra apigenin - một flavonoid có trong

hạt cần tây, có thể kích hoạt chu trình tự chết tế bào apoptosis và/hoặc quá trình tự thực bào autophagy Đây là hai quá trình đóng vai trò then chốt trong việc thúc đẩy và

ngăn chặn sự phát triển của khối u [84]

1.2.3.7 Một số tác dụng khác

Bên cạnh các tác dụng trên, hạt cần tây còn thể hiện một số tác dụng khác như:

hạ lipid máu [50]; cải thiện trí nhớ [25], [85]; chống dị ứng, kháng khuẩn [22], [60]; kháng nấm [51]; chống oxy hóa [20], [87]; chống loét dạ dày [22]; giải độc và bảo vệ gan [27]; hạ đường huyết [86]

1.2.4 Một số sáng chế liên quan đến tác dụng điều trị bệnh gút của hạt cần tây

Tiến hành thu thập thông tin trên các cơ sở dữ liệu sáng chế bao gồm:

+ Cơ sở dữ liệu sáng chế của Tổ chức Sở hữu trí tuệ Thế giới (Patentscope) [99] + Cơ sở dữ liệu sáng chế châu Âu (Espacenet) [100]

+ Cơ sở dữ liệu DigiPat [97] và IPlib [98] của Cục Sở hữu trí tuệ Việt Nam (NOIP)

Kết quả, tính đến thời điểm hiện tại đã có tổng cộng 104 sáng chế (patent) về tác dụng của hạt cần tây được công bố Trong số đó có 17 sáng chế liên quan đến tác dụng điều trị bệnh gút Đáng chú ý hơn cả là các sáng chế:

+ Sáng chế số CN101007015A: Đăng ký bởi tác giả Chen Haisheng và cộng sự

ngày 17/01/2007 về việc ứng dụng flavonoid và coumarin trong hạt cần tây làm thuốc phòng và điều trị bệnh gút [66] Nhóm nghiên cứu đã chiết xuất và tiến hành đánh giá một số tác dụng liên quan đến bệnh gút của dịch chiết ethyl acetat (có thành phần giàu flavonoid và coumarin) của hạt cần tây bao gồm tác dụng hạ acid uric và chống viêm

Kết quả đánh giá tác dụng sinh học như sau

Trên mô hình gây tăng acid uric cấp bằng kali oxonat, dịch chiết ethyl acetat hạt cần tây ở liều 1 g/kg làm giảm nồng độ acid uric trong máu rõ rệt trên chuột so với nhóm chứng (p < 0,05) khi sử dụng liên tục trong 10 ngày

Trên mô hình gây viêm bằng natri urat, dịch chiết ethyl acetat hạt cần tây thể hiện tác dụng ức chế viêm với tỷ lệ giảm độ phù chân chuột là 10,1%

Từ hạt cần tây, Chen Haisheng và cộng sự đã phân lập được 12 flavonoid và 6

coumarin Kết quả đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase (XO) in vitro của 18 hợp

chất cho thấy 3 flavonoid: chrysoerinol, apigenin và luteolin có khả năng ức chế XO mạnh nhất với giá trị IC50 lần lượt là 5,6μM, 9,5μM và 10,5μM Thuốc đối chứng allopurinol có giá trị IC50 là 6,8μM Theo các tác giả, flavonoid có thể là nhóm hợp chất đóng vai trò chính đối với tác dụng hạ acid uric và chống viêm của dịch chiết

ethyl acetat từ hạt cần tây

+ Sáng chế số CN105560262A: Đăng ký bởi tác giả Chen Jijun và cộng sự ngày

04/01/2016 về việc sử dụng graveobiosid A, một flavonoid phân lập từ hạt cần tây làm thuốc phòng ngừa bệnh gút [68] Nhóm nghiên cứu đã đánh giá một số tác dụng liên quan bệnh gút của graveobiosid A bao gồm: tác dụng hạ acid uric, ức chế XO, chống viêm

Kết quả đánh giá tác dụng sinh học như sau:

Trên mô hình gây tăng acid uric cấp bằng kali oxonat, lô chuột uống graveobiosid A có tác dụng làm giảm nồng độ acid uric ở cả 3 mức liều 5, 10, 20 mg/kg với tỉ lệ lần lượt là 34,01%; 34,96% và 36,01% so với lô chứng

Đánh giá khả năng ức chế XO in vitro của graveobiosid A thể hiện thông qua giá

trị IC50 của hợp chất này là 283,17 μM Kết quả đánh giá cũng cho thấy graveobiosid

A ức chế XO theo cơ chế cạnh tranh với cơ chất xanthin tại trung tâm hoạt động của enzym

Trên mô hình gây viêm bằng tinh thể natri urat, graveobiosid A ở 2 mức liều 10,

20 mg/kg có tác dụng làm giảm độ phù chân chuột so với lô chứng lần lượt là 29,23%

và 21,39% (p < 0,01) Trên mô hình gây viêm bằng carrageenan, tỉ lệ này ứng với mức liều 5 mg/kg là 22,33% (p < 0,05); ứng với mức liều 20 mg/kg là 32,13% (p < 0,01)

+ Sáng chế số CN105535048A: Đăng kí bởi tác giả Chen Jijun và cộng sự ngày

04/01/2016 về việc sử dụng dịch chiết từ hạt cần tây làm thuốc điều trị bệnh gút [67] Nhóm nghiên cứu đã chuẩn hóa dịch chiết ethanol 70% của hạt cần tây theo graveobiosid A, sau đó đánh giá các tác dụng của dịch chiết: hạ acid uric, ức chế XO

in vivo và chống viêm

Kết quả đánh giá tác dụng sinh học như sau:

Dịch chiết hạt cần tây cho chuột uống ở các liều 50mg, 100mg, 200mg đều làm giảm nồng độ acid uric trong máu với tỉ lệ giảm so với lô chứng lần lượt là 30,13%;

33,69%; 32,77% (p < 0,01) Tuy nhiên, dịch chiết chỉ ức chế XO in vivo ở mức liều

200 mg/kg với giá trị phần trăm ức chế (I%) là 12,72%

Trên mô hình gây viêm bằng tinh thể carrageenan, dịch chiết hạt cần tây ở 3 mức liều 50, 100, 200 mg/kg có tác dụng làm giảm độ phù chân chuột so với nhóm chứng lần lượt là 22,01%; 29,70% và 26,72% (p < 0,05) Trên mô hình gây viêm bằng acid uric, tỉ lệ này tương ứng là 21,91%; 31,51% và 28,48% (p < 0,01)

1.2.5 Độc tính

Một nghiên cứu về độc tính cấp của cần tây cho thấy cao hạt cần tây với liều cao nhất có thể cho chuột uống được (40 g/kg - gấp 160 lần liều thể hiện tác dụng dược lý) chưa thể hiện độc tính cấp trên chuột nhắt trắng [15]

Nghiên cứu về độc tính bán trường diễn của cần tây của tác giả Powanda M.C được tiến hành trên chuột trong vòng 28 ngày Sử dụng dịch chiết cồn của hạt cần tây với liều tối đa 5000 mg/kg/ngày, kết quả không có biểu hiện độc tính trên 100% số chuột thí nghiệm [72]

1.2.6 Một số sản phẩm điều trị bệnh gút từ hạt cần tây trên thị trường

Một số quốc gia trên thế giới đã có sản phẩm điều trị hoặc hỗ trợ điều trị bệnh gút từ hạt cần tây trên thị trường Có thể kể đến một số thương hiệu như Arthritic Pain Herbal Formula 1 (Mayne Pharma – Mỹ), Celery Plus (Swiss Bio Pharma - Thụy Sĩ), Apium Graveolens (Boiron - Pháp), Thompson celery (Thompson – Úc) với các dạng bào chế đa dạng, linh hoạt từ viên nang, viên nén tới bột, trà [101] Một số sản phẩm đáng chú ý bao gồm:

Solgar Celery Seed Capsules được sản xuất bởi công ty Solgar UK Ltd dưới dạng bào chế viên nang cứng, mỗi viên nang chứa 112mg cao khô từ hạt cần tây và các tá dược vừa đủ

Loạt các sản phẩm Holland & Barret Celery Seed Capsules, GNC Live Well Celery Seed Capsules, Life Cycle Celery Seed Capsules, Nature’s Garden Celery Seed Capsules và Nature’s Bounty Celery Seed Capsules được sản xuất bởi công ty NBTY Europe Limited dưới dạng bào chế viên nang gồm các thành phần bột cao khô cần tây

và tá dược vừa đủ

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Nguyên liệu nghiên cứu

+ Viên nang cần tây là kết quả của đề tài khoa học công nghệ cấp Bộ Y Tế:

“Nghiên cứu quy trình bào chế viên nang cứng tác dụng điều trị bệnh gút từ hạt cần

tây (Semen Apii graveolens L.)”

+ Mỗi viên nang cần tây 500 mg chứa 350 mg cao đặc chiết từ hạt cần tây [14]

và tá dược (avicel, lactose monohydrat, aerosil, starch, talc) vừa đủ

Viên nang đã được chuẩn hóa theo thành phần flavonoid: Hàm lượng flavonoid toàn phần trong viên nang được xác định bằng phương pháp quang phổ hấp thụ tử ngoại và khả kiến, kết quả trong khoảng 3,06 – 3,74% tính theo apigenin

+ Chuẩn bị mẫu nghiên cứu: Cốm trong nang được nghiền mịn và phân tán đều trong Na-CMC 0,5% để tạo hỗn dịch đồng nhất với liều thích hợp cho chuột thí nghiệm uống

2.1.2 Phương tiện nghiên cứu

2.1.2.1 Động vật thí nghiệm

Chuột nhắt trắng chủng Swiss, cả giống đực và giống cái, khỏe mạnh, cân nặng từ

18 - 22 g, do Viện Vệ sinh dịch tễ trung ương cung cấp

Chuột cống trắng chủng Wistar, giống đực, 8 tuần tuổi, khỏe mạnh, cân nặng từ

130 - 150 g, do Học viện Quân y cung cấp

Động vật được nuôi ổn định với điều kiện phòng thí nghiệm ít nhất 5 ngày trước khi thực hiện nghiên cứu, được nuôi dưỡng bằng thức ăn tiêu chuẩn do Viện Vệ sinh dịch tễ trung ương cung cấp, uống nước tự do

+ Bộ hóa chất phân tích huyết học (URIT)

+ Bộ hóa chất xét nghiệm các thông số sinh hóa máu: AST, ALT, glucose, cholesterol toàn phần, protein toàn phần, creatinin (Biosystems)

+ Carrageenan (Sigma Aldrich)

+ Indomethacin (Indomethacin 25 mg; công ty sản xuất: Công ty cổ phần dược phẩm Hà Tây; số lô 690917; hạn dùng: 04/09/2019)

+ Kali oxonat, 97%, dùng cho nghiên cứu và phát triển (Sigma Aldrich)

+ Các hóa chất, dung môi khác đạt tiêu chuẩn dược dụng

2.1.2.3 Thiết bị, máy móc, dụng cụ

+ Máy sinh hóa TC - 3300 plus (Teco Diagnostics USA)

+ Máy phân tích huyết học tự động dành cho động vật thí nghiệm Autohematology analyser URIT-3000 VET Plus

+ Máy đo đau Analgesy-meter (UGO BASILE)

+ Cân phân tích AY 220 (SHIMADZU)

+ Cân kĩ thuật Presica-BJ610C, TE412 (Sartorius)

+ Các dụng cụ sử dụng lấy mẫu và xét nghiệm: dụng cụ thủy tinh, bơm kim tiêm các loại, mao quản, ống nghiệm các loại

2.2 Nội dung nghiên cứu

Để thực hiện hai mục tiêu đã đề ra, đề tài gồm các nội dung sau:

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Thiết kế liều thử tác dụng dược lý

Các mức liều thử của chế phẩm viên nang cần tây được thiết kế dựa vào công bố liên quan đến tác dụng hạ acid uric của cao chiết từ hạt cần tây trên thực nghiệm [8], [63]

+ Liều dự kiến dùng trên người: 3.000 mg/ngày (tính theo khối lượng cốm trong

nang)

+ Liều qui đổi trên chuột nhắt trắng: 600 mg/kg và 1200 mg/kg

+ Liều qui đổi trên chuột cống trắng: 330 mg/kg và 660 mg/kg

Cách dùng: Mẫu thử được dùng theo đường uống, bằng kim đầu tù với thể tích 1 ml/100g chuột

2.3.2 Phương pháp đánh giá tác dụng hạ acid uric huyết thanh, chống viêm, giảm đau thực nghiệm

2.3.2.1 Đánh giá tác dụng hạ acid uric huyết thanh thực nghiệm

• Thiết kế thí nghiệm

Thí nghiệm được thực hiện trên chuột nhắt trắng, giống đực, trưởng thành Chuột được nuôi ổn định trong phòng thí nghiệm và chia ngẫu nhiên thành 4 lô:

+ Lô chứng: Uống dung môi pha thuốc Na-CMC 0,5%

+ Lô đối chiếu: Uống allopurinol liều 10 mg/kg pha trong Na-CMC 0,5%

+ Các lô thử: Uống viên nang cần tây liều 600 mg/kg; 1200 mg/kg pha trong CMC 0,5%

để định lượng acid uric

Kỹ thuật định lượng nồng độ acid uric huyết thanh chuột thực nghiệm: máu chuột sau khi lấy được để lắng tự nhiên trong khoảng 1 giờ ở nhiệt độ phòng rồi đem

ly tâm với tốc độ 3.500 - 4.000 vòng/phút, trong 10 phút Bảo quản huyết tương ở nhiệt độ - 20oC trong thời gian chờ định lượng acid uric máu Định lượng acid uric bằng phương pháp đo quang ở bước sóng 290 nm trên máy sinh hóa TC - 3300 Plus

Hình 2.1 Qui trình đánh giá tác dụng hạ acid uric máu trên mô hình gây tăng acid uric

cấp thực nghiệm bằng kali oxonat

• Thông số đánh giá

Nồng độ acid uric trong huyết thanh chuột thí nghiệm

Tỷ lệ giảm nồng độ acid uric huyết thanh của lô thử so với lô chứng:

Cc, Ct: Nồng độ acid uric huyết thanh của lô chứng, lô thử

I (%): Tỷ lệ giảm nồng độ acid uric huyết thanh của lô thử so với lô chứng

2.3.2.2 Đánh giá tác dụng chống viêm cấp thực nghiệm trên mô hình gây viêm màng hoạt dịch khớp gối bằng tinh thể natri urat

Sử dụng mô hình gây viêm màng hoạt dịch khớp gối bằng tinh thể natri urat của McCarty và Faires [61], [88]

• Chuẩn bị hỗn dịch tinh thể natri urat

Hòa tan 0,4 g (0,01 mol) natri hydroxid trong 400 ml nước cất Thêm 1,68 g (0,01 mol) acid uric Để qua đêm ở nhiệt độ phòng Lọc hút chân không thu được tinh thể, rửa 3 lần bằng nước muối sinh lý lạnh Tạo lại hỗn dịch bằng nước muối sinh lý và tiệt trùng trong nồi hấp Hỗn dịch natri urat thu được cuối cùng có nồng độ 48 mg/ml

• Thiết kế thí nghiệm

Chuột cống trắng, giống đực được nuôi ổn định trong phòng thí nghiệm và được chia ngẫu nhiên thành 4 lô:

+ Lô chứng: Uống dung môi pha thuốc Na-CMC 0,5%

+ Lô đối chiếu: Uống indomethacin liều 10 mg/kg pha trong Na-CMC 0,5% + Các lô thử: Uống viên nang cần tây liều 330 mg/kg và 660 mg/kg pha trong

Na-CMC 0,5%

Thể tích cho chuột uống là 1ml/100g chuột Trước khi dùng thuốc 1,5 giờ, chuột không được ăn nhưng được uống nước bình thường Ngày thứ 5, sau khi uống dung môi, thuốc đối chiếu và chế phẩm thử 1 giờ, chuột được tiêm 0,05 ml hỗn dịch natri urat (nồng độ 48 mg/ml) vào khớp gối sau trái

Quan sát biểu hiện di chuyển của từng chuột trên mặt phẳng tại các thời điểm 4,

5, 6 giờ sau khi tiêm, ghi lại hình ảnh bằng máy quay để hỗ trợ nhận định khi cần thiết

Hình 2.2 Qui trình đánh giá tác dụng chống viêm trên mô hình gây viêm màng hoạt

dịch khớp gối bằng tinh thể natri urat

• Thông số đánh giá

Bảng 2.1 Thang điểm đánh giá mức độ viêm dựa trên triệu chứng [61]

Không thể hiện

rõ triệu chứng

Chuột không có hoặc không thể hiện rõ biểu hiện di

Đi khập khiễng Chuột đi tập tễnh trong toàn bộ thời gian di chuyển, chân

có khớp bị đau vẫn tham gia vào quá trình di chuyển 2

Đi bằng 3 chân

không liên tục

Chuột đi tập tễnh nhưng thỉnh thoảng chân có khớp bị đau không thể tham gia vào quá trình di chuyển, phải kéo lê hoặc co chân

làm thực nghiệm chính thức Kết quả cuối cùng được ghi nhận từ quan sát của 3 quan sát viên độc lập và áp dụng phương pháp cho điểm mù

2.3.2.3 Đánh giá tác dụng giảm đau trên mô hình gây đau do viêm (Randall – Sellito Test)

Sử dụng Randall - Sellito Test để đánh giá tác dụng giảm đau trên mô viêm [7], [89] Dùng máy đo đau Analgesy-meter (UGO BASILE) để xác định ngưỡng đau do lực của từng chuột

• Thiết kế thí nghiệm

Chuột cống trắng, giống đực được nuôi ổn định trong phòng thí nghiệm và được chia ngẫu nhiên thành 4 lô:

+ Lô chứng: Uống dung môi Na-CMC 0,5%

+ Lô đối chiếu: Uống indomethacin liều 10 mg/kg pha trong Na-CMC 0,5% + Lô thử 1, 2: Lần lượt uống viên nang cần tây liều 330 mg/kg và 660 mg/kg pha trong Na-CMC 0,5%

Chuột được uống dung môi pha thuốc hoặc chế phẩm thử vào một giờ nhất định trong vòng 5 ngày trước khi làm thực nghiệm Thể tích cho chuột uống là 1ml/100g chuột Trước khi dùng thuốc 1,5 giờ, chuột không được ăn nhưng được uống nước bình thường Ngày thứ 5, trước khi uống dung môi, thuốc đối chiếu và chế phẩm thử lần cuối cùng, chuột được tiêm 0,1ml carragenan 1% trong nước muối sinh lý vào gan bàn chân sau phải Dùng máy đo đau để xác định ngưỡng đau do lực vào các thời điểm ngay sau khi gây đau (trước khi dùng thuốc) và 4,5 giờ sau khi dùng thuốc

Hình 2.3 Qui trình đánh giá tác dụng giảm đau trên mô hình gây đau do viêm Randall -

Sellito Test

• Thông số đánh giá:

+ Ngưỡng phản ứng đau do lực của từng chuột tại các thời điểm thực nghiệm (g) + Mức tăng ngưỡng phản ứng đau của từng chuột tại các thời điểm (ΔT) tính theo công thức:

ΔT = T−To To

Trong đó:

T: Ngưỡng phản ứng đau sau khi dùng thuốc

T0 : Ngưỡng phản ứng đau tại thời điểm ngay sau khi gây đau

2.3.3 Phương pháp xác định độc tính cấp và độc tính bán trường diễn

2.3.3.1 Phương pháp xác định độc tính cấp

• Thiết kế thí nghiệm

Thử nghiệm được tiến hành trên chuột nhắt trắng, giống cái theo hướng dẫn của

OECD [64], hướng dẫn của Bộ Y Tế [3] và tài liệu Phương pháp xác định độc tính của thuốc [6] Chuột được nuôi ổn định trong điều kiện phòng thí nghiệm

Chia chuột thành các lô, cho chuột trong các lô uống viên nang cần tây pha trong Na-CMC 0,5% với các liều tăng dần

Theo dõi chuột trong vòng 4 - 6 giờ đầu, số chuột chết trong vòng 72 giờ và tiếp tục theo dõi 14 ngày sau khi uống thuốc

• Chỉ tiêu theo dõi

+ Tình trạng chung của chuột: các hoạt động tự nhiên, tư thế, màu sắc (lông, niêm mạc, mắt, mũi, tai, đuôi …), phân, nước tiểu, hiện tượng tiêu chảy, sự tiêu thụ thức ăn, nước uống

+ Xác định tỉ lệ động vật chết ở các lô trong vòng 72 giờ và tiếp tục theo dõi đến ngày thứ 7 sau khi uống thuốc

+ Các động vật chết được mổ quan sát đại thể cơ quan, phủ tạng Nếu cần có thể làm thêm vi thể để xác định nguyên nhân

+ Xác định LD50 (nếu có) bằng phương pháp phân tích hồi qui Probit trên phần mềm SPSS 20.0

2.3.3.2 Phương pháp xác định độc tính bán trường diễn

Thử nghiệm xác định độc tính bán trường diễn với liều nhắc lại 28 ngày trên chuột nhắt trắng, cả 2 giống đực và cái theo hướng dẫn của OECD [65] và hướng dẫn của Bộ Y Tế [3]

• Thiết kế thí nghiệm:

Chuột nhắt trắng được chia ngẫu nhiên thành các lô:

+ Lô chứng: Uống dung môi Na-CMC 0,5%

+ Lô thử 1: Uống viên nang cần tây liều 600 mg/kg pha trong Na-CMC 0,5% + Lô thử 2: Uống viên nang cần tây liều 1800 mg/kg pha trong Na-CMC 0,5% Chuột thí nghiệm được uống dung môi pha thuốc hoặc chế phẩm thử hàng ngày, liên tục trong 28 ngày (1ml/100g chuột) Trong suốt quá trình thử nghiệm, theo dõi tình trạng chung của chuột, hàng tuần cân để theo dõi trọng lượng cơ thể Tại thời điểm kết thúc, lấy máu mắt của từng chuột cho vào hai loại ống nghiệm riêng: ống có chứa chất chống đông để làm các xét nghiệm huyết học và ống không chứa chất chống đông, ly tâm lấy huyết thanh để làm các xét nghiệm hóa sinh Mổ toàn bộ chuột để quan sát đại thể các cơ quan, lấy ngẫu nhiên 3 chuột trong mỗi lô để làm tiêu bản vi thể gan và thận

• Thông số đánh giá:

+ Tình trạng toàn thân: Hàng ngày theo dõi các biểu hiện của động vật thực nghiệm (tình trạng da, lông, mắt, sự tiết dịch mũi, miệng, hô hấp, phân, nước tiểu,…), hoạt động tự nhiên, tư thế, hành vi, sự tiêu thụ thức ăn, nước uống Hàng tuần cân động vật thực nghiệm để theo dõi sự thay đổi khối lượng cơ thể đồng thời điều chỉnh lượng thuốc uống

+ Các thông số huyết học: Số lượng hồng cầu, nồng độ hemoglobin, tỷ lệ hematocrit, thể tích trung bình hồng cầu, số lượng tiểu cầu, số lượng bạch cầu, lượng huyết sắc tố trung bình hồng cầu, nồng độ huyết sắc tố trung bình hồng cầu

+ Các thông số hóa sinh: Hoạt độ transaminase huyết thanh AST, ALT, glucose, cholesterol toàn phần, protein toàn phần, creatinin huyết thanh

+ Đại thể cơ quan: Quan sát cảm quan các cơ quan tim, gan, thận, lách Cân ngay khối lượng các cơ quan và tính tỷ lệ so với 10g khối lượng toàn bộ cơ thể

+ Mô bệnh học: Lấy ngẫu nhiên 30% động vật mỗi lô để làm tiêu bản vi thể gan, thận Sau khi giết động vật thực nghiệm, các mẫu gan và thận được cố định bằng dung dịch Carnoy, vùi trong parafin, cắt các lát mỏng 5-7µm, nhuộm hematoxylin - eosin (HE) và quan sát dưới kính hiển vi quang học để đánh giá cấu trúc hình thái vi thể gan, thận

Cấu trúc hình thái vi thể gan, thận được đánh giá bởi PGS.TS Trần Văn Hợp,