Tiêu chuẩn Quốc gia TCVN 8180-2:2009 - ISO 9233-2:2007 trình bày về phomat, cùi phomat và phomat chế biến - xác định hàm lượng natamyxin - phần 2: Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao đối với phomat, cùi phomat và phomat chế biến. Mời các bạn tham khảo.
TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 8180-2 : 2009 ISO 9233-2 : 2007 PHOMAT, CÙI PHOMAT VÀ PHOMAT CHẾ BIẾN - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG NATAMYXIN - PHẦN 2: PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO ĐỐI VỚI PHOMAT, CÙI PHOMAT VÀ PHOMAT CHẾ BIẾN Cheese, cheese rind processed cheese - Determination of natamycin content - Part 2: High-performance liquid chromatographic method for cheese, cheese rind and processed cheese Lời nói đầu TCVN 8180-2 : 2009 hồn tồn tương đương với ISO 9233-2:2007; TCVN 8180-2 : 2009 Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F12 Sữa sản phẩm sữa biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng đề nghị, Bộ khoa học Công nghệ công bố Bộ tiêu chuẩn TCVN 8180 (ISO 9233) gồm tiêu chuẩn sau: - TCVN 8180-1 : 2000 (ISO 9233-1 : 2007) Phomat, cùi phomat phomat chế biến - Xác định hàm lượng natamyxin - Phần 1: Phương pháp đo phổ hấp thụ phân tử cùi phomat; - TCVN 8180-2 : 2009 (ISO 9233-2 : 2007) Phomat, cùi phomat phomat chế biến - Xác định hàm lượng natamyxin - Phần 2: Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao phomat, cùi phomat phomat chế biến PHOMAT, CÙI PHOMAT VÀ PHOMAT CHẾ BIẾN - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG NATAMYXIN - PHẦN 2: PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO ĐỐI VỚI PHOMAT, CÙI PHOMAT VÀ PHOMAT CHẾ BIẾN Cheese, cheese rind processed cheese - Determination of natamycin content - Part 2: Highperformance liquid chromatographic method for cheese, cheese rind and processed cheese Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn qui định phương pháp xác định hàm lượng natamyxin cao 0,5 mg/kg phomat, cùi phomat phomat chế biến hàm lượng natamyxin cao 0,03 mg/dm liên quan đến diện tích bề mặt Thuật ngữ định nghĩa Trong tiêu chuẩn sử dụng thuật ngữ định nghĩa sau đây: 2.1 Hàm lượng natamyxin (natamycin content) Phần khối lượng chất xác định phương pháp qui định tiêu chuẩn CHÚ THÍCH Hàm lượng nitơ tính miligam kilogam 2.2 Hàm lượng natamyxin liên quan đến diện tích bề mặt cùi phomat (surface-area-related natamycin mass in cheese rind) Phần khối lượng chất liên quan đến diện tích bề mặt xác định phương pháp qui định tiêu chuẩn CHÚ THÍCH Hàm lượng natamyxin liên quan đến diện tích bề mặt tính miligam natamyxin decimet vuông cùi phomat 2.3 Cùi phomat Lớp ngồi phomat có bề dày mm, ngoại trừ lớp bao phủ, có Nguyên tắc Phần mẫu thử biết chiết metanol Dịch chiết pha loãng nước làm lạnh đến khoảng từ âm 15 0C đến âm 20 0C để làm kết tủa hết tất chất béo, lọc Hàm lượng natamyxin lượng natamyxin liên quan đến diện tích bề mặt xác định dịch lọc (sau cô đặc, cần) phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao Thuốc thử Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích nước cất nước loại khống nước có độ tinh khiết tương đương, trừ có qui định khác 4.1 Metanol (CH3OH) 4.2 Metanol, dung dịch nước Trộn thể tích metanol (4.1) với thể tích nước 4.3 Dung dịch chuẩn natamyxin, nồng độ 500 mg/l Ngay trước sử dụng, hòa tan metanol (4.1) lượng chế phẩm natamyxin biết trước hàm lượng natamyxin, tương ứng với 50 mg natamyxin tinh khiết (C33H47NO13) bình định mức vạch 100 ml (5.1) Thêm nước đến vạch trộn 4.3.2 Dung dịch chuẩn làm việc natamyxin, nồng độ mg/l Dùng pipet lấy 5,0 ml dung dịch chuẩn gốc natamyxin (4.3.1) cho vào bình định mức vạch 50 ml (5.1) Pha loãng dung dịch metanol nước (4.2) đến vạch trộn Dùng pipet lấy 5,0 ml dung dịch pha loãng cho vào bình định mức vạch 50 ml (5.1) Pha loãng dung dịch metanol nước (4.2) đến vạch trộn Nồng độ natamyxin dung dịch chuẩn làm việc g/ml Nồng độ phải gần nồng độ dung dịch thử đo 8.3.3 Chỉnh dung dịch chuẩn làm việc cách dùng pipet pha loãng lượng khác, cần 4.4 Axit axetic (CH3CO2H), băng Thiết bị, dụng cụ Sử dụng thiết bị phòng thử nghiệm thơng thường cụ thể sau: 5.1 Bình định mức vạch, dung tích 50 ml 100 ml 5.2 Máy thái dụng cụ tương tự, cắt phần phomat dày mm rộng khoảng 30 mm (xem ví dụ Hình A.1) 5.3 Máy cắt, cắt mỏng lát phomat dày mm (xem ví dụ Hình A.2) 5.4 Máy nghiền máy trộn 5.5 Dao sắc, cắt lát phomat thành miếng nhỏ 5.6 Máy khuấy từ máy lắc 5.7 Bính nón, dung tích 100 ml 200 ml, thủy tinh màu đậy nút thủy tinh mài 5.8 Xyranh, dung tích 10 ml, loại dùng lần 5.9 Màng lọc micro, cỡ lỗ 0,20 m đến 0,45 m, bền với dung dịch cồn 5.10 Giấy lọc gấp nếp, tốc độ nhanh, đường kính 150 mm (ví dụ: S S số 595 1/2) 1) 5.11 Phễu chiết, đường kính khoảng 70 mm 5.12 Tủ đơng lạnh, làm đơng lạnh khoảng từ âm 15 0C đến âm 20 0C 5.13 Cột chiết, để cô đặc dịch lọc, cần [ví dụ: Sep-pac C18 1) Waters số 519101)] 5.14 Máy sắc ký lỏng, có detector UV đo bước sóng 303 nm, trang bị máy ghi và/hoặc máy tích phân 5.15 Cột phân tích, dài 150 mm, đường kính 4,6 mm, loại C8, có cỡ hạt m [ví dụ: Lichrosorb RP8)1 5.16 Cột bảo vệ, dài 100 mm, đường kính 2,1 mm, loại C8, có cỡ hạt 30 m đến 40 m [ví dụ: Perisorb RP8)1] 5.17 Bình đựng mẫu, có dung tích thích hợp Lấy mẫu Mẫu gửi đến phòng thử nghiệm phải mẫu đại diện Mẫu không bị hư hỏng thay đổi suốt trình vận chuyển bảo quản Phương pháp lấy mẫu không qui định tiêu chuẩn Nên lấy mẫu theo TCVN 6400 (ISO 707) Mẫu phòng thử nghiệm phải phomat nguyên phần phomat đại diện cho khối phomat Chuẩn bị mẫu thử 7.1 Cùi phomat Cắt mẫu thử thành phần phần nhỏ cho chiều rộng cùi phomat không lớn 30 mm, cần Dùng máy thái (5.2) loại toàn cùi từ tất phần thu cách cắt miếng có bề dày tối đa mm Từ phần cùi thu được, cắt dao sắc (5.5), cắt lát hình chữ nhật có diện tích từ dm đến dm2 Xác định diện tích bề mặt, tính theo decimet vng khối lượng tính theo kilogam Dùng máy nghiền (5.4) cẩn thận nghiền toàn cùi, miếng cân đo trộn kỹ Chuyển phần mẫu thử chuẩn bị sang bình đựng mẫu (5.17) Sau chuẩn bị xong mẫu thử, rửa tất dụng cụ tiếp xúc với mẫu nước nóng sau metanol (4.1) Làm khơ dụng cụ rửa, ví dụ: dùng luồng khơng khí nén 7.2 Lõi phomat phomat chế biến Sau loại bỏ cùi (7.1), dùng máy cắt (5.3) loại bỏ lớp tối đa mm từ phần cắt bỏ củi mẫu phomat Cắt tất lát phomat thành miếng nhỏ khoảng 50 mm trộn kỹ Chuyển phần mẫu thử chuẩn bị sang bình đựng mẫu (5.17) Sau chuẩn bị xong mẫu thử, rửa tất dụng cụ tiếp xúc với mẫu nước nóng sau metanol (4.1) Làm khơ dụng cụ rửa, ví dụ: dùng luồng khơng khí nén Cách tiến hành 8.1 Phần mẫu thử 8.1.1 Cùi phomat 1) Đây ví dụ sản phẩm có bán sẵn Thông tin đưa tạo thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn ISO không ấn định phải sử dụng sản phẩm 1 Cân khoảng 10,00g mẫu thử (7.1), xác đến 10 mg, cho vào bình nón 200 ml (5.7) 8.1.2 Lõi phomat phomat chế biến Cân khoảng 5,00g mẫu thử (7.2), xác đến 10 mg, cho vào bình nón 100 ml (5.7) 8.2 Chuẩn bị dung dịch thử 8.2.1 Cùi phomat 8.2.1.1 Bước ban đầu Cho 100 ml metanol (4.1) vào phần mẫu thử bình nón (8.1.1) Dùng máy khuấy từ (5.6) để khuấy lượng chứa bình nón 90 lắc 90 máy lắc (5.6) Thêm 50 ml nước Đặt bình nón vào tủ đông lạnh (5.12) khoảng 60 8.2.1.2 Lọc Lọc dịch chiết lạnh qua giấy lọc gấp nếp (5.10) loại bỏ ml dịch lọc Lọc huyền phù lạnh để tránh làm tan chất béo bị đục Đưa dịch lọc nhiệt độ phòng Dùng xyranh (5.8) lấy phần dịch lọc Lọc qua màng lọc micro cỡ lỗ 0,45 m (5.9) lọc tiếp qua màng lọc micro cỡ lỗ 0,20 m (5.9) Lượng dung dịch mẫu thử (dịch lọc) tối thiểu 20 l để đo sắc ký trực tiếp (8.3.4) 25 ml 50 ml để đo nồng độ cao gấp 10 lần (8.3.5) tương ứng 8.2.2 Lõi phomat phomat chế biến 8.2.2.1 Bước ban đầu Dùng ống đong lấy 50 ml metanol (4.1) cho vào phần mẫu thử bình nón (8.1.2) Dùng máy khuấy từ (5.6) để khuấy lượng chứa bình nón 90 lắc 90 máy lắc (5.6) Dùng ống đong cho thêm 25 ml nước Đặt bình nón vào tủ đơng lạnh (5.12) khoảng 60 8.2.2.2 Lọc Tiến hành lọc 8.2.1.2 8.3 Xác định 8.3.1 Xác định giới hạn phát Phòng thử nghiệm sử dụng phương pháp thiết lập giới hạn phát xác định điều kiện thiết bị sử dụng phương pháp tính tốn cơng nhận để xác nhận hàm lượng natamyxin cần xác định thấp đến 0,5 mg/kg 0,03 mg/dm2 8.3.2 Điều chỉnh máy đo sắc ký lỏng (5.14) Khuyến cáo sử dụng điều kiện sắc ký đây: Pha động Metanol (4.1): nước : axit axetic (4.4) theo tỷ lệ 12:8:1 (thể tích) Tốc độ dòng: ml/min Cài đặt detector: 303 nm, 0,005 đơn vị hấp thụ toàn dải đo Bộ ghi: 10 mV Số đếm lý thuyết (điển hình): tối thiểu 1500 Khi sử dụng cột khác với ví dụ 5.15, chỉnh tỷ lệ metanol : nước Tuy nhiên, lượng tương đối axit axetic (4.4) metanol qui định cần giữ độ hấp thụ tối đa 303 nm Trước dãy phân tích, cần phải bơm dung dịch biết trước hàm lượng natamyxin để xác định thời gian lưu để kiểm tra đường chuẩn (8.3.3) Vì natamyxin khơng ổn định dung dịch metanol, nên tiến hành phép đo 8.3.3 Đường chuẩn Dùng pipet lấy ml, ml, ml, ml ml tương ứng dung dịch chuẩn làm việc natamyxin (4.3.2) cho vào dãy bình định mức 50 ml (5.1) Thêm dung dịch metanol nước (4.2) trộn Các dung dịch hiệu chuẩn thu chứa 0,1 g/ml, 0,2 g/ml, 0,4 g/ml, 0,6 g/ml 0,8 g/ml natamyxin tương ứng Bơm 20 l dung dịch chuẩn lên cột Xác định chiều cao pic diện tích pic thu Dựng chiều cao pic diện tích pic thu dung dịch trục tung nồng độ natamyxin tính miligam kilogam trục hoành Sắc đồ HPL mẫu dung dịch chuẩn nêu Hình A.3 8.3.4 Dung dịch thử Bơm 20 l dung dịch thử (8.2.1.2 8.2.2.2) Đo chiều cao pic diện tích pic có thời gian lưu giống dung dịch chuẩn natamyxin Thực phép đo nhanh tốt Nếu chiều cao pic diện tích pic mẫu thử thấp mà nội suy đồ thị gần không thể, cần xác định tiến hành theo 8.3.5 Các ví dụ sắc đồ dung dịch thử đưa Hình A.4 CHÚ THÍCH Sự có mặt gia vị, cụ thể hạt tiêu, phomat gây nhiễu cho phép xác định tạo pic sắc đồ có thời gian lưu natamyxin Việc tách hai pic thực cách rửa giải gradient sử dụng metanol pha động thay (4.1) : dung dịch đệm phosphat, pH 4,5 11:9 phần thể tích Dung dịch phosphat làm dung dịch đệm chuẩn bị cách hòa tan 3,026 g kali dihydrophosphat 1l nước 8.3.5 Hàm lượng natamyxin thấp 8.3.5.1 Cô đặc Cần định có cần phải đặc khoảng lần 10 lần hay không Dựa vào định kết thu 8.3.4 giới hạn phát yêu cầu Sau dùng pipet lấy 25 ml 50 ml (đối với cô đặc lần 10 lần tương ứng) phần mẫu thử (8.2.1.2) cho vào cốc có mỏ Thêm 50 ml 100 ml nước tương ứng Hoạt hóa ống chiết (5.13) cách dùng ml đến ml metanol (4.1), sau rửa 10 ml nước Cho dung dịch mẫu thử pha loãng qua ống tốc độ ml/min đến ml/min xyranh (5.8) Dùng xyranh (5.8) lấy 10 ml nước để tráng ống Rửa giải natamyxin ml metanol (4.1), sử dụng xyranh (5.8) 8.3.5.2 Đo sắc ký lỏng hiệu cao Pha loãng dịch rửa giải (8.3.5.1) đến ml metanol (4.1) Tiến hành 8.3.4 Tính biểu thị kết 9.1 Tính hàm lượng natamyxin Hàm lượng natamyxin phần lỏng bơm mẫu thử có cách nội suy đường chuẩn (8.3.3) Hàm lượng natamyxin phần mẫu thử, w, tính miligam kilogam, theo công thức (1) sau đây: w c n xV m Trong (1) cn nòng độ natamyxin dung dịch thử (8.2.1.2 8.2.2.2), tính microgram mililít ( g/ml) m khối lượng phần mẫu thử (8.1.1 8.1.2), tính gam (g) V tổng thể tích dung dịch mẫu thử (8.2.1.1 8.2.2.1), tính mililít (ml) CHÚ THÍCH Khi dung dịch thử nghiệm thu từ phomat lấy mẫu cùi, w, hàm lượng natamyxin tích lũy vào phomat 9.2 Tính hàm lượng natamyxin liên quan đến diện tích bề mặt Lượng natamyxin liên quan đến diện tích bề mặt, mA,n tính miligam decimet vng, theo công thức (2) sau đây: m A,n wr x m A (2) Trong A diện tích phần mẫu thử cân (7.1) tính decimet vng (dm 2) m khối lượng phần mẫu thử cân (7.1), tính kilogam (kg); wr khối lượng natamyxin phần mẫu thử (7.1), tính miligam kilogam (mg/kg); 9.3 Hiệu chỉnh kết Nếu phần dịch lọc đặc 8.3.5, chỉnh kết thu w (9.1) mA,n (9.3) sau: a) cô đặc khoảng lần chia kết thu cho b) đặc khoảng 10 lần chia kết thu cho 10 Nếu cần phải xác định lặp lại hai lần với điều kiện lặp lại hai lần với điều kiện đáp ứng yêu cầu độ lặp lại, lấy hàm lượng natamyxin cuối mẫu thử trung bình kết hai lần xác định theo điều 10, làm tròn kết đến chữ số thập phân 9.4 Biểu thị kết Biểu thị kết đến chữ số thập phân 10 Độ chụm 10.1 Phép thử liên phòng thử nghiệm Các giá trị độ lặp lại độ tái lập thu từ kết phép thử liên phòng thử nghiệm phù hợp với ISO 5725 : 1986 [2] (đối với kết quả, xem [4]) 10.2 Độ lặp lại Chênh lệch tuyệt đối kết hai phép thử độc lập, đơn lẻ thu sử dụng phương pháp vật liệu thử giống hệt phòng thử nghiệm, người thực hiện, sử dụng thiết bị, thực khoảng thời gian ngắn, không % trường hợp vượt giá trị nêu Bảng B.1 10.3 Độ tái lập Chênh lệch tuyệt đối kết hai phép thử đơn lẻ, thu sử dụng phương pháp vật liệu thử giống hệt phòng thí nghiệm khác nhau, người khác thực hiện, sử dụng thiết bị khác nhau, không % trường hợp vượt giá trị nêu Bảng B.1 11 Báo cáo thử nghiệm Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ: a) thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ mẫu thử; b) phương pháp lấy mẫu sử dụng, biết; c) phương pháp thử nghiệm dùng, viện dẫn tiêu chuẩn này; d) chi tiết thao tác không quy định tiêu chuẩn điều coi tùy ý cố mà ảnh hưởng đến kết thử; e) kết thử nghiệm thu thỏa mãn yêu cầu độ lặp lại nêu kết cuối thu Phụ lục A (Tham khảo) Các ví dụ Chú dẫn phomat dao cùi trục Hình A.1 - Ví dụ máy thái phần mẫu thử cùi phomat có bề dày mm (5.2) Hình A.2 - Ví dụ máy cắt để cắt phần mẫu thử cùi phomat có bề dày mm (5.3) CHÚ DẪN A độ hấp thụ bước sóng AU đơn vị hấp thụ Hình A.3 - Sắc HPL mẫu dung dịch chuẩn chứa 0,5 g/kg natamyxin CHÚ DẪN A độ hấp thụ t thời gian AU đơn vị hấp thụ cùi phomat, hàm lượng natamyxin 61 mg/kg phomat, hàm lượng natamyxin 0,3 mg/kg cùi phomat, hàm lượng natamyxin 15 mg/kg 4, sau cô đặc lần phomat, hàm lượng natamyxin 1,7 mg/kg 4, sau đặc 10 lần Hình A.4 - Các ví dụ phổ dung dịch thử khác Phụ lục B (Tham khảo) Kết phép thử liên phòng thử nghiệm Các kết thử nghiệm cộng tác thu phù hợp với ISO 5725 : 1986, 36 phòng thử nghiệm tham gia thực năm 1984 sử dụng tám mẫu thử Các giá trị tính miligam decimet vng, tính từ giá trị tính theo miligam kilogam cùi phomat dày mm tỷ trọng 1,3 g/cm Bảng B.1 - Các số liệu độ chụm Natamyxin Độ lặp lại tương đối Độ tái lập tương đối frel = 2,83 x CV(r) Rrel = 2,83 x CV(R) % % 20,6 26 60 7,1 25,6 20 70 1,3 23,4 37 65 105 0,3b 29 39 80 110 Hệ số biến thiên lặp lại Hệ số biến thiên tái lập CV (r) CV(R) mg/kg % % 4a 60a 9,3 1a 15a Khối lượng liên quan đến diện tích bề mặt mg/dm2 0,08 Phần khối lượng b 0,02b b a Xác định trực tiếp b Xác định sau cô đặc 10 lần THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] TCVN 6400 (ISO 707), Sữa sản phẩm sữa - Hướng dẫn lấy mẫu [2] ISO 5725:1986, Precision of test methods - Determination of repeatability and reproducibility for a standard test method by inter-laboratory tests (nay hủy) [3] DERUIG WG., VAN OOSTROM J.J., LEENHEER K Spectrometry and liquid chromatographic determination of natamycin in cheese and cheese rind J Assoc Off Chem., 1987, 70 pp.944-8 [4] DERUIG, W.G Determination of natamycin in cheese and cheese rind: Interlaboratory collaborative study J.Assoc Off Anal Chem., 1987, 70, pp 949-54 ... Phương pháp lấy mẫu không qui định tiêu chuẩn Nên lấy mẫu theo TCVN 6400 (ISO 707) Mẫu phòng thử nghiệm phải phomat nguyên phần phomat đại diện cho khối phomat Chuẩn bị mẫu thử 7.1 Cùi phomat Cắt... cô đặc 10 lần THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] TCVN 6400 (ISO 707), Sữa sản phẩm sữa - Hướng dẫn lấy mẫu [2] ISO 5725:1986, Precision of test methods - Determination of repeatability and reproducibility... pháp lấy mẫu sử dụng, biết; c) phương pháp thử nghiệm dùng, viện dẫn tiêu chuẩn này; d) chi tiết thao tác không quy định tiêu chuẩn điều coi tùy ý cố mà ảnh hưởng đến kết thử; e) kết thử nghiệm