Tiêu chuẩn Quốc gia TCVN 8180-1:2009 - ISO 9233-1:2007. Tiêu chuẩn giới thiệu về phomat, cùi phomat và phomat chế biến - xác định hàm lượng natamyxin - phần 1: Phương pháp đo phổ hấp thụ phân tử đối với cùi phomat. Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định hàm lượng natamyxin cao hơn 0,5 mg/kg trong cùi phomat và hàm lượng natamyxin cao hơn 0,03 mg/dm2 liên quan đến diện tích bề mặt.
TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 8180-1 : 2009 ISO 9233-1 : 2007 PHOMAT, CÙI PHOMAT VÀ PHOMAT CHẾ BIẾN - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG NATAMYXIN PHẦN 1: PHƯƠNG PHÁP ĐO PHỔ HẤP THỤ PHÂN TỬ ĐỐI VỚI CÙI PHOMAT Cheese, cheese rind and processed cheese – Determination of natamycin content – Part : Molecular absorption spectrometric method for cheese rind Lời nói đầu TCVN 8180-1 : 2009 hồn tồn tương đương với ISO 9233-1 : 2007; TCVN 8180-1 : 2009 Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F12 Sữa sản phẩm sữa biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng đề nghị, Bộ Khoa học Công nghệ công bố Bộ tiêu chuẩn TCVN 8180 (ISO 9233) gồm tiêu chuẩn sau: - TCVN 8180-1 : 2009 (ISO 9233-1 : 2007) Phomat, cùi phomat phomat chế biến – Xác định hàm lượng natamyxin – Phần : Phương pháp đo phổ hấp thụ phân tử cùi phomat; - TCVN 8180-2 : 2009 (ISO 9233-2 : 2007) Phomat, cùi phomat phomat chế biến – Xác định hàm lượng natamyxin – Phần : Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao phomat, cùi phomat phomat chế biến PHOMAT, CÙI PHOMAT VÀ PHOMAT CHẾ BIẾN – XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG NATAMYXIN PHẦN : PHƯƠNG PHÁP ĐO PHỔ HẤP THỤ PHÂN TỬ ĐỐI VỚI CÙI PHOMAT Cheese, cheese rind and processed cheese – Determination of natamycin content – Part 1: Molecular absorption spectrometric method for cheese rind Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn quy định phương pháp xác định hàm lượng natamyxin cao 0,5 mg/kg cùi phomat hàm lượng natamyxin cao 0,03 mg/dm2 liên quan đến diện tích bề mặt CHÚ THÍCH Phương pháp dùng để phát natamyxin có phomat Thuật ngữ định nghĩa Trong tiêu chuẩn sử dụng thuật ngữ định nghĩa sau đây: 2.1 Hàm lượng natamyxin (natamycin content) Phần khối lượng chất xác định phương pháp quy định tiêu chuẩn CHÚ THÍCH Hàm lượng natamyxin tính miligam kilogram 2.2 Hàm lượng natamyxin liên quan đến diện tích bề mặt cùi phomat (surface-arearelated natamycin mass in cheese rind) Phần khối lượng chất liên quan đến diện tích bề mặt xác định phương pháp quy định tiêu chuẩn CHÚ THÍCH Hàm lượng natamyxin liên quan đến diện tích bề mặt tính miligam natamyxin decimet vng cùi phomat 2.3 Cùi phomat Lớp ngồi phomat có bề dày mm, ngoại trừ lớp bao phủ, có Nguyên tắc Phần mẫu thử biết chiết metanol Dịch chiết pha loãng nước làm lạnh đến khoảng từ âm 15 oC đến âm 20 oC để làm kết tủa hết tất chất béo, lọc Hàm lượng natamyxin lượng natamyxin liên quan đến diện tích bề mặt xác định dịch lọc (sau cô đặc, cần) phương pháp đo phổ hấp thụ phân tử Thuốc thử Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích nước cất nước loại khống nước có độ tinh khiết tương đương, trừ có quy định khác 4.1 Metanol (CH3OH) 4.2 Metanol, dung dịch nước Trộn thể tích metanol (4.1) với thể tích nước 4.3 Dung dịch chuẩn natamyxin 4.3.1 Dung dịch chuẩn gốc natamyxin, nồng độ 500 mg/l Ngay trước sử dụng, hòa tan metanol (4.1) lượng chế phẩm natamyxin biết trước hàm lượng natamyxin, tương ứng với 50mg natamyxin tinh khiết (C 33H47NO13) bình định mức vạch 100 ml (5.1) Thêm nước đến vạch trộn 4.3.2 Dung dịch chuẩn làm việc natamyxin, nồng độ mg/l Dùng pipet lấy 5,0 ml dung dịch chuẩn gốc natamyxin (4.3.1) cho vào bình định mức vạch 50 ml (5.1) Pha lỗng dung dịch metanol nước (4.2) đến vạch trộn Dùng pipet lấy 5,0 ml dung dịch pha lỗng cho vào bình định mức vạch 50 ml (5.1) Pha loãng dung dịch metanol nước (4.2) đến vạch trộn Nồng độ natamyxin dung dịch chuẩn làm việc µg/ml Nồng độ phải gần nồng độ dung dịch thử đo 8.3.3 Chỉnh dung dịch chuẩn làm việc cách dùng pipet pha loãng lượng khác, cần Thiết bị, dụng cụ Sử dụng thiết bị phòng thử nghiệm thơng thường cụ thể sau: 5.1 Bình định mức vạch, dung tích 50 ml 100 ml 5.2 Máy thái dụng cụ tương tự, cắt phần phomat dày mm rộng khoảng 30 mm (xem ví dụ Hình A.1) 5.3 Máy cắt, cắt mỏng lát phomat dày mm (xem ví dụ Hình A.2) 5.4 Máy nghiền máy trộn 5.5 Dao sắc, cắt lát phomat thành miếng nhỏ 5.6 Máy khuấy từ máy lắc 5.7 Bình nón, dung tích 100 ml 200 ml , thủy tinh màu đậy nút thủy tinh mài 5.8 Xyranh, dung tích 10 ml, loại dùng lần 5.9 Màng lọc micro, cỡ lỗ 0,20 µm đến 0,45 µm, bền với dung dịch cồn 5.10 Giấy lọc gấp nếp, tốc độ nhanh, đường kính 150 mm (ví dụ: S S số 595 1/2) 1) 5.11 Phễu chiết, đường kính khoảng 70 mm 5.12 Tủ đơng lạnh, làm đơng lạnh khoảng từ âm 15 oC đến âm 20 oC 5.13 Cột chiết, để đặc dịch lọc, cần [ví dụ: Sep-pac C181) Waters số 519101)] 5.14 Máy đo phổ, thích hợp để ghi phổ UV bước song từ 300 nm đến 340 nm, có cuvet 10 mm máy ghi 5.15 Bình đựng mẫu, có dung tích thích hợp Lấy mẫu Mẫu gửi đến phòng thử nghiệm phải mẫu đại diện Mẫu không bị hư hỏng thay đổi suốt trình vận chuyển bảo quản Phương pháp lấy mẫu không quy định tiêu chuẩn Nên lấy mẫu theo TCVN 6400 (ISO 707) Mẫu phòng thử nghiệm phải phomat nguyên phần phomat đại diện cho khối phomat Chuẩn bị mẫu thử 7.1 Cùi phomat Cắt mẫu thử thành phần phần nhỏ cho chiều rộng cùi phomat không lớn 30 mm, cần Dùng máy thái (5.2) loại toàn cùi từ tất phần thu cách cắt miếng có bề dày tối đa mm Từ phần cùi thu được, cắt dao sắc (5.5), cắt lát hình chữ nhật có diện tích từ dm đến dm2 Xác định diện tích bề mặt, tính theo decimet vng khồi lượng tính theo kilogram Dùng máy nghiền (5.4) cẩn thận nghiền toàn cùi, miếng cân đo trộn kỹ Chuyển phần mẫu thử chuẩn bị sang bình đựng mẫu (5.15) Sau chuẩn bị xong mẫu thử, rửa tất dụng cụ tiếp xúc với mẫu nước nóng sau metanol (4.1) Làm khơ dụng cụ rửa, ví dụ: dùng luồng khơng khí nén 7.2 Lõi phomat Sau loại bỏ cùi (7.1), dùng máy cắt (5.3) loại bỏ lớp tối đa mm từ phần cắt bỏ cùi mẫu phomat Cắt tất lát phomat thành miếng nhỏ khoảng 50 mm trộn kỹ Chuyển phần mẫu thử chuẩn bị sang bình đựng mẫu (5.15) Sau chuẩn bị xong mẫu thử, rửa tất dụng cụ tiếp xúc với mẫu nước nóng sau metanol (4.1) Làm khơ dụng cụ rửa, ví dụ: dùng luồng khơng khí nén Cách tiến hành 8.1 Phần mẫu thử 8.1.1 Cùi phomat Cân khoảng 10,00 g mẫu thử (7.1), xác đến 10 mg, cho vào bình nón dung tích 200 ml (5.7) 1) Đây ví dụ sản phẩm có bán sẵn Thơng tin đưa tạo thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn ISO không ấn định phải sử dụng sản phẩm 8.1.2 Lõi phomat Cân khoảng 5,00 g mẫu thử (7.2), xác đến 10 mg, cho vào bình nón dung tích 100 ml (5.7) 8.2 Chuẩn bị dung dịch thử 8.2.1 Cùi phomat 8.2.1.1 Bước ban đầu Cho 100 ml metanol (4.1) vào phần mẫu thử bình nón (8.1.1) Dùng máy khuấy từ (5.6) để khuấy lượng chứa bình nón 90 lắc 90 máy lắc (5.6) Thêm 50 ml nước Đặt bình nón vào tủ đơng lạnh (5.12) khoảng 60 8.2.1.2 Lọc Lọc dịch chiết lạnh qua giấy lọc gấp nếp (5.10) loại bỏ ml dịch lọc Lọc huyền phù lạnh để tránh làm tan chất béo chất béo bị đục Đưa dịch lọc nhiệt độ phòng Dùng xyranh (5.8) lấy phần dịch lọc Lọc qua màng lọc micro cỡ lỗ 0,45 µm (5.9) lọc tiếp qua màng lọc micro cỡ lỗ 0,20 µm (5.9) Lượng dung dịch mẫu thử (dịch lọc) tối thiểu ml để đo trực tiếp (8.3.3) 25 ml 50 ml để đo nồng độ cao gấp 10 lần (8.3.4) tương ứng 8.2.2 Lõi phomat 8.2.2.1 Bước ban đầu Dùng ống đong lấy 50 ml metanol (4.1) cho vào phần mẫu thử bình nón (8.1.2) Dùng máy khuấy từ (5.6) để khuấy lượng chứa bình nón 90 lắc 90 máy lắc (5.6) Dùng ống đong cho thêm 25 ml nước Đặt bình nón vào tủ đơng lạnh (5.12) khoảng 60 8.2.2.2 Lọc Tiến hành lọc 8.2.1.2 8.3 Xác định 8.3.1 Xác định giới hạn phát Phòng thử nghiệm sử dụng phương pháp thiết lập giới hạn phát xác định điều kiện thiết bị sử dụng phương pháp tính tốn cơng nhận để xác nhận hàm lượng natamyxin cần xác định xuống đến 0,5 mg/kg 0,03 mg/dm 8.3.2 Độ hấp thụ UV dung dịch chuẩn làm việc natamyxin Ghi lại phổ dung dịch chuẩn làm việc natamyxin (4.3.2) dải từ 300 nm đến 340 nm Đo độ hấp thụ natamyxin tối đa khoảng 317 nm, tối thiểu khoảng 311 nm xác 329 nm Sử dụng metanol (4.2) làm dung dịch thử trắng Một ví dụ phổ dung dịch chuẩn làm việc natamyxin nêu Hình A.3 Vì natamyxin khơng ổn định dung dịch metanol, cần tiến hành phép đo 8.3.3 Dung dịch thử Ghi lại phổ dung dịch thử (8.2.1.2 8.3.4.2 8.2.2.2) với metanol (4.2) làm mẫu trắng dải từ 300 nm đến 340 nm Ngoài ra, ghi lại phổ dung dịch thử cùi phomat (8.2.1.2 8.3.4.2) với dung dịch thử lõi phomat (8.2.2.2) làm mẫu trắng dải bước sóng Ghi lại độ hấp thụ dung dịch thử cùi phomat (8.2.1.2 8.3.4.2) với dung dịch thử lõi phomat (8.2.2.2) làm mẫu trắng độ hấp thụ tối đa khoảng 317 nm tối thiểu khoảng 311 nm xác 329 nm Các ví dụ phổ dung dịch thử đưa Hình A.4 Nếu hàm lượng natamyxin mẫu thử (7.1) thấp mà phát gần phát (tỷ lệ tín hiệu-nhiễu nhỏ 3), cần phải xác định tiến hành theo 8.3.4 CHÚ THÍCH Sự có mặt gia vị, cụ thể hạt tiêu, phomat gây nhiễu cho kết quả, mà cho thấy méo rõ đường hấp thụ Các ví dụ phổ dung dịch thử khác phomat nêu Hình A.4 8.3.4 Hàm lượng natamyxin thấp 8.3.4.1 Cơ đặc Nên định có cần phải đặc khoảng lần 10 lần hay không Dựa vào định kết thu 8.3.3 giới hạn phát yêu cầu Sau dùng pipet lấy 25 ml 50 ml (đối với cô đặc lần 10 lần tương ứng) phần mẫu thử (8.2.1.2) cho vào cốc có mỏ Thêm 50 ml 100 ml nước tương ứng, tùy thuộc vào việc đặc u cầu trộn Hoạt hóa ống chiết (5.13) cách dùng ml đến ml metanol (4.1) Rồi rửa 10 ml nước Cho dung dịch mẫu thử pha loãng qua ống tốc độ ml/min đến ml/min xyranh (5.8) Dùng xyranh (5.8) tráng cột 10 ml nước Rửa giải natamyxin ml metanol (4.1), xyranh (5.8) 8.3.4.2 Đo phổ Thêm 1,5 ml nước vào dịch rửa giải (8.3.4.1) trộn Hút dung dịch vào xyranh (5.8) Lọc dung dịch qua màng lọc micro cỡ lỗ 0,45 µm (5.9) lọc tiếp qua màng lọc micro cỡ lỗ 0,20 µm (5.9) Tiến hành 8.3.3 Tính biểu thị kết 9.1 Tính hàm lượng natamyxin Hàm lượng natamyxin mẫu thử, w, tính miligam kilogram, theo công thức (1) sau đây: W= At cn V As m (1) At chênh lệch độ hấp thụ thực dung dịch mẫu thử cùi phomat đo dựa theo dung dịch thử lõi phomat 317 nm (8.3.3); cn nồng độ natamyxin dung dịch chuẩn làm việc natamyxin (4.3.2), tính microgram mililit (µg/ml); V tổng thể tích dung dịch mẫu thử (8.2.1.2), tính mililit (ml); As giá trị độ hấp thụ thực dung dịch chuẩn làm việc natamyxin 317 nm (8.3.2); m khối lượng phần mẫu thử (8.1), tính gam (g) 9.2 Tính độ hấp thụ As lấy từ phổ UV dung dịch chuẩn làm việc natamyxin (xem ví dụ Hình A.3), sử dụng đường thẳng độ hấp thụ 311 nm 329 nm đường tính theo công thức (2) sau đây: As = As1 - As As 3 (2) As1 độ hấp thụ tối đa dung dịch chuẩn làm việc natamyxin (8.3.2) bước sóng 317 nm; As2 độ hấp thụ tối thiểu dung dịch chuẩn làm việc natamyxin (8.3.2) bước sóng 311 nm; As3 độ hấp thụ dung dịch chuẩn làm việc natamyxin (8.3.2) bước sóng 329 nm; At lấy từ phổ UV dung dịch thử cùi phomat dựa vào dung dịch thử lõi phomat, sử dụng đường thẳng độ hấp thụ 311 nm 329 nm đường tính theo cơng thức (3) sau đây: At = At1 - At At 3 (3) At1 độ hấp thụ tối đa dung dịch thử cùi phomat dựa vào dung dịch thử lõi phomat bước sóng 317 nm (8.3.3); At2 độ hấp thụ tối thiểu dung dịch thử cùi phomat dựa vào dung dịch thử lõi phomat bước sóng 311 nm (8.3.3); At3 độ hấp thụ dung dịch thử cùi phomat dựa vào dung dịch thử lõi phomat bước sóng 329 nm (8.3.3); 9.3 Tính lượng natamyxin liên quan đến diện tích bề mặt Lượng natamyxin liên quan đến diện tích bề mặt, mA,n tính miligam decimet vng, theo cơng thức (4) sau đây: mA,n = W x m A (4) W khối lượng natamyxin phần mẫu thử (9.1), tính miligam kilogram (mg/kg); m khối lượng phần mẫu thử cân (7.1), tính kilogram (kg); A diện tích phần mẫu thử cân (7.1) tính decimet vng (dm 2) 9.4 Hiệu chỉnh kết Nếu phần dịch lọc đặc 8.3.4, chỉnh kết thu w (9.1) mA,n (9.3) sau: a) đặc khoảng lần chia kết thu cho 5,6 b) đặc khoảng 10 lần chia kết thu cho 11,1 Nếu cần phải xác định lặp lại hai lần với điều kiện đáp ứng yêu cầu độ lặp lại, lấy hàm lượng natamyxin cuối mẫu thử trung bình kết hai lần xác định theo Điều 10, làm tròn kết đến chữ số thập phân 9.5 Biểu thị kết Biểu thị kết thu đến chữ số thập phân 10 Độ chụm 10.1 Phép thử liên phòng thử nghiệm Các giá trị độ lặp lại độ tái lập thu từ kết phép thử liên phòng thử nghiệm phù hợp với ISO 5725 : 1986)[2] (đối với kết quả, xem [4]) 10.2 Độ lặp lại Chênh lệch tuyệt đối kết hai phép thử độc lập, đơn lẻ thu sử dụng phương pháp vật liệu thử giống hệt phòng thử nghiệm, người thực hiện, sử dụng thiết bị, thực khoảng thời gian ngắn, không % trường hợp vượt giá trị nêu Bảng B.1 10.3 Độ tái lập Chênh lệch tuyệt đối kết hai phép thử độc lập, thu sử dụng phương pháp vật liệu thử giống hệt phòng thử nghiệm khác nhau, người khác thực hiện, sử dụng thiết bị khác nhau, không % trường hợp vượt giá trị nêu Bảng B.1 11 Báo cáo thử nghiệm Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ: a) thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ mẫu thử; b) phương pháp lấy mẫu sử dụng, biết; c) phương pháp thử nghiệm dùng, viện dẫn tiêu chuẩn này; d) chi tiết thao tác không quy định tiêu chuẩn điều coi tùy ý cố mà ảnh hưởng đến kết thử; e) kết thử nghiệm thu thỏa mãn yêu cầu độ lặp lại nêu kết cuối thu Phụ lục A (Tham khảo) Các ví dụ Kích thước tính milimet CHÚ DẪN Phomat Dao Cùi Trục Hình A.1 – Ví dụ máy thái để cắt phần mẫu thử cùi phomat có bề dày mm (5.2) Hình A.2 – Ví dụ máy cắt để cắt phần mẫu thử cùi phomat có bề dày mm (5.3) CHÚ DẪN A độ hấp thụ bước sóng mẫu mẫu trắng Hình A.3 – Ví dụ phổ dung dịch chuẩn natamyxin dung dịch trắng CHÚ DẪN A độ hấp thụ bước sóng AU đơn vị hấp thụ cùi phomat, hàm lượng natamyxin 61 mg/kg phomat, hàm lượng natamyxin 0,3 mg/kg cùi phomat, hàm lượng natamyxin 15 mg/kg 4, sau cô đặc lần phomat, hàm lượng natamyxin 1,7 mg/kg 4, sau đặc 10 lần Hình A.4 – Ví dụ phổ dung dịch thử khác CHÚ DẪN A độ hấp thụ bước sóng Hình A.5 – Ví dụ phổ UV mẫu chứa natamyxin Phụ lục B (Tham khảo) Kết phép thử liên phòng thử nghiệm Các kết thử nghiệm cộng tác thu phù hợp với ISO 5725 : 1986, 36 phòng thử nghiệm tham gia thực năm 1984 sử dụng mẫu Các giá trị tính miligam decimet vng, tính từ giá trị tính theo miligam kilogram cùi phomat dày mm tỷ trọng 1,3 g cm Bảng B.1 – Các số liệu độ chụm Natamyxin Hệ số biến thiên lặp lại Hệ số biến thiên tái lập Độ lặp lại tương đối Độ tái lập tương đối CV (r) CV (R) rrei = Rrei = % % 2,83 x CV(r) 2,83 x CV(R) % % Khối lượng liên quan đến diện tích bề mặt mg/dm2 Phần khối lượng 4a 60a 5,9 12,2 16 35 a a 6,2 11,9 17 35 mg/kg 15 0,08b 1,3b 16,5 35 45 100 b b 42,5 60 120 170 0,02 0,3 a Xác định trực tiếp b Xác định sau cô đặc 10 lần THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] TCVN 6400 (ISO 707), Sữa sản phẩm sữa – Hướng dẫn lấy mẫu [2] ISO 5725 : 1986, Độ xác phương pháp thử Xác định độ lặp lại độ tái lập phương pháp thử chuẩn phép thử liên phòng thử nghiệm [3] DERUIG WG.,VAN OoSTROM J.J., LEENHEER, K Spectrometry and liquid chromatographic determination of natamycin in cheese rind J Assoc Off Anal Chem., 1987,70, pp 944-8 [4] DERUIG, W.G Determination of natamycin in cheese and cheese rind: Interlaboratory collaborative study J.Assoc Off Anal Chem., 1987, 70, pp 949-54 ... Phương pháp lấy mẫu không quy định tiêu chuẩn Nên lấy mẫu theo TCVN 6400 (ISO 707) Mẫu phòng thử nghiệm phải phomat nguyên phần phomat đại diện cho khối phomat Chuẩn bị mẫu thử 7.1 Cùi phomat Cắt... cho người sử dụng tiêu chuẩn ISO không ấn định phải sử dụng sản phẩm 8.1.2 Lõi phomat Cân khoảng 5,00 g mẫu thử (7.2), xác đến 10 mg, cho vào bình nón dung tích 100 ml (5.7) 8.2 Chuẩn bị dung dịch... pháp lấy mẫu sử dụng, biết; c) phương pháp thử nghiệm dùng, viện dẫn tiêu chuẩn này; d) chi tiết thao tác không quy định tiêu chuẩn điều coi tùy ý cố mà ảnh hưởng đến kết thử; e) kết thử nghiệm