Đánh giá hàm lượng crocin và một số chỉ tiêu an toàn thực phẩm của dịch chiết từ hạt dành dành (gardenia jasminoides j ellis)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ------ Lê Thùy Ngân ĐÁNH GIÁ HÀM LƯỢNG CROCIN VÀ MỘT SỐ CHỈ TIÊU AN TOÀN THỰC PHẨM CỦA DỊCH CHIẾT TỪ HẠT DÀNH DÀNH GARDE

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

- -

Lê Thùy Ngân

ĐÁNH GIÁ HÀM LƯỢNG CROCIN VÀ MỘT SỐ CHỈ TIÊU

AN TOÀN THỰC PHẨM CỦA DỊCH CHIẾT TỪ

HẠT DÀNH DÀNH (GARDENIA JASMINOIDES J ELLIS)

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – 2018

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

- -

Lê Thùy Ngân

ĐÁNH GIÁ HÀM LƯỢNG CROCIN VÀ MỘT SỐ CHỈ TIÊU

AN TOÀN THỰC PHẨM CỦA DỊCH CHIẾT TỪ

HẠT DÀNH DÀNH (Gardennia jasminoides J Ellis)

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Để có thể hoàn thành đề tài luận văn thạc sĩ một cách hoàn chỉnh, bên cạnh

sự nỗ lực cố gắng của bản thân còn có sự hướng dẫn nhiệt tình của quý thầy cô, cũng như sự động viên ủng hộ của gia đình và bạn bè trong suốt thời gian học tập nghiên cứu và thực hiện luận văn thạc sĩ

Tôi xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn đến TS Phạm Thị Lương Hằng, PGS

TS Nguyễn Lai Thành người đã hết lòng giúp đỡ và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi hoàn thành luận văn này Bên cạnh đó, tôi xin gửi lời cảm ơn đến ThS Bùi Thị Vân Khánh và bạn Kiều Trung Kiên đã nhiệt tình hỗ trợ tôi trong quá trình thực hiện các thí nghiệm của đề tài luận văn Tôi xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn đến toàn thể quý thầy cô trong khoa Sinh học và khoa sau đại học trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội đã tận tình truyền đạt những kiến thức quý báu cũng như tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất cho tôi trong suốt quá trình học tập nghiên cứu và cho đến khi thực hiện đề tài luận văn

Tôi cũng xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn đến các cán bộ, học viên, sinh viên của Phòng Thí nghiệm trọng điểm công nghệ Enzym và protein, những người

đã giúp đỡ tôi rất nhiều để thực hiện luận văn này

Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn đến gia đình, các anh chị và bạn bè đã

hỗ trợ cho tôi rất nhiều trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và thực hiện đề tài luận văn thạc sĩ một cách hoàn chỉnh

Hà Nội, ngày 2 tháng 11 năm 2018

Học viên

Lê Thùy Ngân

Kí hiệu Tên Tiếng Anh Tên Tiếng Việt

OECD Organization for Economic

Co-operation and Developme

Tổ chức Hợp tác và Phát triển Kinh

tế

Hình 1: Hoa và quả của cây dành dành (Gardenia jasminoides J.Ellis) 2

Hình 2: Công thức cấu tạo của Tartrazine (E102) 11

Hình 3: Công thức cấu tạo của Sunset Yellow FCF (E110) 11

Hình 4: Một số nguồn nguyên liệu tự nhiên làm phẩm màu thực phẩm 12

Hình 5: Quả dành dành làm nguyên liệu tách chiết 17

Hình 6: Hiệu suất của quá trình chiết hạt dành dành 24

Hình 7: Sắc ký đồ HPLC của dịch chiết dành dành ở các bước sóng 212 nm, 254 nm và 440 nm 25

Hình 8: Phổ hấp thụ của dịch chiết dành dành ở bước sóng từ 200-800 nm 26

Hình 9: Sắc ký đồ mẫu chuẩn crocin ở các bước sóng 212 nm, 254 nm và 440 nm 26 Hình 10: Sắc kí đồ LC-MS của mẫu crocin tham chiếu (A) và dịch chiết (B) tại bước sóng 440 nm 28

Hình 11: Phổ UV của crocin trong mẫu tham chiếu và mẫu thử nghiệm 28

Hình 12: Phổ khối ESI ở trạng thái ion âm của đỉnh chính (P1) trong dịch chiết 30

Hình 13: Phổ khối ESI ở trạng thái ion âm của đỉnh P3 trong dịch chiết 30

Hình 14: Sắc ký đồ HPLC của mẫu chuẩn crocin ở hàm lượng 5µg 31

Hình 15: Sắc ký đồ HPLC của dịch chiết dành dành ở hàm lượng 20µg 32

Hình 16: Đường chuẩn của mẫu chuẩn crocin 33

Hình 17: Hoạt tính chống oxi hóa của dịch chiết dành dành so với axit ascorbic 36

Hình 18: Biểu đồ thể hiện tỷ lệ phôi chết khi phơi nhiễm với dịch chiết dành dành 37 Hình 19: Hình ảnh dị dạng của phôi cá ngựa vằn ở thời điểm 72h khi phơi nhiễm với dịch chiết dành dành nồng độ trên 1g/L 39

Hình 20: Độ hòa tan của bột chế phẩm màu dành dành trong nước 40

Hình 22: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ bền màu của dịch chiết dành dành 41Hình 23: Ảnh hưởng của thời gian bảo quản đến độ bền màu của bột dành dành 42

Bảng 1: Crocin và các dẫn xuất thu được từ cây dành dành G jasminoides 4 Bảng 2: Một số hợp chất iridoid và iridoid glycoside từ cây dành dành G

jasminoides 5

Bảng 3: Chất phụ gia tạo màu tổng hợp được phép sử dụng cho thực phẩm (Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ - FDA) 11Bảng 4: Một số loại phẩm màu tự nhiên thông dụng 13Bảng 5: Số khối của các hợp chất tương ứng với các đỉnh P1-P4 29Bảng 6: Diện tích của các đỉnh P1-P4 trên sắc ký đồ HPLC của mẫu chuẩn tại bước sóng 440 nm 32Bảng 7: Diện tích các đỉnh trong sắc ký đồ của dịch chiết (bước sóng 440 nm) và hàm lượng crocin trong mẫu dịch chiết 34Bảng 8: Kết quả đánh giá các chỉ tiêu vi sinh vật của dịch chiết dành dành 43Bảng 9: Kết quả đánh giá các chỉ tiêu kim loại nặng của dịch chiết dành dành 43

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2

1.1 Đặc điểm sinh học của cây dành dành Gardenia jasminoides J.Ellis 2

1.1.1 Đặc điểm hình thái 2

1.1.2 Phân bố địa lý 2

1.1.3 Phân loại học 3

1.2 Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của hạt dành dành 3

1.2.1 Thành phần hóa học 3

1.2.2 Một số hoạt tính sinh học của các hợp chất từ hạt dành dành G jasminoides 6 1.3 Nghiên cứu ứng dụng dịch chiết từ hạt dành dành làm phẩm màu thực phẩm 8

1.4 Một số phẩm màu thực phẩm đang được sử dụng hiện nay 9

1.4.1 Tầm quan trọng và sự sử dụng phẩm màu thực phẩm trong đời sống 9

1.4.2 Phân loại phẩm màu thực phẩm 10

1.4.3 Những ưu điểm của phẩm màu tự nhiên 14

1.5 Tiêu chí an toàn của các chất được sử dụng làm phẩm màu thực phẩm 15

CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 17

2.1 Nguyên liệu 17

2.1.1 Dịch chiết hạt dành dành 17

2.1.2 Động vật thử nghiệm 17

2.2 Hóa chất và thiết bị 18

2.3 Phương pháp nghiên cứu 18

2.3.1 Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 18

2.3.2 Sắc kí lỏng kết hợp khối phổ (LC-MS) 19

2.3.4 Khảo sát tính an toàn của chế phẩm màu 21

2.3.5 Khảo sát một số tính chất vật lý của chế phẩm 22

2.3.6 Xử lý số liệu 22

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 24

3.1 Phân tích hàm lượng crocin trong dịch chiết từ quả dành dành 24

3.1.1 Chuẩn bị dịch chiết 24

3.1.2 Phân tích thành phần hoá học của dịch chiết bằng HPLC 24

3.1.3 Xác định thành phần crocin bằng LC-MS 27

3.1.4 Xác định hàm lượng crocin trong dịch chiết dành dành 31

3.2 Khảo sát tác dụng chống oxi hoá của dịch chiết dành dành 35

3.3 Khảo sát tính an toàn của chế phẩm màu 36

3.3.1 Đánh giá độc tính của dịch chiết dành dành trên chuột 36

3.3.2 Đánh giá ảnh hưởng lên phát triển của phôi cá ngựa vằn 37

3.4 Khảo sát một số tính chất vật lý của chế phẩm màu vàng 39

3.4.1 Độ hòa tan 39

3.4.2 Khả năng chịu pH 40

3.4.3 Khả năng chịu nhiệt 41

3.4.4 Độ bền màu trong thời gian bảo quản 42

3.5 Đánh giá một số chỉ tiêu an toàn thực phẩm của chế phẩm 42

3.5.1 Đánh giá các chỉ tiêu về vi sinh vật 42

3.5.2 Đánh giá các chỉ tiêu về hàm lượng kim loại nặng 43

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 45

MỞ ĐẦU

Dành dành (Gardenia jasminoides J Ellis) là loài thực vật có nhiều ứng dụng

trong đời sống Quả dành dành được sử dụng như một loại thảo dược trong y học cổ truyền để điều trị các chứng viêm, vàng da, nhức đầu, phù nề, sốt, rối loạn chức năng gan và tăng huyết áp [33] Bên cạnh đó, dịch chiết từ hạt dành dành thường có màu vàng hoặc đỏ cam và đã được sử dụng làm phẩm màu thực phẩm trong các nước Đông Á trong các sản phẩm như mì và bánh kẹo [38]

Phẩm màu thực phẩm có tác dụng tạo màu sắc đẹp cho đồ ăn, đồ uống, tăng giá trị cảm quan, làm tăng cảm giác ngon miệng Việc thay thế các phẩm màu tổng hợp bằng các phẩm màu tự nhiên không những tạo màu sắc hấp dẫn mà còn đem lại lợi ích cho sức khỏe người tiêu dùng Các loại phẩm màu tự nhiên, ngoài giá trị về màu sắc, bản thân chúng còn là các thành phần có hoạt tính sinh học rất tốt cho cơ thể như vitamin, axit hữu cơ, glycozit, protein Ví dụ như phẩm màu từ dịch chiết

hạt dành dành (Gardenia jasminoides J Ellis) có chứa crocin và crocetin, có tác

chống oxy hóa, hạ huyết áp, giảm xơ vữa động mạch, kháng viêm, tác dụng bảo vệ thần kinh, tác động tích cực đến giấc ngủ, giảm căng thẳng mệt mỏi về thể chất và ngăn ngừa thoái hóa võng mạc [9]

Ở Việt Nam, rất nhiều loài cây như lá cẩm, dành dành, đậu biếc được sử dụng để nhuộm màu cho các món ăn truyền thống Tuy nhiên, các chất màu tự nhiên từ những cây này thường được dùng trong đời sống hàng ngày theo kinh nghiệm dân gian mà chưa được đánh giá một cách toàn diện về thành phần và mức

độ an toàn đối với con người Xuất phát từ những thực trạng trên, chúng tôi tiến

hành đề tài nghiên cứu “Đánh giá hàm lượng crocin và một số chỉ tiêu an toàn thực phẩm của dịch chiết từ hạt dành dành (Gardenia jasminoides J Ellis)” Mục

tiêu của đề tài là nhằm tạo được bột phẩm màu vàng có hàm lượng crocin xác định

và đảm bảo được các chỉ tiêu về an toàn thực phẩm

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1 Đặc điểm sinh học của cây dành dành Gardenia jasminoides J.Ellis

1.1.1 Đặc điểm hình thái

Dành dành (Gardenia jasminoides J.Ellis) là dạng cây bụi, cao từ 1-2 m

Thân cây có tiết diện tròn, thân non có màu xanh, thân già có màu nâu đen và có những nốt sần Lá đơn, mọc đối hay mọc vòng 3 Phiến lá hình bầu dục, dài 5-12

cm, rộng 1,5-4 cm, bìa phiến nguyên, màu xanh lục đậm ở mặt trên, nhạt ở mặt dưới Gân lá hình lông chim, nổi rõ ở mặt dưới, gân giữa màu trắng Cuống lá rất ngắn, mặt trên phẳng, mặt dưới lồi, màu xanh Hoa to, mọc riêng lẻ ở ngọn cành hay chỗ phân nhánh của thân Hoa đều, lưỡng tính, mẫu 6, có mùi thơm Cuống hoa nhẵn, ngắn có 6 cạnh lồi, màu xanh Quả mọng, hình thoi, màu vàng cam, có 6 sóng dọc màu vàng xanh Đỉnh quả có 6 lá đài tồn tại Hạt dẹt, nhiều, màu nâu đỏ, kích thước 3 x 2 mm

Hình 1: Hoa và quả của cây dành dành (Gardenia jasminoides J.Ellis) [32]

1.1.2 Phân bố địa lý

Cây dành dành có nguồn gốc ở châu Á và thường được tìm thấy ở Việt Nam, Đông Nam Á, Đài Loan, Nhật Bản và Myanmar Chúng thường phân bố rộng rãi ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới châu Phi và châu Á Ở Việt Nam cây Dành dành mọc khắp các tỉnh đồng bằng và trung du Cây dành dành thường ra hoa từ tháng 5 đến tháng 7 và ra quả trong khoảng thời gian từ tháng 7 đến tháng 10

1.1.3 Phân loại học

Cây dành dành (Gardenia jasminoides J.Ellis) hay còn gọi là chi tử, thuộc

giới Thực vật (Plantae), bộ long đởm (Gentianales), họ Thiến thảo (Rubiaceae), chi

Dành dành (Gardenia) và loài Gardenia jasminoides J Ellis

1.2 Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của hạt dành dành

Hạt dành dành (Gardenia jasminoides J.Ellis) có chứa các thành phần như

iridoids, iridoid glucosides, triterpenoids, axit hữu cơ, và các hợp chất dễ bay hơi Trong đó, các hợp chất geniposide, genipin, gardenoside, crocin và iridiod là các thành phần chính có hoạt tính sinh học được tìm thấy trong loài cây này [36]

1.2.1 Thành phần hóa học

1.2.1.1 Crocin và các dẫn xuất của chúng trong hạt dành dành G jasminoides

Crocin và các dẫn xuất của chúng được chiết xuất từ G jasminoides đã được

xác định là có độc tính thấp, khả năng gây dị ứng thấp, và thân thiện với môi trường

[14] Crocin và crocetin ban đầu được tìm thấy trong nhị hoa nghệ tây Crocus

sativus L Nhị hoa nghệ tây có rất nhiều công dụng đặc biệt là đối với ngành công

nghiệp thuốc nhuộm và dược phẩm Nó cũng có tác dụng dược lý trong một số điều kiện như giúp giảm cân, chữa rối loạn sinh lý và hội chứng tiền mãn kinh [12]

Các dẫn xuất crocin và crocetin là thành phần chính tạo nên màu cam hoặc

đỏ của hạt dành dành và đồng thời cũng là hai thành phần đem lại hoạt tính sinh học cho loại thảo dược này

Crocin I hay còn được gọi là alpha-crocin (β, β ’digentiobiosyl 8, 8’diapocarotene 8, 8’oate hoặc crocetin digentiobioside) có công thức hóa học là

C44H64O24 với khối lượng phân tử là 976,2 Dalton [28] Crocin thuộc nhóm cartotenoid tự nhiên và là hợp chất diester được hình thành từ gốc gentacobiose disaccharide và crocetin axit dicarboxylic

Hiện nay, crocin đang được rất nhiều nhà khoa học nghiên cứu do chúng có nhiều hoạt tính sinh học đáng chú ý Trong vài nghiên cứu trên người và động vật, người ta thấy rằng crocin và crocetin có tác dụng chống oxy hóa, hạ huyết áp, giảm

xơ vữa động mạch, kháng viêm, tác dụng bảo vệ thần kinh, tác động tích cực đến

giấc ngủ, giảm căng thẳng mệt mỏi về thể chất và ngăn ngừa thoái hóa võng mạc [9]

Bảng 1: Crocin và các dẫn xuất thu được từ cây dành dành G jasminoides [36]

1.2.1.2 Iridoid và iridoid glycoside

Iridoid và iridoid glycoside là thành phần rất giàu trong G jasminoides Các

iridoid và iridiod glycoside này bao gồm genipin, geniposide, và gardenoside Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng, geniposide là một trong những hợp chất đem lại rất nhiều lợi ích đối với sức khỏe con người như khả năng kháng viêm, chống trầm cảm [8], các hiệu quả trong điều trị đái tháo đường [35], chống tạo huyết khối [30]

Hàm lượng của iridoid glycoside có thể thay đổi đối với những cây dành dành G

jasminoides được trồng ở những vùng khác nhau

Bảng 2: Một số hợp chất iridoid và iridoid glycoside từ cây dành dành G

8 Bartsioside

1.2.1.3 Axit hữu cơ

Dịch chiết từ hạt dành dành G jasminoides chứa thành phần axit hữu cơ,

chẳng hạn như axit ursolic đã cho thấy khả năng trung hòa axit, hoạt tính chống oxy

hóa, và tác dụng ức chế sự tăng trưởng của Helicobacter pylori (H pylori) Ngoài

ra, axit ursolic còn có hoạt tính gây độc tế bào kháng lại các tế bào ung thư dạ dày AGS và SUN638 [19]

1.2.1.4 Các hợp chất dễ bay hơi

Các hợp chất dễ bay hơi chính trong tinh dầu của G jasminoides là các axit

béo, ketone, aldehyde, este, rượu và các dẫn xuất thơm [10, 31] He và cộng sự đã

báo cáo rằng trong dầu được chiết xuất từ quả dành dành G jasminoides có chứa 16

loại chất chính Axit béo trong của dầu từ quả dành dành chứa thành phần chính là axit linoleic (khoảng 44%), tiếp theo là axit palmitic (khoảng 26,4%) và axit oleic (khoảng 24,6%) [13]

1.2.2 Một số hoạt tính sinh học của các hợp chất từ hạt dành dành G jasminoides

1.2.2.1 Hoạt tính chống oxy hóa

Dịch chiết trong nước và ethanol từ quả dành dành G jasminoides đã được phát hiện là đều có khả năng chống oxy hóa Dịch chiết nước từ hạt dành dành G

jasminoides có hoạt tính quyét gốc tự do đối với DPPH (1,1-diphenyl-2-

picrylhydrazyl), ABTS [axit 2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic), hydroxyl và superoxide với các giá trị IC50 lần lượt là 0,14 mg/mL, 0,21 mg/mL, 1,08 mg/mL, và 1,43 mg/mL; trong khi đó dịch chiết từ etanol có các giá trị IC50 lần lượt là 0,36 mg/mL, 0,39 mg/mL, 1,56 mg/mL, và 1,99 mg/mL Do đó, dịch chiết nước có hoạt tính chống oxy hóa cao hơn so với dịch chiết ethanol Ở nồng độ 20

ppm, hoạt tính chống oxy hóa của crocin tinh khiết có thể so sánh được với chất chống oxy hóa BHA (hydroxyanisole butylated) [17]

1.2.2.2 Hoạt tính kháng viêm

Dịch chiết nước của hạt dành dành thể hiện các đặc tính chống viêm thông qua việc giảm đáng kể sự phosphoryl hóa JNK2/1 (c-Jun N-terminal protein kinase)

và p38 MAPK (mitogen-acivated protein kinase), và giảm sự biểu hiện của COX-2

(cyclooxygenase-2) trong các tế bào BV-2 gây ra do LPS Dịch chiết nước của G

jasminoides được sử dụng trên gan của chuột bị tổn thương do LPS gây ra, bệnh lý

gan đã đáng kể giảm [20]

Geniposide được chứng minh là làm giảm viêm bằng cách ức chế MeCP2 (methyl cytosine binding protein-2) trong chuột bị tổn thương gan cấp tính do CCl4 gây ra và các tế bào THP-1 được xử lý với LPS [21] Geniposide có thể là một thuốc chống viêm tiềm năng để điều trị tổn thương gan cấp tính, tổn thương phổi cấp tính và viêm vú [27]

Crocin có thể ức chế 1 và các hoạt tính của

cyclooxygenase-2, quá trình sản sinh prostaglandin Ecyclooxygenase-2, ức chế phù nề tai do xylen gây ra và phù nề chi do carrageenan gây ra ở chuột [37]

1.2.2.3 Hỗ trợ điều trị trầm cảm

Tinh dầu và geniposide chiết xuất từ G jasminoides được chứng minh là có

hoạt tính chống trầm cảm [31] Genipin đóng vai trò như tác nhân chống trầm cảm thông qua việc điều chỉnh quá trình đường phân (glycolysis), sinh tổng hợp đường (gluconeogenesis) và chuyển hóa lipit của gan [4]

1.2.2.4 Hỗ trợ điều trị tiểu đường

Dịch chiết nước từ hạt G jasminoides cải thiện độ nhạy với insulin trong

chuột kháng insulin gây ra do steroid (steroid-induced insulin-resistant) với liều tối

ưu là 200 mg/kg [6] Geniposide làm giảm bớt sự dung nạp glucose bất thường và chứng tăng insulin máu, đây là những dấu hiệu nhận biết ở bệnh nhân tiểu đường typ 2 do di truyền [18] Geniposide (200 mg/kg và 400 mg/kg) được chứng minh là

tác nhân hạ đường huyết hiệu quả trong chuột tiểu đường, nó làm giảm đáng kể lượng đường, insulin và nồng độ triglyceride trong máu ở chuột tiểu đường [35]

1.2.2.5 Tác động đến hệ tuần hoàn máu

Dịch chiết từ nước nóng của hạt G jasminoides mặc dù không kích thích

tăng sinh tế bào cơ trơn mạch máu trong quá trình nuôi cấy, nhưng lại kích thích có chọn lọc tăng sinh tế bào nội mô, dó đó có thể ngăn ngừa xơ cứng động mạch và

huyết khối [16] Dịch chiết etanol 70% của hạt G jasminoides cho thấy hoạt tính

chống tạo quá trình tạo mạch máu hiệu quả thông qua sàng lọc CAM (chick chorioallantoic membrane) [24]

1.3 Nghiên cứu ứng dụng dịch chiết từ hạt dành dành làm phẩm màu thực phẩm

Sắc tố vàng thu được từ hạt dành dành G jasminoides có độ hòa tan tốt trong

nước và chứa thành phần chính là crocin Trước khi có các nghiên cứu chuyên sâu

về hoạt tính sinh học của dành dành, chúng đã được sử dụng rộng rãi như một loại thảo dược, đồ uống và đặc biệt là được sử dụng làm phẩm màu ở châu Á

Màu vàng tự nhiên từ hạt dành dành đang dần thay thế các loại phẩm màu tổng hợp cũng như phẩm màu vàng từ hoa nghệ tây do có giá thành rẻ hơn nhưng vẫn đem lại hiệu quả tương tự về mặt cảm quan cũng như hương vị cho thực phẩm Crocin là một trong những chất tạo màu tự nhiên từ hạt dành dành được sử dụng rộng rãi để tạo màu cho các thực phẩm như các loại mứt, các loại thạch rau câu, các loại đồ uống không chứa cồn [22] Bên cạnh đó, các nhà nghiên cứu Trung Quốc đã xác định được trong một số sản phẩm nước giải khát, bánh ngọt và mỳ ăn liền được bán tại siêu thị ở Bắc Kinh có chứa chất màu crocin với hàm lượng từ 0,84-4,20 mg/g Tuy nhiên, cũng theo các tiêu chuẩn của Trung Quốc, hàm lượng lớn nhất của crocin được phép trong thực phẩm là 1,50mg/g Do đó, việc sử dụng crocin để làm phẩm màu thực phẩm cũng cần được kiểm soát nghiêm ngặt [34] Ở Việt Nam, phẩm màu từ dành dành thường được sử dụng để làm bánh, đồ xôi, thạch rau câu, bánh ngọt Tuy nhiên, việc sử dụng phẩm màu này mới chỉ là những công thức truyền miệng mà chưa được đánh giá cũng như kiểm soát của Bộ Y tế

Hiện nay tại Việt Nam đã có một vài nghiên cứu khả năng ứng dụng dịch chiết từ hạt dành dành làm phẩm màu thực phẩm Trong đó có nhóm tác giả Nguyễn Thị Thanh Thủy và Nguyễn Thị Hiển đã tiến hành khảo sát phương pháp chiết tách crocin từ quả dành dành và độ bền của chất màu ở các điều kiện khác nhau Hàm lượng crocin được xác định bằng phương pháp đo quang phổ hấp thụ phân tử ở bước sóng 440 nm Kết quả cho thấy quả dành dành là một loại nguyên liệu tiềm năng cung cấp lượng lớn crocin với hàm lượng lên tới 16,04 mg/g với nguyên liệu tươi và 14,63 mg/g với nguyên liệu khô [1] Tuy nhiên, nghiên cứu này mới chỉ xác định được hàm lượng tương đối của crocin thông qua xác định hàm lượng carotenoid trong dịch chiết nhưng chưa xác định được hàm lượng và thành phần cụ thể của các loại crocin trong dịch chiết Cũng trong nghiên cứu này, hiệu suất chiết crocin đạt cao nhất với hệ dung môi ethanol: nước (40: 60, 50: 50, v/v) Mặc dù vậy, để định hướng ứng dụng tạo sản phẩm phẩm màu an toàn cho người sử dụng, dung môi nước được ưu tiên sử dụng hơn nhằm đảm bảo tiêu chí không có dung môi hữu cơ tồn dư trong chế phẩm Crocin bền với nhiệt độ dưới 100ºC trong thời gian 140 phút Bên cạnh đó, crocin còn khá bền trong điều kiện axit yếu, trung tính

và kiềm Tác giả Đào Thị Vui và cộng sự (2001) đã tiến hành nghiên cứu thăm dò độc tính cấp của dịch chiết dành dành, kết quả cũng cho thấy rằng ở liều 6-12g có thể dùng để chữa bệnh an toàn [2] Những nghiên cứu nêu trên gần như mới chỉ dừng lại ở bước nghiên cứu các tính chất và mức độ an toàn của dịch chiết dành dành mà chưa đánh giá một cách tổng thể bao gồm cả các tiêu chí về an toàn thực phẩm nhằm ứng dụng trong sản xuất tạo phẩm màu

1.4 Một số phẩm màu thực phẩm đang được sử dụng hiện nay

1.4.1 Tầm quan trọng và sự sử dụng phẩm màu thực phẩm trong đời sống

Màu sắc là một chỉ tiêu cảm quan quan trọng đối với các sản phẩm thực phẩm Phẩm màu thực phẩm mặc dù không có giá trị về mặt dinh dưỡng nhưng đóng vai trò quan trọng đối với quá trình chế biến thực phẩm vì chúng có những chức năng sau đây:

+ Tăng cường màu sắc tự nhiên vốn có của thực phẩm để thu hút người tiêu dùng

+ Khôi phục lại màu sắc ban đầu của thực phẩm do phẩm màu có thể đã bị biến đổi trong quá trình chế biến, bảo quản, gia nhiệt v.v

+ Khiến một số thực phẩm không màu hoặc màu nhạt trở nên có màu sắc bắt mắt làm tăng giá trị cảm quan của sản phẩm, hấp dẫn các đối tượng người tiêu dùng đặc biệt là các sản phẩm dành cho đối tượng trẻ em như thạch rau câu, nước giải khát

1.4.2 Phân loại phẩm màu thực phẩm

Dựa vào nguồn gốc, phẩm màu thực phẩm được chia làm 3 loại: phẩm màu tổng hợp (hay còn gọi là phẩm màu nhân tạo), phẩm màu vô cơ và phẩm màu tự nhiên Phẩm màu tổng hợp là các phẩm màu được tạo ra bằng các phản ứng hóa học

và không có trong tự nhiên Các phẩm màu tổng hợp thường có độ bền cao, màu sắc bắt mắt, giá thành rẻ nên rất được ưa chuộng Phẩm màu vô cơ là các muối vô cơ có màu sắc, chẳng hạn như đồng (II) sulphat, sắt (III) oxit Các phẩm màu này thường độc hại nên khi sử dụng cần phải rất thận trọng Phẩm màu tự nhiên là các các chất được tách chiết hoặc chế biến từ các nguyên liệu hữu cơ có sẵn trong tự nhiên (thực vật, động vật hoặc các vi sinh vật) Phẩm màu tự nhiên thường có độ an toàn cao đối với sức khỏe con người, nhưng giá thành cao do hiệu suất tách chiết và thu hồi

từ nguyên liệu thấp Trong số ba loại phẩm màu nói trên, hai nhóm phẩm màu được

sử dụng nhiều nhất trong chế biến thực phẩm là phẩm màu có nguồn gốc tổng hợp

và phẩm màu có nguồn gốc tự nhiên

1.4.2.1 Phẩm màu tổng hợp

Phẩm màu tổng hợp được sử dụng phổ biến trong ngành chế biến thực phẩm Tuy nhiên, không phải phẩm màu tổng hợp nào cũng an toàn đối với sức khỏe người tiêu dùng Do vậy, trong quá trình sử dụng phẩm màu tổng hợp cần tuân thủ theo quy định và chỉ dẫn của Bộ Y tế

Trong các phẩm màu tổng hợp nói trên, Tartrazine (E102) và Sunset Yellow FCF (E110) là hai màu thực phẩm được sử dụng rộng rãi nhất và được tiêu thụ nhiều nhất trên thế giới Tuy nhiên, Tartrazine (E102) bị cấm ở Na Uy và Úc vì nó chứa các hợp chất gây ung thư benzidine và 4-aminobiphenyl

Hình 2: Công thức cấu tạo của Tartrazine

(E102)

Hình 3: Công thức cấu tạo của Sunset

Yellow FCF (E110)

Bảng 3: Chất phụ gia tạo màu tổng hợp được phép sử dụng cho thực phẩm (Cục

Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ - FDA) STT Tên thông thường Danh pháp Mã EEC Đặc điểm, màu

sắc

1 Brilliant Blue FCF FD&C Blue No 1 E133 Màu xanh lam

sáng

2 Indigo carmine FD&C Blue No 2 E132 Màu chàm

3 Fast Green FCF FD&C Green No 3 E143 Màu xanh lá cây

6 Erytrosin FD&C Red No 3 E127 Màu cam đỏ

7 Allura Red AC FD&C Red No 40 E129 Màu đỏ

8 Tartrazine FD&C Yellow No

5

E102 Màu vàng chanh

9 Sunset Yellow FCF FD&C Yellow No

6

E110 Màu vàng cam

*Mã EEC (EEC-numbers hay E-numbers) là ký hiệu cho các chất được phép sử dụng làm phụ gia thực phẩm để sử dụng trong Liên minh Châu Âu và Hiệp hội Mậu dịch tự do châu Âu (EFTA)

1.4.2.2 Phẩm màu tự nhiên

Phẩm màu tự nhiên thường là các hợp chất hữu cơ có nguồn gốc từ thiên nhiên Chúng có thể thu được từ lá, quả hay rễ của thực vật, các loại động vật như côn trùng hay các loài vi sinh vật v.v Vì có nguồn gốc từ tự nhiên, nên các phẩm màu này có mức độ độc hại thấp, thường an toàn đối với môi trường và quan trọng nhất là đối với người tiêu dùng Tuy nhiên, cũng phải thừa nhận rằng, các chất tạo màu có nguồn gốc thiên nhiên như vậy thường không bền màu, dễ bị ảnh hưởng bởi các điều kiện nhiệt độ, pH hay ion kim loại Phẩm màu tự nhiên được phép sử dụng trên toàn thế giới, tuy vậy việc cho phép sử dụng ở từng quốc gia cũng có sự khác nhau

Bên cạnh đó, ngoài vai trò là chất tạo màu cho các sản phẩm thực phẩm, các chất này cũng là các nhân tố có lợi cho sức khỏe chẳng hạn như β-carotene là tiền chất của vitamin A rất cần thiết cho phát triển thị giác, đồng thời có khả năng chống oxi hóa, bảo vệ cơ thể chống lại một số bệnh ung thư, bệnh tim mạch; màu vàng curcumin từ củ nghệ có khả năng kháng khuẩn, kháng tế bào ung thư; màu xanh lá cây chlorophyll từ lá cây có khả năng khả năng kích thích hệ miễn dịch, chống viêm, ngăn ngừa ung thư, giải độc gan v.v Một số loại phẩm màu tự nhiên phổ biến được liệt kê trong bảng dưới đây

Hình 4: Một số nguồn nguyên liệu tự nhiên làm phẩm màu thực phẩm

a Lá rau chân vịt (spinach); b Cà rốt; c Củ nghệ; d Bắp cải tím

Bảng 4: Một số loại phẩm màu tự nhiên thông dụng STT Tên thông

thường

Mã EEC*

Màu sắc Đặc điểm

vàng nghệ

Cucurmin có nguồn gốc từ củ nghệ Curcumin có khả năng chống oxy hóa [7], hoạt tính kháng khuẩn, kháng ung thư, phòng ngừa và điều trị một số bệnh như Alzheimer, viêm khớp, ung thư

2 Anthocyanin E163 Màu sắc

phụ thuộc vào độ

pH (màu

đỏ, xanh

lá cây và tím)

Thường có nhiều trong các loại thực vật

có màu sắc đỏ, tím như nho, dâu, đậu đen, bắp cải tím Anthocyanin có khả năng cải thiện thị lực, chống béo phì, kháng khuẩn, chống oxy hóa, kháng ung thư, làm bền vững thành mạch, bảo vệ hệ thần kinh [17]

vàng cam

Riboflavin thường có trong dịch chiết men, gan, thận, cám lúa mì, trứng, thịt, sữa và pho mát

Riboflavin còn được biết đến là vitamin B2, đóng vai trò rất quan trọng trong quá trình chuyển hóa chất béo, carbohydrate, protein Ngoài ra, chúng còn rất cần thiết cho quá trình hình thành tế bào hồng cầu

và sản xuất kháng thể

4 Chlorophyll E140 Màu

xanh lá cây

Chlorophyll là một hợp chất tự nhiên có trong thực vật và tảo Chlorophyll có khả năng kích thích hệ miễn dịch, chống viêm, giảm tình trạng thiếu máu, ngăn ngừa ung thư, làm sạch hệ tiêu hóa, giúp trẻ hóa và bồi bổ cơ thể, giải độc gan,

bình thường hóa huyết áp [15]

đậm (màu caramen)

Caramen là chất tạo màu dạng lỏng, đậm đặc, vị đắng thu được từ phản ứng caramen hóa đường Caramen có khả năng chống oxi hóa [26]

vàng cam đậm

Carotene thường có mặt trong nhiều loài thực vật như cà chua, cà rốt Carotene có các loại đồng phân là α-carotene, β-carotene, γ-carotene Carotene là tiền chất của vitamin A, đóng vai trò thiết yếu trong quá trình phát triển của cơ thể và ảnh hưởng đến chức năng thị giác Ngoài

ra, carotene còn có khả năng chống oxi hóa, bảo vệ cơ thể chống lại một số bệnh ung thư, bệnh tim mạch [29]

*Mã EEC (EEC-numbers hay E-numbers) là ký hiệu cho các chất được phép sử dụng làm phụ gia thực phẩm để sử dụng trong Liên minh Châu Âu và Hiệp hội Mậu dịch tự do châu Âu (EFTA)

1.4.3 Những ưu điểm của phẩm màu tự nhiên

Phẩm màu thực phẩm có rất nhiều ưu điểm nhưng có 3 lý do chính để người tiêu dùng chuyển sang sử dụng phẩm màu tự nhiên đó là:

Màu sắc đa dạng

Nguồn nguyên liệu để sản xuất phẩm màu tự nhiên vô cùng phong phú, do

đó các loại phẩm màu thu được từ chúng cũng có màu sắc rất đa dạng chẳng hạn như màu đỏ cam đậm thu được từ hạt điều màu, màu vàng từ củ nghệ, màu đỏ từ bắp cải tím, màu xanh từ rau cải và màu caramen Nguồn nguyên liệu này luôn có sẵn trong tự nhiên và có thể tái tạo được, do vậy các phẩm màu tự nhiên thu được từ

đó cũng trở nên phổ biến và dễ sản xuất

Sự tiện dụng

Hiện nay, phẩm màu tự nhiên luôn luôn sẵn sàng để cung cấp cho người tiêu dùng Chúng thường được thu nhận và tinh chế để tạo ra sản phẩm tinh khiết, sau đó

được đóng gói để người tiêu dùng ở có thể dễ dàng sử dụng ở nhà Ngoài ra, người tiêu dùng cũng dễ dàng chuẩn bị phẩm màu thực phẩm tự nhiên ngay tại chính gia đình của mình, chẳng hạn như màu vàng có thể được chuẩn bị dễ dàng bằng cách đun sôi nhụy hoa nghệ tây trong nước khoảng mười phút, hoặc màu đỏ có thể thu được dễ dàng từ củ cải đỏ hoặc bắp cải tím

Lợi ích đối với sức khỏe

Một trong những ưu điểm khác của phẩm màu tự nhiên là chúng có nguy cơ thấp trong việc gây ra các bệnh về ung thư hoặc tim mạch Mặc dù chúng cũng có thể là vấn đề đối với một số người bị dị ứng hoặc không dung nạp được phẩm màu thực phẩm, nhưng nhìn chung sự dị ứng như vậy thường là những vấn đề cá nhân và thường không phải là phổ biến Ngoài ra, các loại phẩm màu tự nhiên cũng cung cấp chất dinh dưỡng, chất chống oxy hóa và còn có các tác dụng dược lý khác

1.5 Tiêu chí an toàn của các chất được sử dụng làm phẩm màu thực phẩm

Các chất được sử dụng làm phẩm màu thực phẩm muốn đưa ra thị trường thương mại hóa đều cầu phải đáp ứng các tiêu chuẩn và quy chuẩn kỹ thuật của Việt Nam Quy chuẩn kỹ thuật (QCVN) là quy định về mức giới hạn của đặc tính kỹ thuật và yêu cầu quản lý mà sản phẩm, hàng hoá, dịch vụ, quá trình, môi trường và các đối tượng khác trong hoạt động kinh tế - xã hội phải tuân thủ để bảo đảm an toàn, vệ sinh, sức khoẻ con người; bảo vệ động vật, thực vật, môi trường; bảo vệ lợi ích và an ninh quốc gia, quyền lợi của người tiêu dùng và các yêu cầu thiết yếu khác QCVN 4-10:2010/BYT đã quy định rất cụ thể về phụ gia thực phẩm – phẩm màu Trong quy định ngoài các quy chuẩn kỹ thuật liên quan đến định tính của chất

cò nêu rõ các quy chuẩn kỹ thuật nhằm đảm bảo độ an toàn cho người sử dụng Chẳng hạn như đối với chất curcumin, là một hợp chất màu vàng có nguồn gốc tự nhiên thì mức độ tồn dư dung môi axeton không được quá 30,0 mg/kg, hexan không được quá 25,0mg/kg và methanol, ethanol, isopropanol, ethyl acetat không được quá 50,0 mg/kg Hoặc đối với hợp chất tartrazine, chất màu vàng tổng hợp đang được sử dụng rộng rãi hiện nay thì yêu cầu kỹ thuật đối với các chất hữu cơ ngoài chất màu chứa trong phẩm màu không được quá 0,5% (tổng các axit tetrahydroxysuccinic; axit 4-hydrazinbenzensulfonic; axit 4-Aminobenzensulfonic;

axit 5-Oxo-1-(4-sulfophenyl)- 2-pyrazolin-3-carboxylic; axit 4,4'-Diazoaminodi (axit benzensulfonic)) Ngoài ra, một chỉ tiêu rất quan trong đối với tất cả các phẩm màu là hàm lượng chì không được quá 2,0 mg/kg Bên cạnh những chỉ tiêu này, một

số các chỉ tiêu liên quan vi sinh vật cũng là một tiêu chí đánh giá mức độ an toàn của chế phẩm đối với người tiêu dùng

CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Nguyên liệu

2.1.1 Dịch chiết hạt dành dành

Quả dành dành tươi được thu hái ở Bắc Ninh vào tháng 10 năm 2016, những quả chín có vỏ chuyển sang màu vàng được bóc vỏ để thu hạt và sấy khô Sau đó, dịch chiết dành dành được chuẩn bị bằng cách đun sôi hạt trong nước cất ở 100ºC với thời gian từ 3-5 phút Dịch màu vàng được lọc, sấy khô thành bột và bảo quản ở nhiệt độ 4 ºC

Hình 5: Quả dành dành làm nguyên liệu tách chiết

2.1.2 Động vật thử nghiệm

 Chuột nhắt trắng

Chuột nhắt trắng Swiss, 4-6 tuần tuổi, với trọng lượng trung bình 20-22g được cung cấp bởi Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương được sử dụng để nghiên cứu độc tính cấp của dịch chiết dành dành

Phôi thí nghiệm được thu từ cá bố mẹ vào đầu chu kỳ sáng ở giai đoạn từ 4 -

64 tế bào, được rửa sạch chất bẩn bám trên vỏ và loại bỏ những phôi chết hoặc phát triển bất thường

2.2 Hóa chất và thiết bị

 Hóa chất

 Nước cất

 Nước cất loại ion

 Ethanol (Trung Quốc, Merck)

 Methanol (Trung Quốc, Merck)

 NaOH (Trung Quốc)

 Pipet: 1 ml, 2 ml, 5 ml, 10 ml, pipet thủy tinh, pipet pasteur

 Bình tam giác 250ml, cốc thủy tinh 100 ml, 250 ml

 Ống nhỏ giọt, ống nghiệm thủy tinh, ống eppendorf, ống falcon

 Bình tia, phễu lọc, cối sứ, chày sứ, giấy lọc thường

 Đèn UV, đĩa 24 giếng, tủ lạnh, máy ly tâm, cân, kính hiể n vi

 Hệ thống HPLC (Shimadzu)

 Hệ thống LC-MS (Agilent)

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography- HPLC) là một trong những kỹ thuật sắc ký sử dụng để phân tách một hỗn hợp chất với mục đích xác định, định lượng và phân lập từng thành phân riêng lẻ của hợp

chất Để xác định hàm lượng crocin trong dịch chiết dành dành, mẫu chuẩn và mẫu thử nghiệm (dịch chiết) được phân tích HPLC trong điều kiện giống nhau

 Chuẩn bị mẫu

 Mẫu chuẩn crocin (Sigma) được chuẩn bị ở nồng độ 0,5 mg/mL

 Dịch chiết dành dành được chuẩn bị ở nồng độ 2,0 mg/mL

 Điều kiện chạy HPLC

 Loại thiết bị: Shimazu

 Loại cột Cột: Atlantis C18, 5 µm, hãng Water

 Pha động sử dụng hệ hai dung môi: H2O (kênh A) – MeOH (kênh B)

với độ đặc hiệu phát hiện của khối phổ Sắc ký lỏng (LC) tách các thành phần mẫu

và sau đó đưa chúng vào máy đo khối phổ (MS) Dữ liệu LC-MS có thể được sử dụng để cung cấp thông tin về khối lượng phân tử, cấu trúc, đặc điểm và hàm lượng của các thành phần mẫu cụ thể

 Chuẩn bị mẫu

 Mẫu chuẩn crocin (Sigma) được chuẩn bị ở nồng độ 0,5mg/mL

 Dịch chiết dành dành được chuẩn bị ở nồng độ 2mg/mL

 Điều kiện chạy LC-MS

 Phương pháp này được thực hiện tại Trung tâm tiên tiến về hóa sinh hữu cơ thuộc Viện Hóa sinh biển – Viện Hàn lâm Khoa học Việt Nam

2.3.3 Khảo sát tác dụng chống oxi hoá của dịch chiết dành dành

Về nguyên tắc, các chất chống oxi hóa sẽ trung hòa gốc DPPH bằng cách cho hydro, làm giảm độ hấp thu tại bước sóng cực đại và màu của dung dịch phản ứng nhạt dần, chuyển từ màu tím sang màu vàng nhạt Phương pháp nghiên cứu này được thực hiện dựa trên mô tả của W.Brand-Williams và cộng sự [3] bằng cách

chuẩn bị dung dịch DPPH 0,2M trong ethanol (Merck) sau đó bổ sung 1,0 mL dung dịch này vào 1,0 mL dịch chiết dành dành trong nước cất ở nồng độ 0,005-1 g/L Hỗn hợp được giữ trong bóng tối ở nhiệt độ phòng trong 30 phút trước khi đo độ hấp thụ ở bước sóng 517 nm Sự giảm độ hấp thụ của hỗn hợp phản ứng cho thấy hoạt tính chống oxy hóa của mẫu Các phép đo được thực hiện ba lần Axit ascorbic được sử dụng làm chất chuẩn Tỷ lệ ức chế (phần trăm) được tính theo phương trình sau:

Ức chế (%) = [1- (Ai - Aj) / A0] × 100

Trong đó, A0 là độ hấp thụ của mẫu trắng (DPPH), Ai là độ hấp thụ của mẫu

có chứa DPPH và có nồng độ màu khác nhau Aj là độ hấp thụ của mẫu đối chứng (dịch chiết) Giá trị IC50 được tính toán bằng đồ thị

2.3.4 Khảo sát tính an toàn của chế phẩm màu

2.3.4.1 Đánh giá độc tính trên chuột

18 con chuột nhắt trắng Swiss được chia làm 3 lô, 6 con/lô, trong đó có 1 lô đối chứng và 2 lô thử nghiệm Các con chuột được bỏ đói 16 giờ trước khi cho uống

1 liều duy nhất dịch chiết dành dành Mức liều của dịch chiết dành dành được sử dụng cho chuột là 2,062 mg/kg, 4,125 mg/kg, 8,250 mg/kg, 16,500 mg/kg và 33,000 mg/kg trọng lượng cơ thể (dịch chiết dành dành được pha trong nước cất vô trùng)

Sau khi cho chuột uống dịch chiết dành dành từ 1 đến 2 giờ, cho chuột ăn uống như bình thường và tiếp tục theo dõi trong 72 giờ để xác định số chuột chết trong mỗi lô thử nghiệm, từ đó tính toán giá trị LD50

2.3.4.2 Đánh giá ảnh hưởng lên phát triển của phôi cá ngựa vằn

Dịch chiết của dành dành được pha với nước từ bột màu dành dành theo dải nồng độ: 0,1 g/L, 0,5g/L, 1g/L, 2g/L, 4g/L, 8g/L, 12 g/L để thử nghiệm độc tính với phôi cá ngựa vằn

Quy trình thử độc trên phôi cá ngựa vằn dựa theo hướng dẫn của OECD về thử độc trên đối tượng phôi cá (OECD 236) Phôi cá ngựa vằn sau khi chọn lọc sẽ được chuyển vào đĩa 24 giếng có chứa hóa chất với mật độ 1 phôi/giếng Mỗi giếng

thử nghiệm sẽ được thay mới hóa chất, quan sát, ghi lại tỷ lệ sống chết và các hình thái phôi phát triển bất thường sau mỗi 24 giờ cho tới thời điểm 72 giờ Thử nghiệm được lặp lại ít nhất 3 lần

2.3.5 Khảo sát một số tính chất vật lý của chế phẩm

2.3.5.1 Độ hòa tan

Bột dành dành khô được hòa tan với nước ở các nồng độ 0,1 g/L, 0,4 g/L và 0,8 g/L để tạo thành dung dịch đồng nhất Quan sát mức độ đồng nhất của dung dịch trong điều kiện ánh sáng thường

2.3.5.2 Khả năng chịu pH

Chuẩn bị dịch chiết dành dành trong nước với nồng độ 0,4 g/L NaOH 0,5N

và HCl 0,5N được sử dụng để thay đổi pH của dung dịch mẫu từ 1,0 đến 12,0 Sau

đó, sự thay đổi màu sắc được quan sát và độ hấp thụ của tất cả các mẫu được ghi lại bằng máy quang phổ UV-Vis ở bước sóng 440nm

2.3.5.3 Khả năng chịu nhiệt

Độ bền nhiệt của màu vàng được xác định ở các nhiệt độ khác nhau từ 100°C Ở mỗi nhiệt độ, mẫu được giữ trong nồi cách thủy trong 5 phút Sự thay đổi màu sắc được quan sát và độ hấp thụ của tất cả các mẫu được ghi lại bằng máy đo quang phổ UV-Vis ở bước sóng 440 nm

40-2.3.5.4 Độ bền màu trong thời gian bảo quản

Bột màu dành dành được bảo quản ở 4°C trong 12 tháng và độ hấp thụ được xác định tại tháng 0; 6 và 12 bằng máy đo quang phổ UV-Vis ở bước sóng 440 nm

𝐶 =𝑉Trong đó, C là nồng độ của mẫu (μg/ul), m là hàm lượng chất tan trong mẫu tính (μg) và V là thể tích của mẫu (μl)