Mục tiêu nghiên cứu của bài viết nhằm thiết kế phản ứng RT-PCR (Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction) phát hiện đồng thời 5 loài virut Ebola, góp phần chẩn đoán nhanh, chính xác, kịp thời ngăn chặn và kiểm soát lây lan của dịch bệnh do virut Ebola.
Trang 1PHÁT TRIỂN KỸ THUẬT REVERSE TRANSCRIPTION
POLYMERASE CHAIN REACTION XÁC ĐỊNH VIRUT EBOLA
Nguyễn Văn An*; Nguyễn Thái Sơn*; Bùi Tiến Sỹ**
Hoàng Xuân Sử***; Hồ Hữu Thọ***; Đinh Thị Thu Hằng***
TÓM TẮT
Mục tiêu: thiết kế phản ứng RT-PCR (Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction) phát
hiện đồng thời 5 loài virut Ebola, góp phần chẩn đoán nhanh, chính xác, kịp thời ngăn chặn và kiểm soát lây lan của dịch bệnh do virut Ebola Vật liệu và phương pháp: các trình tự toàn bộ bộ gen của
5 loài virut Ebola được thu thập từ Ngân hàng dữ liệu GenBank Sử dụng phần mềm tin sinh học thiết kế mồi đặc hiệu với virut Ebola, thực hiện phản ứng RT-PCR với các cặp mồi vừa thiết kế trên
mẫu ARN chuẩn dương và chuẩn âm bằng bộ kít One-Step RT-PCR (Thermo Fisher, Mỹ) Kết quả:
thiết kế được 01 mồi xuôi (Ebo-pan-Fwd: GTGTGCGARTAACTAYGAGGAAG), 02 mồi ngược (Ebo-pan-Rev2: GGATGACTCTTTGYCGMACAAT, Ebo-pan-Rev3: GGCATGGCAGCMARTGTTCTC) Kết quả thực hiện phản ứng RT-PCR sử dụng bộ kít One-Step RT-PCR (Thermo Fisher, Mỹ) đối với chuẩn dương ARN của virut Ebola chủng Zaire Mayinga (giáo sư Jonas Schmidt-Chanasit ở Viện Y học Nhiệt đới Bernhard Nocht, Hamburg, Cộng hòa Liên bang Đức cung cấp) cho 2 băng đặc hiệu với Ebola có kích thước lần lượt là 541 bp, 830 bp; không xuất hiện
băng đặc hiệu đối với mẫu chuẩn âm là virut Dengue Kết luận: đã thiết kế thành công phản
ứng RT-PCR chẩn đoán virut Ebola
* Từ khóa: Virut Ebola; RT-PCR; Zaire Ebola
Development and Validation of One-Step Reverse-Transcription-PCR for Simultanous Detection of Five Ebolavirus Species
Summary
Objectives: To establish one-step RT-PCR for simultanous detection of five Ebolavirus
species Materials and methods: Full genome sequences of five Ebolavirus species retrieved
from the Genebank for design of primers using Primer Express software RT-PCR has been optimized and validated with the positive and negative standards using One-Step RT-PCR kit (Thermo Fisher, USA) Results and conclusions: We designed one forward primer and two reverse primers with following sequences: Ebo-pan-Fwd: GTGTGCGARTAACTAYGAGGAAG, Ebo-pan-Rev2: GGATGACTCTTTGYCGMACAAT, Ebo-pan-Rev3: GGCATGGCAGCMARTGTTCTC, respectively Primer pairs above were tested with the positive standard (Zaire Virut Ebola Mayinga, kindly provided by Pr Jonas Schmidt-Chanasit, Bernhard Nocht Institute for Tropical Medicine, Hamburg, Germany) using One-Step RT-PCR kit (Thermo Fisher, USA) Clear and specific bands were detected at 354 bp for Ebo-pan-Rev2 and 830 bp Ebo-pan-Rev3, respectively
* Bệnh viện Quân y 103
** Bệnh viện TWQĐ 108
*** Học viện Quân y
Người phản hồi (Corresponding): Nguyễn Văn An (ank59hvqy@gmail.com)
Ngày nhận bài: 30/06/2016; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 07/09/2016
Ngày bài báo được đăng: 29/09/2016
Trang 2The specificity of this assay was 100% as verified by testing with RNA extracted from plasma in
patients infected with Dengue virus Conclusion: We have developed and validated successfully
one-step reverse transcription-PCR for simultanous detection of five Ebolavirus species
* Key words: Ebolavirus; RT-PCR; Zaire Ebola
ĐẶT VẤN ĐỀ
Virut Ebola gồm 5 lồi E Sudan,
E Zaire, E Bundibugyo, E Tạ Forest,
E Reston được phát hiện lần đầu tiên tại
Trung Phi năm 1976 từ hai đại dịch ở
Sudan và Congo [1] Dịch virut Ebola
(EVD) bùng phát ở Tây Phi từ cuối năm
2013, là vụ dịch kéo dài nhất và gây tử
vong nhiều nhất trong số các vụ dịch do
virut Ebola được ghi nhận từ trước đến
nay, đặc biệt lần đầu tiên dịch virut Ebola
vượt ra khỏi ranh giới Trung Phi Tính
đến ngày 27 - 03 - 2016, theo Tổ chức Y
tế Thế giới (WHO), vụ dịch này đã cĩ đến
28.646 người mắc bệnh ở 10 quốc gia
khác nhau, với số ca tử vong lên đến trên
11.323 người [2] Hiện nay trong các
phương pháp chẩn đốn Ebola, sinh học
phân tử là phương pháp cĩ độ nhạy, độ
đặc hiệu cao, thời gian cho kết quả nhanh
[3] Cĩ nhiều nghiên cứu đã sử dụng
RT-PCR (Reverse transcription-RT-PCR) chẩn
đốn Ebola như: Jonathan S sử dụng
RT-PCR phát hiện E Sudan, E Zaire trong
máu tại vụ dịch ở Uganda năm 2000 [4],
Yohei Kurosaki sử dụng kỹ thuật
RT-LAMP (Reverse Transcription-Loop
Mediated Isothermal Amplification) để
chẩn đốn E Zaire [5], Lui L sử dụng
realtime RT-PCR để chẩn đốn E Zaire
tại vụ dịch ở Sierra Leone năm 2014 [6]
Trong nghiên cứu này, chúng tơi tiến
hành thiết kế phản ứng RT-PCR chẩn
đốn đồng thời cả 5 lồi virut Ebola gĩp
phần phát hiện nhanh, chính xác để kịp
thời ngăn chặn và kiểm sốt sự lây lan của dịch virut Ebola
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
* Vật liệu:
- Chuẩn dương: ARN tách từ tế bào
lây nhiễm chủng virut Zaire Ebola Mayinga do Viện Y học Nhiệt đới
Bernhard Nocht (Harmbug, Đức) trao tặng
- Hĩa chất: tris base, Taq-polymerase, trizol (Sigma, Mỹ), kít QIAGEN One-Step RT-PCR
- Thiết bị: GeneAmp PCR System
9700 (Thermo Fisher, Mỹ), máy chụp ảnh gel Dolphin-Doc (Vealtec, Mỹ)
2 Phương pháp nghiên cứu
- Sử dụng phần mềm tin sinh học kết hợp với thực nghiệm labo
- Phần mềm sử dụng: BioEdit v7.9, Clone Manager Professional v9 để tìm ra thơng số của mồi và thiết kế mồi
- Trình tự tồn bộ bộ gen virut Ebola
của cả 5 lồi: E Sudan, E.Zaire, E
Bundibugyo, E Tạ Forest, E Reston thu
thập từ Ngân hàng Gen GenBank
76 trình tự tồn bộ bộ gen của của 5 lồi virut Ebola được thu thập từ Ngân hàng Gen GenBank của NCBI (National Center for Biotechnology Information):
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/Viru sVariation/Database/nph-select.cgi,
trong đĩ 50 trình tự E Zaire, 6 trình tự
Trang 3E Sudan, 3 trình tự E Bundibugyo, 1
trình tự E Tạ Forest, 16 trình tự E
Reston Hình 1 minh họa các bước thu thập
trình tự tồn bộ bộ gen của virut Ebola
Để tăng tính đa dạng cho dữ liệu gốc các trình tự tham chiếu, chúng tơi lựa chọn trình tự các chủng Ebola ở nhiều vùng địa
lý khác nhau và thời điểm khác nhau
Hình 1: Dữ liệu bộ gen virut Ebola trên GenBank.
- Kỹ thuật RT-PCR: cADN tổng hợp từ ARN chuẩn dương và ARN chuẩn âm thơng qua phản ứng phiên mã ngược dùng làm khuơn cho phản ứng PCR
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN
1 Kết quả thiết kế mồi
Bộ gen của virut Ebola cĩ kích thước khoảng 19 kb, gồm 7 gen: nucleprotein (NP), viral protein (VP) 35 - VP40 - glycoprotein - VP30 - VP24 - ARN polymerase (L), trong
đĩ gen NP được coi là khá bảo tồn trong bộ gen của virut Ebola và được nhiều nghiên cứu trước đây sử dụng làm đích phát hiện để thiết kế phản ứng RT-PCR chẩn đốn virut Ebola [5, 7] Sau khi cĩ được trình tự vùng khơng mã hĩa đầu 3’ và tồn bộ gen
NP, sử dụng lệnh chọn vùng bảo tồn với một trình tự cĩ sẵn trong cửa sổ của phần mềm BioEdit 7.9, chúng tơi lựa chọn 01 mồi xuơi và 02 mồi ngược cho phản ứng RT-PCR phát hiện đồng thời 5 lồi virut Ebola, ký hiệu lần lượt là Fwd, Pan-Ebo-Rev2 và Pan-Ebo-Rev3
Bảng 1: Trình tự mồi của phản ứng RT-PCR chẩn đốn Ebola
Trang 4
Hình 2: Trình tự và vị trí của mồi Pan-Ebo-Fdw, Pan-Ebo-Rev2, Pan-Ebo-Rev3
Các trình tự mồi đều được kiểm tra lại bằng công cụ Blast nucleotid để kiểm tra sự bắt cặp chéo với các chủng virut ngoài Ebola, kết quả cho thấy: 100% trình tự giống với trình tự mồi của Ebola Kết quả kiểm tra mồi Pan-Ebo-Rev2 biểu thị ở hình 3 và bằng đường link http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi
Hình 3: Kiểm tra loại trừ sự bắt chéo với các virut khác của mồi Pan-Ebo-Rev2
2 Kết quả phản ứng RT-PCR trên mẫu ARN Zaire Ebola Mayinga và ARN virut
Dengue
* Quy trình thực hiện phản ứng RT-PCR chẩn đoán virut Ebola bằng bộ kít QIAGEN One-Step RT-PCR:
- Chuẩn bị ARN primer mix: primer reverse 10 µM (1 µl), primer foward 10 µM (1 µl), ARN template (4 µl): 750C/5 phút, làm lạnh ngay trong đá 5 phút
- Thành phần phản ứng RT-PCR: ARN primer mix (6 µl), Buffer 5x (5 µl), dNTP mix (0,5 µl), ARNse Inhibitor (0,5 µl), RT-PCR enzyme mix (0,5 µl), H2O (12,5 µl)
Trang 5- Chu trình nhiệt: 42°C/30 phút - 95°C/3 phút - (95°C/30 giây - 50°C/30 giây - 72°C/45 giây) x 30 chu kỳ - 75°C/5 phút
Hình 4: Kết quả phản ứng RT-PCR chẩn đoán Ebola
Kết quả hình 4 cho thấy 2 phản ứng
RT-PCR với cả 01 mồi xuôi và 02 mồi
ngược đều cho kết quả dương tính, band
điện di đặc hiệu xuất hiện với kích thước
541 bp và 830 bp Tuy nhiên, mặc dù kích
thước sản phẩm dài hơn, nhưng hiệu quả
khuếch đại của mồi xuôi Pan-Ebo-Fwd và
mồi ngược Pan-Ebo-Rev3 lớn hơn nhiều
so với phản ứng PCR với cặp mồi
Pan-Ebo-Fwd và mồi ngược Pan-Ebo-Rev2
Chúng tôi tiếp tục tiến hành các phản ứng
PCR khác nhau với cặp mồi
Pan-Ebo-Fwd và Pan-Ebo-Rev3 để tối ưu hóa quy
trình RT-PCR phát hiện cả 5 loài virut Ebola trong những nghiên cứu tiếp theo
Để khẳng định sản phẩm PCR chứa band đặc hiệu của virut Ebola, chúng tôi tiến hành tinh sạch sản phẩm PCR và giải trình tự trên hệ thống ABI-1300, kết quả giải trình tự đối chiếu với Ngân hàng GenBank bằng công cụ Blast Nuclecotid Kết quả phân tích trình tự thu được cho thấy đây là trình tự đặc hiệu của virut
Zaire Ebola Hình 5 biểu hiện kết quả đối
chiếu trình tự của sản phẩm PCR sau khi giải trình tự bằng công cụ blast nucleotid
M: Marker 100 bp Giếng 1: phản ứng RT-PCR sử dụng cặp mồi Ebo-pan-Fwd/Rev3 với mẫu chuẩn dương
Zaire Ebola Mayinga
Giếng 2: phản ứng RT-PCR sử dụng cặp mồi Ebo-pan-Fwd/Rev2 với mẫu chuẩn dương
Zaire Ebola Mayinga
Giếng 3: phản ứng RT-PCR với mẫu chuẩn âm RNA virut Dengue
Trang 6Hình 5: Kết quả blast nucleotid của trình tự sản phẩm RT-PCR thu được
KẾT LUẬN
Thiết kế thành công phản ứng
RT-PCR xác định virut Ebola với 01 mồi xuôi
Fwd), 02 mồi ngược
(Ebo-pan-Rev2, Ebo-pan-Rev3) Kết quả thực hiện
phản ứng RT-PCR đối với chuẩn dương
ARN virut Zaire Ebola Mayinga cho 2
băng đặc hiệu với virut Ebola có kích
thước là 541 bp, 830 bp,không xuất hiện
băng đặc hiệu đối với mẫu chuẩn âm là
virut Dengue Thành phần phản ứng
RT-PCR gồm: ARN primer mix (6 µl), Buffer 5
x (5 µl), dNTP mix (0,5 µl), ARNse
Inhibitor (0,5 µl), RT-PCR enzyme mix
(0,5 µl), H2O (12,5 µl) Chu trình nhiệt:
42°C/30 phút - 95°C/3 phút - (95°C/30
giây - 50°C/30 giây -72°C/45 giây) x 30
chu kỳ - 75°C/5 phút
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Bres, P The epidemic of Ebola
haemorrhagic fever in Sudan and Zaire, 1976:
introductory note Bull World Health Organ
1978, 56 (2), p.245
2 WHO
http://apps.who.int/ebola/current-
situation/ebola-situation-report-30-march-2016 situation/ebola-situation-report-30-march-2016
3 Grolla, A et al Laboratory diagnosis of
Ebola and Marburg hemorrhagic fever Bull Soc Pathol Exot 2005, 98 (3), pp.205-209
4 Towner, JS et al Rapid diagnosis of
Ebola hemorrhagic fever by reverse transcription-PCR in an outbreak setting and assessment of patient viral load as a predictor
of outcome J Virol 2004, 78 (8), pp.4330-4341
5 Kurosak Y et al Rapid and simple
detection of Ebola virus by reverse transcription-loop-mediated isothermal amplification J Virol Methods 2007, 141 (1), pp.78-83
6 Liu L et al Detection of Zaire Ebola virus
by real-time reverse transcription-polymerase chain reaction Sierra Leone 2014 J Virol Methods 2015, 222, pp.62-65
7 Ogawa, H et al Detection of all known
filovirus species by reverse transcription-polymerase chain reaction using a primer set specific for the viral nucleoprotein gene
J Virol Methods 2011, 171 (1), pp.310-313