Nhận thức về xâm hại tình dục ở trẻ em của học sinh trung học cơ sở trên địa bàn quận Bình Tân

Các chủng vi khuẩn lên men lactic lấy từ phòng thí nghiệm được xác định sự thuần khiết bằng các thử nghiệm sinh lý, sinh hoá và khả năng phân giải lân, sinh IAA, tạo biofilm.. Đồng thời

LĨNH VỰC NGHIÊN CỨU: Nông Lâm Ngƣ Nghiệp

CHUYÊN NGÀNH: Nông Nghiệp

Mã số công trình: ………

(Phần này do BTC cấp thành ghi)

TÓM TẮT CÔNG TRÌNH

Vi khuẩn lên men lactic từ lâu đã được sử dụng trong các loại thực phẩm lên men truyền thống Dù an toàn và có nhiều ứng dụng nhưng những công trình nghiên cứu về ứng dụng trong bảo quản nông sản vẫn còn rất ít

Các chủng vi khuẩn lên men lactic lấy từ phòng thí nghiệm được xác định sự thuần khiết bằng các thử nghiệm sinh lý, sinh hoá và khả năng phân giải lân, sinh IAA, tạo biofilm Sau đó tiến hành khảo sát sự phát triển trên các môi trường khác nhau và chọn ra được môi trường bắp cải bổ sung 12g/L glucose và 15g/L peptone để nuôi cấy

thay thế với khả năng kháng nấm Aspergillus sp CĐP1 tương đương trên MRS Broth,

xấp xỉ 42.61% và vượt trội hơn đối chứng Daconil 0.5g/L là 26.85% Đồng thời các khả năng sinh IAA, phân giải lân và tạo biofilm vẫn được duy trì trên môi trường Nước bắp cải với sinh khối phát triển bằng 90% trên MRS Broth

Hạt đậu phộng được ngâm trong ba công thức phối trộn với tỉ lệ L5:L2N:L3 lần lượt là: 1:1:1 – không gia nhiệt – không trung hoà pH; 1:1:2 – không gia nhiệt – không trung hoà và 1:2:1 – gia nhiệt 100°C trong 3 phút – trung hoà pH 6 trong vòng 15 phút

có bổ sung 0.1% Tween 80 cho kết quả bảo quản hạt ở điều kiện in vitro hơn 30 ngày, trong khi đối chứng Daconil bắt đầu xuất hiện nấm mốc ở ngày 21, chứng tỏ tác nhân

ức chế nấm mốc không phụ thuộc vào pH, ngoài trừ acid hữu cơ, các hợp chất protein thì còn những tác nhân khác, mà có thể là hợp chất thứ cấp

Bên cạnh đó, các công thức còn giúp gia tăng độ khoẻ của mầm, tỉ lệ nảy mầm, tuy nhiên không khác biệt về ý nghĩa thống kê và chiều dài thân; rễ;cây, khối lượng thân; rễ; cây so với đối chứng Daconil có khác biệt về ý nghĩa thống kê

Nghiên cứu đã cho thấy khả năng ứng dụng của vi khuẩn lên men lactic trong bảo quản và giúp phát triển hạt đậu phộng Từ đó đề xuất ra quy trình sản xuất chế phẩm kích thích tăng trưởng và bảo quản hạt từ ba chủng vi khuẩn lên men lactic

Lactobacillus sp L5, Lactobacillus sp L2N và Lactobacillus sp L3

MỤC LỤC

MỤC LỤC iii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT iv

DANH MỤC BẢNG v

DANH MỤC HÌNH ẢNH vi

MỞ ĐẦU 1

1 Đặt vấn đề 1

2 Tình hình nghiên cứu 2

2.1 Ngoài nước: 2

2.2.Trong nước: 3

3.Mục đích nghiên cứu: 3

4.Mục tiêu nghiên cứu: 3

5 Nội dung nghiên cứu: 3

6 Phương pháp nghiên cứu: 4

6.1.Phương pháp luận: 4

6.2.Phương pháp xử lý số liệu: 4

7 Kết quả đạt được: 4

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 5

1 Tổng quan về xử lý hạt giống: 5

1.1 Giới thiệu chung: 5

1.2 Các phương pháp khử nhiễm độc tố: 6

1.2.1 Phương pháp vật lý: 6

1.2.2 Phương pháp hóa học: 9

1.2.3 Phương pháp sinh học: 9

2 Các vi sinh vật hỗ trợ tăng trưởng cây trồng: 12

2.1 Khả năng phân giải lân: 12

2.1.1 VSV phân giải lân hữu cơ 13

2.1.2 VSV phân giải lân vô cơ 14

2.2 Tạo màng sinh học biofilm 15

2.3 Khả năng sinh Indole-3-acetic acid (IAA) 17

3 Tổng quan về vi khuẩn lactic 19

3.1 Đặc điểm hình thái giống Lactobacillus sp 19

3.2 Đặc điểm sinh lý 20

3.3 Đặc điểm sinh hóa 20

3.4 Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn lactic 21

3.5 Quá trình trao đổi chất 23

3.6 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men, quá trình sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn lactic 28

3.7 Khả năng kháng nấm của vi khuẩn lactic 29

3.7.1 Khả năng kháng nấm của các chủng vi khuẩn lactic 29

3.7.2 Các hợp chất kháng nấm 30

3.7.3 Các hợp chất kháng khuẩn khác 37

3.8 Ứng dụng của vi khuẩn lactic 40

CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 42

2.1 Địa điểm nghiên cứu 42

2.2 Thời gian thực hiện 42

2.3 Vật liệu nghiên cứu 42

2.3.1 Vật liệu 42

2.3.2 Hóa chất sử dụng 42

2.3.3 Thiết bị 43

2.3.4 Dụng cụ 43

2.4 Phương pháp luận 44

2.4.1 Mục tiêu đồ án 44

2.4.2 Nội dung 44

2.5 Phương pháp nghiên cứu 45

2.5.1 Sơ đồ nghiên cứu 45

2.5.2 Khảo sát độ thuần khiết của vi khuẩn lactic 46

2.5.2.1 Nhuộm gram 47

2.5.2.2 Nhuộm bào tử 48

2.5.2.3 Thử nghiệm Catalase 49

2.5.2.4 Thử nghiệm khả năng lên men đường 49

2.5.2.5 Khả năng di động 50

2.5.3 Khả năng phân giải lân 51

2.5.4 Khả năng sinh IAA 52

2.5.5 Khả năng tạo màng Biofilm 53

2.5.6 Chủng nấm mốc Aspergillus sp CĐP1 54

2.5.6.1 Khảo sát sự phát triển trên các loại môi trường 55

2.5.6.2 Khảo sát hình thái 55

2.5.7 Khảo sát khả năng đối kháng trực tiếp của vi khuẩn lactic với nấm mốc Aspergillus sp CĐP1 56

2.5.8 Phương pháp khảo sát môi trường lên men thích hợp cho vi khuẩn lactic 56

2.5.9 Xác định acid lactic 57

2.5.10 Xác định mật độ vi khuẩn 57

2.5.11 Phương pháp khảo sát khả năng bảo quản hạt giống khỏi nấm mốc Aspergillus sp CĐP1 60

2.5.12 Khảo sát ảnh hưởng của dịch nuôi cấy chủng Lactobacillus sp L5, L3, L2N đối với sự phát triển của hạt giống 68

2.5.12.1 Khảo sát ảnh hưởng của dịch nuôi cấy chủng Lactobacillus sp L5, L3, L2N đối với sự nảy mầm của hạt 68

2.5.12.2 Ảnh hưởng của vi khuẩn Lactobacillussp L5, L3, L2N đến độ khỏe mầm ở cây đạu phộng 69

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 70

3.1 Khảo sát sinh lý – sinh hoá của chủng vi khuẩn lactic: 70

3.1.1 Quan sát hình thái khuẩn lạc: 70

3.1.2 Nhuộm Gram: 71

3.1.3 Nhuộm bào tử: 71

3.1.4 Thử nghiệm Catalase: 72

3.1.5 Thử nghiệm tính di động: 73

3.1.6 Thử nghiệm lên men các loại đường 74

3.2 Khảo sát sự phát triển của chủng nấm Aspergillus sp CĐP1 76

3.3 Khảo sát môi trường lên men thích hợp 78

3.3.1 Khảo sát khả năng sinh acid lactic và mật độ tế bào của các chủng Lactobacillus spp L5, L2N, L3 79

3.3.2 Khảo sát khả năng tạo màng sinh học biofilm của các chủng Lactobacillus spp L5, L2N, L3 83

3.3.3 Đánh giá khả năng phân giải lân của các chủng Lactobacillus spp L5, L2N, L3 86

3.3.4 Đánh giá khả năng sinh IAA của các chủng Lactobacillus spp L5, L2N, L3. 91

3.3.5 Đánh giá khả năng kháng nấm invitro của các chủng vi khuẩn lactic 93

3.5.6 Khảo sát khả năng bảo quản hạt đậu phộng 96

3.3.7 Khảo sát ảnh hưởng của dịch nuôi cấy Lactobacillus sp L5, L2N, L3 tới sự phát triển của hạt giống 100

3.3.7.1 Ảnh hưởng của dịch nuôi cấy Lactobacillus sp L5, L2N, L3 tới khả năng phát triển của cây đậu phộng 7 ngày sau nảy mầm 100

3.3.7.2 Khảo sát khả năng ảnh hưởng của dịch nuôi cấy Lactobacillus sp L5, L2N, L3 tới cây đậu phộng 14 ngày sau nảy mầm 104

CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 110

4.1 Kết luận 110 4.2 Kiến nghị 110 TÀI LIỆU THAM KHẢO 111

EPS Extracellular polymeric substance

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1: Các cơ chế khử nhiễm sinh học bằng một số chủng vi khuẩn 10

Bảng 1.2: Một số sản phẩm chuyển hóa của LAB và phương thức hoạt động 27

Bảng 1.3: Một số hợp chất tiềm năng kháng nấm mốc và nấm men 30

Bảng 1.4: Cơ chế kháng nấm của một số hợp chất 34

Bảng 1.5: Một số bacteriocins được sử dụng rộng rãi (M P Zacharof, 2012) 38

Bảng 1.6: Khả năng đối kháng của các sản phẩm biến dưỡng vi khuẩn LAB 39

Bảng 2.1: Bố trí thí nghiệm bảo quản trong chai 67

Bảng 3.1 Khả năng lên men đường của các chủng L5, L3, L2N 75

Bảng 3.3 Thống kê xếp hạng OD 550nm của các chủng vi khuẩn lactic 84

Bảng 3.3 Khả năng phân giải lân của ba chủng vi khuẩn lactic ở ngày 3 90

Bảng 3.4: Hàm lượng IAA do 3 chủng vi khuẩn tổng hợp 92

Bảng 3.5: Tỷ lệ ức chế của 3 chủng vi khuẩn trên các loại môi trường với chủng nấm mốc theo phương pháp cấy 2 đường vi khuẩn 94

Bảng 3.6: Ngày xuất hiện tơ nấm trong thí nghiệm bảo quản hạt đậu phộng 98

Bảng 3.7: Thành phần các nghiệm thức ngâm đậu phộng 100

Bảng 3.8: Tỷ lệ nảy mầm và độ khoẻ mầm trên các nghiệm thức của đậu phộng 101

Bảng 3.9: Ảnh hưởng của dịch nuôi cấy vi khuẩn đến chiều dài và sinh khối rễ, thân 7 ngày sau nảy mầm 103

Bảng 3.10: Ảnh hưởng của dịch nuôi cấy đối với chiều dài của cây đậu phộng sau 14 ngày nảy mầm 104

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1: Một số loại auxin phổ biến 18

Hình 1.2: Con đường lên men Glucose 26

Hình 1.3: Cấu trúc phân tử của các hợp chất kháng nấm 33

Hình 2.1: Sơ đồ nghiên cứu 45

Hình 2.2: Sơ đồ khảo sát độ thuần khiết của vi khuẩn lactic 46

Hình 2.3: Sơ đồ khảo sát khả năng phát triển của chủng nấm CĐP1 53

Hình 2.4: Sơ đồ khảo sát khả năng đối kháng trực tiếp của vi khuẩn lactic với nấm mốc Aspergillus sp CĐP1 55

Hình 2.5: Sơ đồ xác định mật độ vi khuẩn 58

Hình 2.6: Sơ đồ khảo sát khả năng bảo quản hạt giống khỏi nấm mốc Aspergillus sp CĐP1 60

Hình 2.7: Sơ đồ khảo sát ảnh hưởng của dịch nuôi cấy chủng Lactobacillus sp L5, L3, L2N đối với sự phát triển của hạt giống 68

Hình 3.1: Hình thái khuẩn lạc các chủng Lactobacillus spp trên môi trường MRS agar 70

Hình 3.2: Kết quả nhuộm gram của các vi khuẩn 71

Hình 3.3: Kết quả nhuộm bào tử của các vi khuẩn 72

Hình 3.4: Thử nghiệm catalase chủng vi khuẩn Lactobacillus sp L5 73

Hình 3.5: Thử nghiệm tính di động của chủng Lactobacillus sp L5 và chủng vi khuẩn đối chứng Bacillus subtilis 74

Hình 3.6: Khả năng lên men các loại đường của vi khuẩn 75

Hình 3.7: Khả năng phát triển của chủng nấm Aspergillus sp CĐP1 trên môi trường MRS Agar cải tiến 77

Hình 3.8: Hình thái nấm nấm Aspergillus sp CĐP1 78

Hình 3.9: Biểu đồ thể hiện mật độ tế bào của chủng vi khuẩn lactic sp L5 79

Hình 3.10: Biểu đồ thể hiện mật độ tế bào của chủng vi khuẩn lactic L2N 80

Hình 3.11: Biểu đồ thể hiện mật độ tế bào của chủng vi khuẩn lactic L3 80

Hình 3.12: Hàm lượng acid tổng của chủng L5 trên các môi trường 81

Hình 3.13: Hàm lượng acid tổng của chủng L2N trên các môi trường 82

Hình 3.14: Hàm lượng acid tổng của chủng L3 trên các môi trường 82

Hình 3.15: Biểu đồ đánh giá khả năng tạo màng biofilm của ba chủng vi khuẩn lactic trên các môi trường 84

Hình 3.16: Vi khẩn tạo màng biofilm trên thành ống nghiệm 86

Hình 3.17: Khả năng phân giải lân của chủng vi khuẩn lactic L5 87

Hình 3.18: Khả năng phân giải lân của chủng vi khuẩn lactic L2N 88

Hình 3.19: Khả năng phân giải lân của chủng vi khuẩn lactic L3 89

Hình 3.20: Biều đồ so sánh khả năng phân giải lân tổng cộng của ba chủng vi khuẩn lactic trên 3 môi trường theo ngày 89

Hình 3.21: Biểu đồ thể hiện khả năng phân giải lân của ba chủng vi khuẩn lactic trên ba môi trường ở ngày 3 90

Hình 3.22 Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy lên khả năng sinh IAA của 3 chủng vi khuẩn 92

Hình 3.23: Khả năng kháng nấm của chủng vi khuẩn trên môi trường khác nhau 94

Hình 3.24: Biểu đồ thể hiện tỷ lệ kháng nấm của 3 chủng vi khuẩn trên 3 môi trường khác nhau 95

Hình 3.25: Hình ảnh bảo quản đậu phộng trong chai sau 25 ngày 97

Hình 3.26: Cây đậu phộng 7 ngày sau nảy mầm 101

Hình 3.27: Tỷ lệ nảy mầm và độ khoẻ của mầm trên các nghiệm thức của hạt đậu phộng 102

Hình 3.28: Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của dịch nuôi cấy vi khuẩn của 3 nghiệm thức TN1-TN1, TN3-NT8 và TN1-NT12 đến chiều dài và sinh khối rễ, thân 7 ngày sau nảy mầm 103

Hình 3.29: Đồ thị biểu thị ảnh hưởng dịch nuôi cấy của 3 nghiệm thức NT1, NT12, TN3-NT8 cây đậu phộng 14 ngày sau nảy mầm 105 Hình 3.30: Cây đậu phộng 14 ngày sau nảy mầm 106

TN1-MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Vệ sinh an toàn thực phẩm đang là vấn đề xã hội cần giải quyết kịp thời để bảo vệ sức khoẻ con người Ở nước ta, với đặc điểm khí hậu nhiệt đới nóng ẩm, độ ẩm trong không khí thường cao, là điều kiện rất thuận lợi cho nấm mốc phát triển gây nhiễm độc

tố cho thực phẩm và thức ăn chăn nuôi, gây độc cho người và gia súc, gây tổn thương gan (ung thư gan…) Tình trạng phơi nhiễm của nấm mốc ảnh hưởng đến 25 % mùa màng trên toàn thế giới, làm tổn thất trung bình 418 triệu đô và ảnh hưởng trên gia súc

472 triệu đô mỗi năm (theo Bô Nông Nghiệp Mỹ, 2009) Tại Việt Nam, mỗi năm bị ảnh hưởng khoảng 13-16 % lượng nông sản tuỳ loại

Trong quá trình sinh trưởng và phát triển trên nông sản (được bảo quản trong kho tàng , bao bì ), nấm mốc làm giảm nghiêm trọng chất lượng của các loại nông sản được bảo quản Nhiều loài nấm mốc phát triển trên nông sản (thóc, ngô, lạc, đậu tương ) làm cho sản phẩm nông nghiệp biến đổi màu sắc, mùi vị, giảm chất lượng, đặc biệt là các chất dinh dưỡng như tinh bột, đường, protein, acid amin, lipid, vitamin

và các khoáng chất Nấm mốc làm thối rữa các sản phẩm nông nghiệp như hoa quả, rau, hạt ngũ cốc và tạo điều kiện cho nhiều loại vi khuẩn khác phát triển và gây hại làm ảnh hưởng đến chất lượng hạt, sản lượng thu hoạch và gây thiệt hại cho người sử dụng Bên cạnh sử dụng các biện pháp trong lúc trồng trọt như canh tác ruộng đất, bón phân, phun thuốc, thì một trong những xu hướng hiện nay là xử lý hạt giống Xử lý nguồn bệnh tồn tại trên hạt giống trước khi gieo trồng là một trong những điều quan trọng trong việc đảm bảo chất lượng hạt giống, vừa tăng khả năng chống chọi của hạt khỏi những tác nhân gây bệnh, ngăn ngừa nguồn bệnh lan truyền từ hạt sang đồng ruộng, vừa làm tăng sản lượng thu hoạch có lợi cho người nông dân, góp phần phát triển nền nông nghiệp bền vững, không ảnh hưởng môi trường

Xử lý hạt giống bằng hóa chất ngày nay được sử dụng rộng rãi để phòng trừ sâu bệnh hại cây trong nông nghiệp với những ưu điểm tác dụng nhanh, tương đối đơn giản, đem lại hiệu quả kinh tế cao,…nhưng các hợp chất hóa học dần có những yếu điểm độc hại với môi trường gây ô nhiễm đất, nguồn nước và không khí, hình thành các loài kháng thuốc, ảnh hưởng đến quần thể sinh vật và đăc biệt ảnh hưởng đến sức khỏe con người Do đó, các hợp chất sinh học được thay thế mang lại hiệu quả và thân thiện, an toàn với môi trường đặc biệt các hợp chất sinh học từ các loài vi sinh vât Một trong những chủng được nghiên cứu và ứng dụng nhiều nhất chính là các chủng sinh acid lactic Vi khuẩn dạng này có hoạt tính sinh học khá cao, an toàn, có khả năng tiêu diệt vi sinh vật có hại và là nguồn vi sinh vật hữu ích, duy trì hệ cân bằng vi khuẩn đường ruột Nhận thấy đây là những lý do cần thiết cho đời sống của con người và đó

là lý do chúng tôi thực hiện đề tài “Ứng dụng vi khuẩn lên men lactic xử lý hạt giống

“Khả năng kháng nấm của 2 chủng Lactobacillus plantarum với mốc Fusarium in

vitro và trong nấu mạch nha lúa mạch” của A Laitila và công sự (2002)

Năm 2004, Cassandra De Muynck và công sự nghiên cứu “Khả năng kháng nấm của vi khuẩn sinh acid lactic trong sản xuất hợp chất kháng nấm trong thực phẩm” Kim Jeong Dong với “Nghiên cứu hoạt động kháng nấm của vi khuẩn lactic phân

lập từ kimchi kháng Aspergillus fumigatus” năm 2005

R Muñoz và cộng sự với nghiên cứu “Ngăn cản sự sản xuất độc tố của Aspergillus nomius vsc 23 của vi khuẩn sinh acid lactic và Saccharosemyces cerevisae” năm 2010

“Độc tố aflatoxin bị ức chế bởi các vi khuẩn lactic như Lactobacillus casei có hoạt động mạnh chống sự phát triển của nấm và sự nảy mầm của bào tử nấm” Kim, 2005

xạ khuẩn Streptomyces ưa ấm sinh tổng hợp mạnh các enzym ngoại bào, có khả năng

sinh kháng sinh ức chế nấm mốc, vi khuẩn Gram âm

“Khả năng giảm hàm lượng Aflatoxin từ nấm mốc của vi khuẩn lactic và nấm

Trichoderma” của Lương Thị Phương Thảo (2015)

Chế phẩm vi sinh SB2 của công ty Công nghệ Cát Tường có công dụng phòng trừ tác nhân gây bệnh cho cây trồng như nấm, vi khuẩn, virus, xạ khuẩn,…

Vi khuẩn lactic chưa được ứng dụng rộng rãi trong xử lý hạt giống trong các nghiên cứu trong nước ta hiện nay

3 Mục đích nghiên cứu:

Nghiên cứu, ứng dụng vi khuẩn lên men lactic tạo chế phẩm sinh học bảo quản và

xử lý hạt giống

4 Mục tiêu nghiên cứu:

Khảo sát khả năng dịch nuôi cấy của vi khuẩn Lactobacillus sp L5, L3, L2N trong

bảo quản và phát triển của hạt đậu phộng

5 Nội dung nghiên cứu:

Hoạt hoá chủng vi khuẩn Lactobacillus sp L5, L2N, L3 và chủng nấm Aspergillus

Khảo sát môi trường lên men thích hợp của chủng Lactobacillus sp L5, L2N, L3 Ứng dụng dịch nuôi cấy của vi khuẩn Lactobacillus sp L5, L2N, L3 trong bảo quản

và xử lý hạt đậu phộng

Xây dựng quy trình sản xuất hạt giống đã xử lý

6 Phương pháp nghiên cứu:

6.1 Phương pháp luận:

Để ứng dụng vi khuẩn lactic xử lý hạt giống đậu phộng thay cho chất hóa học, vi khuẩn lactic có nguồn phân lập từ thực phẩm lên men truyền thống được khảo sát tuyển chọn theo khả năng sinh acid, tạo sinh khối, tạo màng biofilm, đối kháng nấm, phân giải lân và sinh hoocmon tăng trưởng thực vật IAA Đồng thời ảnh hưởng của các môi trường lên men lên các tính chất này cũng được khảo sát Sau khi chọn được môi trường lên men thích hợp, thí nghiệm xử lý hạt đậu phộng và nảy mầm được tiến hành

để so sánh độ khỏe mầm của hạt đậu phộng xử lý và không xử lý

Hiện nay trên thị trường có rất nhiều loại thuốc xử lý hạt giống với nhiều thương hiệu khác nhau của các công ty thuốc BVTV Nông dân bắt đầu làm quen với lợi ích của việc xử lý hạt giống trong bảo vệ cây trước sự tấn công của sâu bệnh, côn trùng, vi khuẩn, nấm gây hại

Trước kia việc xử lý giống chỉ có mục đích duy nhất là giúp giữ giống không bị nấm bệnh hại tấn công Các hạt giống được áo các loại thuốc trừ nấm như captan, thiram hay là carbendazim để trừ nấm bệnh trên bề mặt hạt giống Sau đó hạt giống này được nhuộm phẩm màu đỏ để cảnh báo người tiêu dùng không được sử dụng làm thực phẩm Nhưng carbendazim cùng một số hoạt chất khác bị cấm sử dụng hiện nay

vì là hoạt chất hóa học có độc tính cao, với nhiều tác động tới môi trường, hệ sinh thái cũng như sức khỏe con người

Thuốc trừ nấm bảo vệ hạt giống đang nảy mầm và tránh khỏi bị sâu bệnh trong đất tấn công, giúp tăng tỷ lệ nảy mầm, mọc đều ngay cả trong điều kiện bất lợi như thiếu hoặc thừa nước Lợi ích của xử lý hạt giống:

- Giúp hạt giống nảy mầm nhanh, bắt rễ sớm

- Giúp hình thành nốt sần ở cây họ đậu

- Tiệt kiệm lượng thuốc và công lao động trên cùng đơn vị diện tích so với phân bón gốc và phân bón lá

- Dễ áp dụng hơn phân bón gốc và phân bón lá, chỉ trộn thuốc xử lý hạt với giống gieo sạ

Việc xử lý hạt giống còn mở ra nhiều triển vọng mới như :

Tăng cường tính kháng bệnh: Kích thích tính kháng bệnh ở cây trồng (kích kháng)

là phương pháp giúp cho giống cây bị nhiễm bệnh trở nên có khả năng kháng bệnh ở mức độ nào đó sau khi được xử lý chất kích kháng Kích kháng không tác động trực tiếp lên mầm bệnh mà nó kích thích quá trình tự vệ của cây trồng Chất kích kháng có thể có nguồn gốc hóa học hoặc vi sinh vật

Tăng cường chịu điều kiện bất lợi: Các vi khuẩn sống vùng rễ lúa cố định đạm

như Azospirillum lipoferum, Azospirillum lipoferum; vi khuẩn Pseudomonas sp, Baccilus sp đều kích thích khả năng tổng hợp các chất điều hòa sinh trưởng thực vật

như Auxin và Gibberelin giúp bộ rễ cây trồng phát triển tốt hơn, gia tăng diện tích tiếp xúc của rễ với đất Các vi khuẩn này vừa tăng cường cung cấp dinh dưỡng cho cây trồng, vừa tăng cường chống chịu điều kiện bất lợi

Các chất ly trích thực vật như Lychnis viscaria, xoan Melia azedarach đều có tác dụng kích hoạt tăng cường cây trồng chống chịu điều kiện bất lợi khi gieo sạ như ngập úng, hạn hán…

Phòng trừ sâu bệnh: Đây là xu thế phổ biến hiện nay của phần lớn các sản phẩm xử

lý hạt giống trên thị trường Điển hình là thuốc xử lý hạt giống Cruiser có chứa chất Thiamethoxam là hoạt chất chuyên trên rầy nâu và bọ trỉ, chất Defenoconazole thuốc trừ nấm phổ rộng ức chế tổng hợp màng tế bào nấm, chất Fludioxonil là hoạt chất trừ nấm trên hạt không lưu dẫn, chủ yếu trên bệnh lúa von

Ngoài ra còn có Gaucho chứa hoạt chất imidacloprid là thuốc trừ sâu ức chế thần kinh trừ bọ trỉ, rầy nâu Sunato chứa hoạt chất Fipronil là thuốc trừ sâu thuộc nhóm phenylpyrazole bảo vệ lúa 7-14 ngày sau khi sạ, cùng với Isotianil là thuốc trừ sâu thuộc nhóm Cloronicotinyl chuyên trừ rầy nâu, bọ trỉ

1.2 Các phương pháp khử nhiễm độc tố:

1.2.1 Phương pháp vật lý:

Phân hủy aflatoxin bằng không khí nóng: Dùng không khí nóng thổi qua nguyên liệu có chứa aflatoxin để làm giảm thiểu lượng aflatoxin đã được nhiều tác giả nghiên cứu, phương pháp này đã đem lại nhiều kết quả đáng kể Nếu nhiệt độ không khí nóng đưa vào là 100 °C – 145 °C ở ngô hạt thì lượng aflatoxin B1 có thể giảm từ 877 ppb còn 452 ppb, từ 378 ppb còn 213 ppb Nếu tăng nhiệt độ lên tới 165°C có thể làm cho lượng aflatoxin B1 giảm đến 65% (Đậu Ngọc Hào và Lê Thị Ngọc Diệp, 2003)

Phân hủy aflatoxin bằng hấp ướt ở áp suất cao: Phương pháp hấp ướt ở nhiệt độ cao dưới áp lực hơi nước đem lại kết quả khả quan hơn Quá trình này phá hủy nhanh chóng vòng lacton trong cấu trúc phân tử của aflatoxin Theo Rehana (1979) nhận thấy nếu gạo nhiễm aflatoxin từ 40 - 4000 ppb được hấp ướt trong 5 phút ở 120°C (thêm nước vào gạo tỷ lệ là 1:4) có thể làm giảm hàm lượng aflatoxin đến 68% Ở đậu phộng

có độ ẩm 10%, chứa 7000 ppb aflatoxin B1 được hấp ướt ở 120°C trong 4 giờ giảm còn 370 ppb Ở hàm lượng aflatoxin thấp (760 ppb) được hấp ở 1,5 atm trong vòng một giờ đã phân hủy hoàn toàn aflatoxin (Đậu Ngọc Hào và Lê Thị Ngọc Diệp, 2003) Làm giảm aflatoxin bằng các chất hấp phụ hoặc kết dính độc tố: Các chất hấp phụ thường là các chất vô cơ hoặc hữu cơ (tự nhiên hoặc nhân tạo) có hoạt tính bề mặt cao Các chất có khả năng hấp phụ aflatoxin gồm: Than hoạt tính, một số polymer hữu vô

cơ có bản chất aluminosilicat như bentonite, HSCAS (Hydrated sodium calcium alumino-silicate), một số chất sét đặc biệt (kaolin, sepiolite, clinoptilolite, zeolite), một

số polymer hữu cơ tự nhiên (alfalfa) hoặc nhân tạo (nhựa trao đổi ion, polyvinyl polypyrrolidone) Những chất này không được hấp phụ qua ruột mà được bài thải ra ngoài (Đậu Ngọc Hào và Lê Thị Ngọc Diệp, 2003)

Tách aflatoxin bằng dung môi hữu cơ: Đây là phương pháp có thể áp dụng đối với thức ăn và nguyên liệu làm thức ăn chăn nuôi, do ít có khả năng tạo sản phẩm khác có hoạt tính từ aflatoxin và có thể thu hồi được dung môi mà không ảnh hưởng đến thành phần dinh dưỡng của thức ăn Những kết quả có nhiều hứa hẹn nhất đã thu được bằng việc dùng hệ thống chiết suất bao gồm hỗn hợp hexan-methanol, hexan-ethanol, hexan-ethanol-nước và hexan-acetone-nước Hệ thống bao gồm 54% acetone, 44% hexan và 2% nước (tính theo trọng lượng) là hệ thống thành công nhất được tìm thấy có thể đồng thời loại trừ dầu từ các bánh ép khô của lạc gồm 12% - 15% dầu và dư lượng lipid gần bằng 1% và mức aflatoxin thấp hơn 40 μg/kg

Phân hủy aflatoxin bằng hấp ướt ở áp suất cao: Phương pháp hấp ướt ở nhiệt độ cao dưới áp lực hơi nước đem lại kết quả khả quan hơn Quá trình này phá hủy nhanh

chóng vòng lacton trong cấu trúc phân tử của aflatoxin Theo Rehana (1979) nhận thấy nếu gạo nhiễm aflatoxin từ 40 - 4000 ppb được hấp ướt trong 5 phút ở 120 °C (thêm nước vào gạo tỷ lệ là 1:4) có thể làm giảm hàm lượng aflatoxin đến 68% Ở đậu phộng

có độ ẩm 10%, chứa 7000 ppb aflatoxin B1 được hấp ướt ở 120 °C trong 4 giờ giảm còn 370 ppb Ở hàm lượng aflatoxin thấp (760 ppb) được hấp ở 1,5 atm trong vòng một giờ đã phân hủy hoàn toàn aflatoxin (Đậu Ngọc Hào và Lê Thị Ngọc Diệp, 2003) Làm giảm aflatoxin bằng các chất hấp phụ hoặc kết dính độc tố: Các chất hấp phụ thường là các chất vô cơ hoặc hữu cơ (tự nhiên hoặc nhân tạo) có hoạt tính bề mặt cao Các chất có khả năng hấp phụ aflatoxin gồm: Than hoạt tính, một số polymer hữu vô

cơ có bản chất aluminosilicat như bentonite, HSCAS (Hydrated sodium calcium alumino-silicate), một số chất sét đặc biệt (kaolin, sepiolite, clinoptilolite, zeolite), một

số polymer hữu cơ tự nhiên (alfalfa) hoặc nhân tạo (nhựa trao đổi ion, polyvinyl polypyrrolidone) Những chất này không được hấp phụ qua ruột mà được bài thải ra ngoài (Đậu Ngọc Hào và Lê Thị Ngọc Diệp, 2003)

Tách aflatoxin bằng dung môi hữu cơ: Đây là phương pháp có thể áp dụng đối với thức ăn và nguyên liệu làm thức ăn chăn nuôi, do ít có khả năng tạo sản phẩm khác có hoạt tính từ aflatoxin và có thể thu hồi được dung môi mà không ảnh hưởng đến thành phần dinh dưỡng của thức ăn Những kết quả có nhiều hứa hẹn nhất đã thu được bằng việc dùng hệ thống chiết suất bao gồm hỗn hợp hexan-methanol, hexan-ethanol, hexan-ethanol-nước và hexan-acetone-nước Hệ thống bao gồm 54% acetone, 44% hexan và 2% nước (tính theo trọng lượng) là hệ thống thành công nhất được tìm thấy có thể đồng thời loại trừ dầu từ các bánh ép khô của lạc gồm 12% - 15% dầu và dư lượng lipid gần bằng 1% và mức aflatoxin thấp hơn 40 μg/kg

Phân hủy aflatoxin bằng các tia bức xạ: Aflatoxin rất mẫn cảm với tia cực tím Ở bước sóng 365 nm, khả năng hấp phụ của aflatoxin đạt cực đại Okonkwo (1978) nhận thấy, lượng aflatoxin ở bắp (150 ppb và 250 ppb) có thể giảm tới 30% và 16% trong 10 giờ tiếp xúc với ánh nắng mặt trời (Đậu Ngọc Hào và Lê Thị Ngọc Diệp, 2003)

1.2.2 Phương pháp hóa học:

Phương pháp sử dụng các chất oxi hóa-khử: Các chất oxy hóa-khử như Natri Hypochlorite (NaOCl), Hydrogen Peroxide (H2O2) được sử dụng để làm mất độc tính của aflatoxin Tuy nhiên sử dụng NaOCl để xử lý hạt nhiễm aflatoxin có thể làm mất màu sắc của hạt và biến chất các acid amin Khí ozone (O3) cũng được thử nghiệm về khả năng phân hủy aflatoxin trong mẫu và đạt được hiệu quả tốt, song có bằng chứng

là chất lượng các thành phần của thức ăn bị giảm đặc biệt là protein, vitamin

Phương pháp sử dụng các chất kiềm: Ammonium Hydroxide (NH4OH) và Natri Hydroxide (NaOH) là 2 chất kiềm được sử dụng làm vô hoạt aflatoxin Các chất này đều có hoạt tính mạnh, có thể phá vỡ vòng lacton trong cấu trúc phân tử của aflatoxin Phương pháp sử dụng khí NH3: Nhiều thí nghiệm đã chứng minh hiệu quả của việc dùng khí NH3 làm vô hoạt aflatoxin Xử lý ngô bằng khí NH3 được đặc biệt quan tâm ứng dụng hơn cả Người ta nhận thấy, nếu hàm lượng NH3 là 0,5 - 1,5% và nhiệt độ bên ngoài là 25 °C, trong 14 ngày tiếp xúc, lượng aflatoxin từ 200 ppb có thể giảm xuống còn 10 ppb (theo Đậu Ngọc Hào và Lê Thị Ngọc Diệp, 2003)

1.2.3 Phương pháp sinh học:

Mặc dù các biện pháp phòng chống nấm mốc sinh độc tố đã được khuyến cáo áp dụng, nhưng sự nhiễm aflatoxin trên nông sản ở mức độ cao quá giới hạn là không thể tránh được trong những điều kiện bảo quản bất lợi Vấn đề khử nhiễm aflatoxin bằng con đường sinh học nhằm thay thế cho biện pháp khử nhiễm aflatoxin bằng các hóa chất có giá thành cao và làm biến đổi phẩm chất lượng lương thực nên khó áp dụng vào thực tiễn bảo quản được chứng minh là các phương pháp hứa hẹn nhất

Khử nhiễm độc tố aflatoxin bằng phương pháp sinh học có thể được định nghĩa như

sự phân giải bằng enzyme hay chuyển hóa sinh học của các độc tố nấm mốc trực tiếp nhờ vi sinh vật Một số vi khuẩn có khả năng khử nhiễm độc tố aflatoxin được trình

bày trong bảng 1.1

Bảng 1.1: Các cơ chế khử nhiễm sinh học bằng một số chủng vi khuẩn

Tên vi khuẩn Đối tƣợng Cơ chế khử nhiễm Tác giả

Bacillus pumilus Aspergillus

parasiticus

Sử dụng các sản phẩm trao đổi chất ngoại bào, sinh ra

trong quá trình nuôi cấy B

pumilus, ức chế sự phát triển

và quá trình tổng hợp độc chất aflatoxin của nấm Asp

parasiticus

C Munimbazi và LB.Bullerman, 1997

A xylosoxidan tổng hợp

Cyclo (L-leucyl-L-prolyl), là

1 cyclodipeptide, ức chế sự phát triển và sự tổng hợp

aflatoxin của nấm Asp

Sử dụng các sản phẩm trao đổi chất ngoại bào, sinh ra

trong quá trình nuôi cấy L

casei, ức chế sự phát triển và

I Chang và JD Kim, 2007

triển của nấm Asp flavus

R Thakaew và cộng

sự, 2013

Các loại nông sản Việt Nam được thế giới biết đến càng nhiều như lúa gạo, cà phê, tiêu, điều, thanh long, vú sữa xuất khẩu đậu phộng của Việt Nam, bao gồm nguyên vỏ, bóc vỏ và hạt cao (số liệu này không bao gồm thương mại biên giới với Trung Quốc) Các thị trường xuất khẩu chính của Việt Nam là Đài Loan, Hồng Kông, Thái Lan, Nga, Malaysia và một số nước khác Bộ Nông nghiệp Hoa Kỳ (USDA) điều chỉnh ước tính cho xuất khẩu đậu phộng của Việt Nam trong vụ 2016/17 lên 10 nghìn tấn, bao gồm xuất khẩu đậu phộng thông qua thương mại biên giới và xuất khẩu đậu đã qua chế biến Để đạt được năng suất ấy, người nông dân sử dụng rất nhiều phân bón hóa chất khác và không ít các loại thuốc bảo vệ thực vật Hệ quả không chỉ nông dân phải mất nhiều tiền vào hóa chất mà hệ sinh vật đất và chất lượng đất bị tàn phá nghiêm trọng Phương pháp sinh học sử dụng cho cây trồng đang được các nhà khoa học khuyến khích sử dụng vì chúng có những ưu điểm sau:

- Không gây ảnh hưởng tiêu cực đến sức khỏe con người, vật nuôi, cây trồng như thuốc bảo vệ thực vật từ hóa chất

- Cân bằng hệ sinh thái trong môi trường đất nói riêng và môi trường nói chung

- Không làm thoái hóa đất mà còn góp phần tăng độ phì nhiêu của đất

- Cây trồng hấp thu chất dinh dưỡng dễ hơn, góp phần tăng năng suất và chất lượng nông phẩm

- Tiêu diệt côn trùng gây hại, giảm thiểu bệnh hại, tăng khả năng đề kháng bệnh của cây trồng mà không làm ảnh hưởng đến môi trường như các loại thuốc BVTV có nguồn gốc hóa chất Tác dụng của CPSH đến từ từ chứ không nhanh như các loại hóa chất nhưng tác dụng dài lâu

- Có khả năng phân hủy, chuyển hóa các phế thải sinh học, phế thải nông nghiệp, công nghiệp, góp phần làm sạch môi trường

- Các chủng nấm sinh độc tố sẽ không thể hình thành cơ chế kháng

2 Các vi sinh vật hỗ trợ tăng trưởng cây trồng:

2.1 Khả năng phân giải lân:

Vi khuẩn phân giải lân khó tan đã được sử dụng như phân bón sinh học thương mại

để cải thiện tình trạng nông nghiệp Nhóm vi khuẩn phân giải lân được coi là phân bón sinh học có triển vọng nhất vì rất nhiều loại đất giàu lân tổng số nhưng lại thiếu hụt trầm trọng lân dễ tan cung cấp cho cây trồng Các vi khuẩn phân giải lân lại rất có tiềm năng để sản xuất phân vi sinh đa chức năng vì có thể tương tác kết hợp tốt với các vi

khuẩn có lợi khác như Azospirillum và Azotobacter Ngoài vai trò cung cấp lân dễ tan

cho cây trồng, các vi khuẩn hòa tan lân còn có khả năng sinh các yếu tố có vai trò nâng cao hiệu suất tăng trưởng như cố định đạm, sinh tổng hợp các phytohormone, kháng sinh hay các enzyme chitinase, cellulase giúp cây trồng phát triển tốt hơn, chống chịu tốt hơn đối với điều kiện bất lợi từ bên ngoài

VSV phân giải lân thúc đẩy sự tăng trưởng của thực vật, làm tăng lượng lân có giá trị cho cây trồng Hòa tan lân là một hiện tượng phức tạp, phụ thuộc vào nhiều yếu tố như dinh dưỡng, điều kiện sinh lý và phát triển của các VSV Trong đất, các VSV là

trung tâm của chu trình chuyển hóa lân và đóng vai trò trung gian quan trọng trong việc chuyển hóa lân vô cơ và hữu cơ, sau đó giải phóng lân có giá trị cung cấp cho cây trồng

Trong quần thể VSV đất, VSV phân giải lân có thành phần loài khác nhau và thay đổi tùy từng loại đất VSV phân giải lân được phân lập từ vùng rễ của các cây trồng khác nhau Số lượng VSV phân giải lân hiện diện ở vùng rễ nhiều hơn so với đất ngoài vùng rễ Các VSV phân giải lân chiếm 0,1-0,5 % của tổng số vi khuẩn và nấm VSV phân giải lân phát triển ở cả vùng đất màu mỡ giàu lân và đất thiếu lân

Penicillium sp và Aspergillus sp là hai loại nấm chủ yếu chi phối khả năng phân giải lân trong vùng rễ Các vi khuẩn phân giải lân quan trọng nhất là Pseudomonas, Bacilllus, Rhizobium, Burkholderia, Achromobacter, Agrobacterium,Microccocus, Flavobacterium và Erwinia

Theo Babenko và cộng sự (1984), lượng lân hòa tan tăng tuyến tính cùng với sự tăng trưởng của vi khuẩn trong môi trường nuôi cấy, lượng lân hòa tan tăng tại các điểm khác nhau trong những giai đoạn tăng trưởng (không phải trong suốt thời gian nuôi cấy)

Rodríguez và Fraga (1999) cũng so sánh khả năng phân giải lân của 13 chủng vi

khuẩn khác nhau và nhận thấy rằng Rhizobium, Pseudomonas và các loài vi khuẩn Bacillus là những chủng mạnh nhất trong việc phân giải lân

2.1.1 VSV phân giải lân hữu cơ

Các chất hữu cơ chứa lân sẽ được vô cơ hóa do các enzyme tiết ra từ VSV trong đất Trong quá trình sống, VSV cần phân hủy các chất hữu cơ thành các đường đơn để lấy carbon cho sự phát triển của chúng Trong quá trình phân hủy này, nhờ các men của VSV tiết ra, các hợp chất hữu cơ có chứa lân đã phóng thích lân dưới dạng phosphate

Chủng Bacillus: B megaterium, B subtilis, B malaberensis không những có khả

năng phân giải hợp chất lân vô cơ mà còn có khả năng phân giải hợp chất lân hữu cơ

(Bạch Phương Lan, 2004) Đồng thời B megaterium còn có khả năng hình thành bào

tử nên sức sống rất mạnh (Nguyễn Hữu Hiệp, 2009) Ngoài ra còn có Serratia, Proteus, Arthrobscter, Aspergillus, Penicillium, Rhizopus, Cunnighamella, Streptomyces Cơ chế phân giải: sự chuyển hóa các hợp chất lân hữu cơ thành muối

của H3PO4 theo sơ đồ sau:

1 Nucleoprotein → Nuclein → Acid nucleic → Nucleotic → H3PO4

2.1.2 VSV phân giải lân vô cơ

Trong đất, lân vô cơ khó tan có thể được VSV chuyển hóa thành lân dễ tan Phần lớn VSV trong đất đều có khả năng này Có đến 1/10 đến 1/2 chủng vi khuẩn phân lập được từ đất có khả năng chuyển hóa lân khó tan thành lân dễ tan Theo Katznelson và cộng sự (1984), VSV phân giải những hợp chất lân khó tan thuộc nhiều nhóm, nhiều loại khác nhau, có thể chiếm khoảng 10- 15% hệ VSV đất, vi khuẩn phân giải những hợp chất lân vô cơ khó tan thường gặp gồm các giống: Pseudomonas denitrificans, Alcaligenes faecalis, Achromobacter delicatulus, Agrobacterium radiobacter, Aerobacter aerogenes, Escherichia freundi, Brevibacterium, micrococus, Flavobacterium aurantiacus, Chlorobacterium denitrificans, Mycobacterium cyaneum, Sarcina flava, Bacillus megaterium var phosphaticum Người ta dùng chúng làm phân bón vi sinh phân giải lân Bên cạnh các vi khuẩn, xạ khuẩn, các chủng nấm như Penicillium, Aspergillus, Rhizopus, Sclerotium cũng có tác dụng trong quá trình hòa tan hợp chất lân khó tan

Đại đa số nghiên cứu đều cho rằng, sự phân giải Ca3(PO4)2 có liên quan mật thiết với sự sản sinh acid trong quá trình sống của VSV Trong đó, acid carbonic đã làm cho

Ca3(PO4)2 phân giải

Ca3(PO4)2 + H2CO3 + H2O → Ca(PO4)2.H2O + Ca(HCO3)2

Trong đất, vi khuẩn nitrat hóa và vi khuẩn chuyển hóa lưu huỳnh cũng có tác dụng quan trọng trong việc phân giải Ca3(PO4)2 Vì trong quá trình sống, các vi khuẩn này tích lũy trong đất HNO3 và H2SO4 Quá trình hòa tan có thể biểu thị theo phương trình sau:

Ca3(PO4)2 + 4HNO3 → Ca(H2PO4)2 + 2Ca(NO3)2

Ca3(PO4)2 + 2H2SO4 → Ca(H2PO4)2 + 2CaSO4Các nghiên cứu cho thấy sự xuất hiện các acid này xảy ra cùng lúc với sự xuất hiện lân hòa tan Có nghĩa là ngay sau khi VSV tiết ra các acid thì chúng tác dụng lên lân khó tan và cho ra ngay lân hòa tan Mặt khác các dạng lân bị cố định trong đất như phosphate sắt và phosphate nhôm cũng được chuyển hóa sang dạng dễ tan dưới tác dụng của VSV trong đất Một số vi khuẩn có khả năng sinh ra H2S tác dụng lên phosphate sắt hoặc nhôm và phóng thích ra dạng phosphate dễ tan Hiện tượng này xảy ra trong điều kiện thiếu oxy Cơ chế của hiện tượng này chưa được giải thích rõ

Ở đất phèn trồng lúa, hầu hết lân đều ở dạng phosphate sắt hoặc nhôm, lúa không hấp thu được Trong điều kiện này việc bón phân chuồng hoặc chôn vùi rơm rạ kết hợp với bón đạm và vôi để giúp VSV phát triển sẽ giúp chuyển lân cố định sang dạng dễ tan và cung cấp cho lúa Sự chuyển hóa này hơi chậm nên tự nó không cung cấp lân đủ cho nhu cầu của lúa nên phải kết hợp thêm lân trong phân bón hóa học nhưng với liều lượng ít hơn

2.2 Tạo màng sinh học biofilm

Các tế bào vi khuẩn sinh sống trôi nổi trong môi trường lỏng (dạng phù du) vô tình bám vào một bề mặt nào đó, và nếu sau một thời gian chúng không chịu tác động di chuyển đi nơi khác, quá trình sinh trưởng vẫn cứ tiếp tục, dần sẽ hình thành một kiểu

khuẩn lạc trên bề mặt đó, đây là giai đoạn đầu của sự hình thành màng sinh học Kế đến

vi khuẩn sẽ bắt đầu thay đổi thay đổi kiểu hình, khả năng sinh hóa mới để thuận lợi hơn trong việc tổng hợp nên cơ chất ngoại bào - extracellular polymeric substance (EPS) Phân tích về mặt hình thái học kết hợp với di truyền học, người ta xác định rằng các tế bào xuất hiện cấu trúc tua, nhung mao hoặc tiêm mao sẽ tăng thêm độ vững chắc của màng sinh học Giai đoạn cuối của sự hình thành màng sinh học, các tế bào sẽ một lần nữa biến đổi quay lại dạng phù du, tách ra khỏi màng sinh học để tìm địa điểm định cư khác, giai đoạn này gọi là giai đoạn phát tán Khả năng tạo màng sinh học như là một cách thức tồn tại, phát triển của vi sinh vật trong những điều kiện dinh dưỡng thấp của môi trường

EPS là các polymer sinh học có trọng lượng phân tử cao được vi sinh vật tiết ra ngoài môi trường sống xung quanh chúng EPS là thành phần chính, đồng thời quyết định tính hóa lý của màng sinh học EPS chiếm từ 50 – 90% tổng lượng chất hữu cơ của một màng sinh học EPS là vật liệu giúp cho tế bào vi khuẩn bám dính lên một bề mặt nào đó và đồng thời liên kết với các tế bào khác

Trong màng sinh học, các tế bào liên kết với nhau bằng mạng lưới do chúng tự tổng hợp nên EPS EPS không chỉ bao gồm polysaccharides do tế bào tổng hợp ra, mà còn các thành phần từ môi trường xung quanh như các ion khoáng, bụi bẩn, hồng cầu, fibrin, protein và các acid nucleic Xen kẽ với mạng lưới EPS còn có các kênh nước, giúp vận chuyển chất dinh dưỡng và tín hiệu giữa các tế bào

EPS sẽ bao phủ tế bào vi khuẩn, nhưng vẫn tạo điều kiện cho các tế bào trao đổi tín hiệu sinh hóa cũng như trao đổi gen với nhau EPS chính là chìa khóa quan trọng cho việc sự hình thành, phát triển của màng sinh học EPS còn có chức năng giữ cho các enzyme ngoại bào gần với tế bào, giúp hoạt động trao đổi chất của vi khuẩn ổn định hơn

Nghiên cứu về màng sinh vật (Biofilm) góp phần tạo ra những sản phẩm ứng dụng cao trong cuộc sống như tạo các công nghệ sinh học xử lý ô nhiễm môi trường, ứng

dụng trong nghiên cứu phòng bệnh cho cây trồng cũng như các nghiên cứu trong công nghiệp thực phẩm, hóa mỹ phẩm,…

2.3 Khả năng sinh Indole-3-acetic acid (IAA)

Indole-3-acetic acid (IAA) hay còn goi là Auxin, là chất điều hòa chủ yếu của sự sinh trưởng thực vật IAA chi phối sự phân chia tế bào, sự giãn dài tế bào, sự phân sinh

mô, sự phát triền trái và hạt , chi phối giai đoạn đầu sự phát triển của cây trồng (Theologis và Gay 1982)

Auxin là những hợp chất có nhân indol, được tổng hợp từ tryptophan trong mô phân sinh (ngọn, lóng) và lá non Sau đó, auxin sẽ di chuyễn đến rễ và tích tụ trong rễ

Có nhiều loại auxin khác nhau với cấu trúc hoá học khác nhau Loại auxin quan trọng nhất là β-indol-acetic acid (IAA), ngoài ra một số auxin khác cũng khá phổ biến

là napthalen-acetic acid (NAA), phenyl-acetic acid (PAA)

Hình 1.1: Một số loại auxin phổ biến

Với nhiều thí nghiệm khác nhau của nhiều nhà khoa học đã chứng minh được vai trò của IAA do vi sinh vật tạo ra đối với cây trồng như kích thích sự kéo dài rễ, tăng số lượng rễ phụ, làm tăng khả năng nẩy mầm của hạt

Đánh giá khả năng sinh IAA của các chủng VSV dựa trên nồng độ IAA có trong dịch chiết nuôi cấy vi khuẩn Nồng độ IAA có trong dịch chiết càng cao chứng tỏ khả năng sinh IAA của VSV càng mạnh Nồng độ IAA được xác định bằng phương pháp

so màu trên máy quang phổ với thuốc thử Salkowski ở bước sóng 530nm

3 Tổng quan về vi khuẩn lactic

3.1 Đặc điểm hình thái giống Lactobacillus sp

Vi khuẩn lactic có nhiệt độ sinh trưởng tối ưu trong khoảng 25 – 35 °C Chúng chịu được trạng thái khô hạn, bền vững với CO2 và etylic, nhiều loài vẫn sống được trong môi trường 10-15 % cồn hoặc cao hơn, một số trực khuẩn bền với NaCl, có thể sống trong môi trường từ 7-10 % NaCl Vi khuẩn lactic có hoạt tính protease phân hủy protein thành peptide, acid amin, hoạt tính này ở các loài khác nhau thì khác nhau, thường ở trực khuẩn là cao hơn

Tùy thuộc vào hình dạng tế bào mà người ta chia vi khuẩn lactic thành dạng hình cầu và hình que, đường kính của các dạng cầu khuẩn lactic từ 0,5 - 1,5 μm Các tế bào hình cầu xếp thành cặp hoặc hình chuỗi có chiều dài khác nhau Kích thước tế bào trực khuẩn lactic từ 1 – 8 μm Trực khuẩn đứng riêng rẽ hoặc kết thành chuỗi Kích thước của chúng thay đổi tùy từng loài

Phân loại khoa học giống Lactobacillus:

Các loài Lactobacillus được tìm thấy các sản phẩm lên men từ động vật và thực vật,

đặc biệt là trong các sản phẩm sữa, trong ruột, trong hệ tiêu hóa, hệ bài tiết và hệ sinh dục người Các loại thực phẩm lên men như sữa chua và thực phẩm chức năng cũng có chứa các vi khuẩn này

Các vi khuẩn lactic thuộc nhóm này thường sử dụng như: Lactobacillus pasterian, Lactobacillus brevis, Lactobacillus axitophilus, Lactobacillus casei, Lactobacillus plantarum

3.2 Đặc điểm sinh lý

Lactobacillus spp thuộc nhóm vi khuẩn kỵ khí tùy nghi Các loài trong chi không

có khả năng di động, không sinh bào tử

Phổ nhiệt tăng trưởng từ 2 – 53oC, nhưng tối ưu ở khoảng 30 – 40oC Tăng trưởng tốt trong điều kiện môi trường acid, pH tối ưu khoảng 5.5 – 6.2, nhưng vẫn có thể chịu được mức pH 5.0 hoặc thấp hơn Tốc độ tăng trưởng giảm trong điều kiện pH môi

trường trung tính hoặc kiềm Vì Lactobacillus spp có khả năng chịu được môi trường

có pH cao, nên việc tiết ra acid lactic chính là yếu tố cạnh tranh của chúng đối với những

vi khuẩn khác trong cùng một môi trường

Thường được tìm thấy trong các sản phẩm có nguồn gốc từ sữa, ngũ cốc, thịt, cá, bia, rượu, trái cây, nước trái cây, rau củ muối chua, bã thực phẩm, dưa cải bắp, cỏ ủ, bột nhào chua, nước, đất, chất thải Chúng cũng xuất hiện trong cơ quan sinh dục nữ, khoang miệng, hệ tiêu hóa ở người và nhiều động vật khác Đây là những môi trường được cung cấp thường xuyên nguồn carbohydrate và một số chất dinh dưỡng khác Chính là nơi thích hợp để chúng thực hiện các phản ứng lên men và cho ra sản phẩm chính là acid lactic

3.3 Đặc điểm sinh hóa

Lactobacillus spp âm tính với thử nghiệm nitrate, một số trường hợp hiếm dương

tính chỉ xảy ra khi pH môi trường cân bằng ở 6.0 trở lên hoặc bổ sung sắc tố đỏ heme bào môi trường nuôi cấy Không có khả năng phân giải gelatin, casein Thử nghiệm Indole, Citrate và khả năng sinh H2S âm tính Thử nghiệm catalase âm tính

Lactobacillus spp thường sinh ra mùi đặc trưng khi có mặt trong thực phẩm Một

nửa sản phẩm cuối cùng của quá trình lên men là lactate Ngoài ra quá trình lên men còn sinh các sản phẩm khác như là: diacetyl, acetic acid, và acetaldehyde Bên cạnh đó quá trình dị hóa amino acid sẽ sinh ra H2S, amines, hợp chất carbonyl, cresol, skatol, benzaldehyde, và methanethiol Tất cả những sản phẩm của quá trình trao đổi chất này

đã tạo ra nhiều loại hương đặc trưng của sản phẩm lên men

Lactobacillus spp thường không có khả năng gây bệnh, ngoài trừ một số ít trường

hợp có bệnh tiềm ẩn bởi khả năng sinh ra acid khử khoáng men răng

Đa số các loài trong chi Lactobacillus đều có khả năng tổng hợp EPS, nhưng chia

thành hai dạng Homopolysaccharides là dạng EPS được tổng hợp từ carbohydrate chủ yếu là dextran, glucan và levan Trong khi dạng Heteropolysaccharides được tổng hợp

từ nucleotide Homopolysaccharides chủ yếu được tổng hợp từ loài lên men dị hình như

L pontis, L frumenti, L sanfranciscensis và L reuteri Heteropolysaccharides được tổng hợp với số lượng ít, khoảng 0.1 – 1.5 g/l bởi những loài lên men đồng hình như L kefiranofaciens, L delbrueckii subsp bulgaricus, L paracasei, L rhamnosus, L helveticus, và L sakei

3.4 Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn lactic

Vi khuẩn lactic là những vi sinh vật có yêu cầu dinh dưỡng cao Các loại vi khuẩn lactic khác nhau thì có nhu cầu dinh dưỡng khác nhau

Để sinh trưởng bình thường chúng không chỉ có nhu cầu về các nguồn cơ chất chứa các nguyên tố cơ bản như carbon, nitơ một phần dưới dạng các acid amin, photphat và lưu huỳnh mà còn có nhu cầu về một số chất cần thiết khác như vitamin, muối vô cơ, các chất sinh trưởng…

3.4.1 Nhu cầu dinh dưỡng cacbon

Vi khuẩn lactic có thể sử dụng được nhiều loại carbohydrate từ các monosaccharide (glucose, fructose) và các disaccharide (saccharose, lactose, maltose) cho đến các polysaccharide (tinh bột, dextrin)

Chúng sử dụng nguồn cacbon này để cung cấp năng lượng, xây dựng cấu trúc tế bào và làm cơ chất cho quá trình lên men tổng hợp các acid hữu cơ như acid citric, lactic, pyruvic, fumaric, acetic,

3.4.2 Nhu cầu dinh dưỡng nitơ

Mỗi loài vi khuẩn khác nhau có nhu cầu về nguồn nitơ khác nhau Phần lớn vi khuẩn lactic không thể sinh tổng hợp được các chất hữu cơ phức tạp có chứa nitơ

Vì vậy để đảm bảo cho sự sinh trưởng và phát triển chúng phải sử dụng các nguồn nitơ có sẵn trong môi trường Các nguồn nitơ vi khuẩn lactic có thể sử dụng như: cao thịt, cao nấm men, trypton, dịch thủy phân casein từ sữa, peptone… Hiện nay cao nấm men là nguồn nitơ được sử dụng nhiều nhất và có hiệu quả nhất tuy nhiên ở quy mô công nghiệp không thể sử dụng nguồn nitơ này vì rất tốn kém

3.4.3 Nhu cầu về vitamin

Vitamin đóng vai trò là các coenzyme trong quá trình trao đổi chất của tế bào, nên rất cần thiết cho hoạt động sống Tuy nhiên, đa số các loài vi khuẩn lactic không có khả năng sinh tổng hợp vitamin Vì vậy cần bổ sung vào môi trường các loại vitamin Các chất chứa vitamin thường được sử dụng như dịch chiết từ khoai tây, ngô, cà rốt hay dịch tự phân nấm men

3.4.4 Nhu cầu các chất hữu cơ khác

Ngoài các acid amin và vitamin, vi khuẩn lactic còn cần các hợp chất hữu cơ khác cho sự phát triển như các base nitơ hay các acid hữu cơ Một số acid hữu cơ có ảnh hưởng thuận lợi đến tốc độ sinh trưởng của vi khuẩn lactic như acid citric, acid oleic Nên hiện nay người ta sử dụng các muối citrate, dẫn xuất của acid oleic làm thành phần môi trường nuôi cấy, phân lập và bảo quản các chủng vi khuẩn lactic

Tương tự như hai acid hữu cơ trên, acid acetic cũng có những tác động quan trọng đến sự sinh trưởng của tế bào Nên người ta thường sử dụng acid acetic dưới dạng các muối acetate để làm chất đệm cho môi trường khi nuôi cấy vi khuẩn lactic

3.4.5 Nhu cầu các muối vô cơ khác

Để đảm bảo cho sinh trưởng và phát triển đầy đủ, vi khuẩn lactic rất cần các muối

vô cơ Nhằm cung cấp các nguyên tố khoáng như đồng, sắt, natri, kali, photpho, lưu huỳnh, magie, mangan Đặc biệt là magie và mangan, vì nó tham gia và đảm bảo chức năng hoạt động của enzyme, giúp ngăn ngừa quá trình tự phân và ổn định cấu trúc tế bào

3.4.6 Nhu cầu dinh dưỡng oxy

Vi khuẩn lactic có khả năng sống được trong môi trường có oxy hay không có oxy Tuy nhiên, trong điều kiện hiếu khí, sinh khối vi khuẩn sẽ phát triển nhanh hơn so với trong điều kiện kị khí

Trong điều kiện hiếu khí sinh khối vi khuẩn sẽ phát triển nhanh hơn so với điều kiện kỵ khí, trong điều kiện này từ một phân tử glucose sẽ bị oxy hóa hoàn toàn thành

CO2 và H2O và tổng hợp các enzyme, từ một phân tử glucose tạo ra 36 hoặc 38 ATP Trong điều kiện kỵ khí từ một phân tử glucose chỉ tạo ra 2 ATP do đó lượng cơ chất bị phân hủy rất nhanh và tổng hợp một số chất kháng khuẩn

3.5 Quá trình trao đổi chất

Quá trình trao đổi chất và năng lượng của vi khuẩn lactic thực hiện thông qua việc lên men lactic

Một tính năng cần thiết của LAB trong quá trình trao đổi chất là khả năng lên men carbohydrate, các ATP tạo ra được sử dụng cho các mục đích tổng hợp sinh học khác

và sản phẩm cuối cùng chủ yếu là acid lactic (từ 50% carbon của đường) LAB có khả năng lên men các loại đường hexose (glucose, mannose, galactose, fructose…), disaccharide (lactose, saccharose…); pentose (arabinose, xylose, ribose…) và các hợp chất liên quan Chúng chỉ sử dụng được các loại đường ở dạng đồng phân D Tuy nhiên, LAB có thể thích ứng với nhiều điều kiện khác nhau làm thay đổi cách thức trao đổi chất và dẫn đến các sản phẩm cuối cùng tạo ra cũng khác nhau

Dựa vào khả năng lên men lactic từ glucose, người ta chia vi khuẩn lactic làm hai

nhóm: Lên men lactic đồng hình và lên men lactic dị hình (hình 1.2)

- Lên men lactic đồng hình

Lên men đồng hình là quá trình lên men trong đó có các sản phẩm acid lactic tạo ra chiếm 90% tổng số các sản phẩm lên men và một lượng nhỏ acid acetic, acetol, di-acetiyl Phương trình chung biểu diễn quá quá trình lên men:

C6H12O6

2CH3CHOHCOOH + 21,8.104 J

Con đường Glycolysis hay con đường EMB (Embden-Meyerhof-Parnas pathway)

được sử dụng bởi hầu hết các LAB (ngoại trừ leuconostocs, nhóm III Lactobacilli, Oenococci và Weissellas) tạo ra fructose-1,6-diphosphate (FDP) và nhờ FDP aldolase

để tiếp tục chuyển thành dihydroxyacetonephosphate (DHAP) và phosphate (GAP) đối với những chất có mức phosphoryl hóa ở 2 vị trí, sau đó tạo thành pyruvate Trong điều kiện có nhiều đường và hạn chế oxy, pyruvate bị khử thành acid lactic bởi lactate dehydrogenase (nLDH) và NAD+, do đó NADH đã được oxy hóa trước đó, khi thế oxy hóa khử được cân bằng, sản phẩm cuối cùng được tạo ra chủ yếu là acid lactic và quá trình này được gọi là lên men lactic đồng hình

glyceraldehyde-3 Lên men lactic dị hình

Một số con đường lên men khác như: con đường pentose phosphate, con đường pentose phosphoketolase pathway, con đường hexose monophosphate, con đường 6-phosphogluconate Đặc điểm của con đường này là sự khử hidro ngay từ bước đầu tạo 6-phosphogluconate Theo sau đó là sự tách carbon tạo pentose-5-phosphate và tiếp tục chuyển hóa thành glyceraldehyde-3-phosphate (GAP) và acetyl phosphate GAP được tạo thành tương tự như trong con đường glycolysis và kết quả là tạo ra acid lactic Trong điều kiện không có mặt của các chất nhận điện tử, acetyl phosphate sẽ bị khử tạo thành ethanol thông qua CoA và acetaldehyde Khi quá trình này ngoài sản phẩm acid lactic còn tạo ra một lượng đáng kể các sản phẩm phụ như CO2, ethanol, acid acetic, acid succinic thì nó được gọi là lên men lactic dị hình

Phương trình chung biển diễn quá trình lên men:

C6H12O6 

CH3CHOHCOOH + HOOC(CH2)COOH + CH3COOH +

C2H5OH +CO2

Trong đó, acid lactic chiếm khoảng 40%, acid succinic khoảng 20%, rượu etylic

và acid acetic 10% các loại khí 20% đôi khi không có các khí mà thay vào đó là sự tích luỹ một lượng ít acid foocmic Như vậy, các sản phẩm phụ khác nhau đáng kể tạo

thành trong quá trình lên men lactic dị hình chứng tỏ rằng quá trình này phức tạp hơn

so với lên men lactic đồng hình Theo quan điểm tiến hoá sinh lý trong vi sinh vật học người ta cho rằng lên men lactic đồng hình là hướng tiến hoá độc lập của lên men dị hình

Thông thường, LAB lên men đồng hình chủ yếu lên men bằng con đường

glycolysis và ngược lại LAB lên men dị hình sử dụng con đường 6-PG/PK Tuy nhiên

nó không phải dúng cho tất cả các trường hợp (Owen R Fennema et al 2004)

Hình 1.2: Con đường lên men Glucose

Chú thích hình 1.7

(A) Lên men đồng hình (con đường glycolysis,, EMB)

(B) Lên men dị hình (con đường 6-phosphogluconate/phosphoketolase)

Các enzyme tham gia vào quá trình : 1 Glucokinase; 2 diphosphate aldolase; 3 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase; 4 Pyruvate kinase; 5 Lactate dehydrogenase; 6 Glucose-6-phosphate dehygrogenase; 7 6-phosphogluconate dehydrogenase; 8 Phosphoketolase; 9 Acetaldehyde dehydrogenase; 10 Alcohol dehydrogenase

Fructose-1,6-Bảng 1.2: Một số sản phẩm chuyển hóa của LAB và phương thức hoạt động

giảm tính thấm của màng

Hydrogen peroxide/ Lactoperoxidase Oxy hoá các protein cơ bản

Acid lactic

Acid lactic bị phân ly đi xuyên qua màng, làm thấp pH nội bào Nó gây trở ngại quá trình chuyển hoá như oxi hoá khử phosphor

Bacteriocin

Ảnh hưởng đến màng, tổng hợp protein và DNA

3.6 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men, quá trình sinh trưởng và

phát triển của vi khuẩn lactic

Trong công nghiệp, vật liệu dùng để làm môi trường cho vi sinh vật phát triển cần đảm bảo các yếu tố: đầy đủ chất dinh dưỡng, không có độc tố, cho hiệu suất thu hồi là lớn nhất và giá thành rẻ (Lương Đức Phẩm, 2004) Mỗi nguồn dinh dưỡng cung cấp không chỉ ảnh hưởng đến sự phát triển của vi khuẩn trong quá trình nuôi cấy mà còn ảnh hưởng không nhỏ đến quá trình thu hồi và bảo quản chế phẩm sinh khối sau này



Thành phần môi trường nuôi cấy

Vi khuẩn lactic thuộc loại vi sinh vật dị dưỡng Nguồn năng lượng cần thiết cho hoạt động sống và phát triển của chúng là nguồn năng lượng do trao đổi chất với môi trường bên ngoài Thành phần môi trường MRS để nuôi cấy vi khuẩn lactic có chứa nhiều chất dinh dưỡng và dễ bị tạp nhiễm cũng ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy vi khuẩn lactic Ngoài ra, để duy trì sự sống, điều hòa các quá trình chuyển hóa trong tế bào, chúng cần sử dụng nguồn glucid có trong môi trường dinh dưỡng làm nguồn carbon (chủ yếu là đường lactose), nguồn nitơ (pepton, acid amin), vitamin, muối khoáng và các yếu tố vi lượng Vì vậy, ta cần bổ sung các nguồn dinh dưỡng trên với liều lượng thích hợp nhất giúp vi khuẩn lactic phát triển tốt, nâng cao hiệu suất lên men