Bài viết nghiên cứu đánh giá giá trị của HOS test (Hypo-Osmotic Swelling Test, HOS test, HOST) trên các mẫu tinh trùng bất động hoàn toàn. Mời các bạn cùng tham khảo nội dung chi tiết tài liệu.
TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 ĐÁNH GIÁ GIÁ TRỊ CỦA HOS TEST TRÊN CÁC MẪU TINH TRÙNG BẤT ĐỘNG Nguyễn Thị Thanh Thảo*; Nguyễn Khang Sơn* TÓM TẮT Nghiên cứu đánh giá giá trị HOS test (Hypo-Osmotic Swelling Test, HOS test, HOST) mẫu tinh trùng bất động hoàn tồn, chúng tơi nhận thấy: - Loại dung dịch áp lực thẩm thấu tối ưu cho nghiệm pháp 50% nước cất/50% môi trường G-IVF Phản ứng HOS test xảy sau tinh trùng tiếp xúc với dung dịch thử, phản ứng đầy đủ sau 30 phút - Với độ nhạy 73,9%, độ đặc hiệu 94,1%, giá trị tiên đốn dương tính 87,4%, HOS test nghiệm pháp đáng tin cậy cho việc lựa chọn tinh trùng sống mẫu tinh trùng bất động hoàn toàn, phục vụ kỹ thuật tiêm tinh trùng vào bào tương no n (ICSI - Intra Cytoplasmic Sperm Injection) * Từ khóa: Tinh trùng bất động; HOS test; Tiêm tinh trùng vào bào tương no n Evaluate the Value of Hypo-Osmotic Swelling Test on Immotile Spermatozoa Samples Summary The study evaluated the value of HOS test for identifying viable sperms on completely immotile spermatozoa samples, we found that: - The optimal hypo-osmotic swelling test solution was 50% distilled water/50% G-IVF medium HOS test reaction occurred immediately after sperms contacted with the test solution, optimum sperm reaction after 30 minutes - With a sensitivity of 73.9%, a specificity of 94.1%, a positive predictive value of 87.4%, HOS test is a reliable test to select viable sperms from completely immotile spermatozoa samples for ICSI * Keywords: Immotile spermatozoa samples; HOS test; Intracytoplasmic sperm injection ĐẶT VẤN ĐỀ Khi đưa tế bào vào môi trường áp lực thẩm thấu thấp (môi trường nhược trương), nước vào tế bào để cân áp lực bên bên màng tế bào; tế bào sống với chức màng nguyên có biểu trương phồng lên Ứng dụng điều này, năm 1984 Jeyendran CS đ tiến hành sử dụng dung dịch áp lực thẩm thấu thấp để đánh giá tính tồn vẹn màng bào tương tinh trùng Trong môi trường áp lực thẩm thấu thấp, tinh trùng sống có biểu cuộn phồng * Trường Đại học Y Hà Nội Người phản hồi (Corresponding): Nguyễn khang sơn (khangson@gmail.com) Ngày nhận bài: 25/07/2017; Ngày phản biện đánh giá báo: 20/08/2017 Ngày báo đăng: 30/08/2017 94 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 Ban đầu HOS test dùng để đánh giá tỷ lệ sống chết mẫu tinh dịch, sau dùng để đánh giá khả thụ tinh mẫu tinh trùng Với phát triển mạnh mẽ ngành hỗ trợ sinh sản nay, HOS test có vai trò quan trọng phát tinh trùng sống mẫu tinh trùng bất động hồn tồn với mục đích sử dụng tinh trùng sống để tiêm vào bào tương noãn (ICSI) Việc kết hợp HOS test với ICSI làm tăng hiệu chu kỳ ICSI với mẫu tinh trùng bất động hoàn toàn [1, 2] Traphaco (Việt Nam) Eosin Y Merck (CHLB Đức) Các ống Falcon Corning (Hoa Kỳ) Pipet, lam, lamen, lọ vô trùng đựng tinh dịch, đầu Tủ ấm, kính hiển vi Có nhiều loại dịch áp lực thẩm thấu thấp khác nhau, thời gian ủ thích hợp cho phản ứng, giá trị HOS test mẫu tinh trùng bất động hoàn toàn chưa nghiên cứu nhiều sâu Với mong muốn đánh giá cách đầy đủ giá trị HOS test mẫu tinh trùng bất động hoàn toàn, làm tăng tỷ lệ thành công chu kỳ thụ tinh ống nghiệm, đặc biệt với mẫu tinh trùng bất động hoàn toàn, thực nghiên cứu nhằm: Đánh giá giá trị HOS test mẫu tinh trùng bất động + Dung dịch (DD1): tỷ lệ nước cất/môi trường 25%/75% ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tƣợng nghiên cứu Mẫu tinh trùng bất động hồn tồn 37 người đàn ơng Phƣơng pháp nghiên cứu * Chuẩn bị dụng cụ hóa chất: Môi trường G-IVF (gọi tắt môi trường) Vitrolife (Thụy Điển) Nước cất tiêm * Quy trình nghiên cứu: - Bước chuẩn bị: + Thu thập mẫu nghiên cứu: thu thập mẫu tinh dịch vào lọ nhựa vô trùng, để ly giải hồn tồn 37oC trước thí nghiệm + Tạo nhóm dung dịch HOS test áp lực thẩm thấu thấp với mức khác + Dung dịch (DD2): tỷ lệ nước cất/môi trường 50%/50% + Dung dịch (DD3): tỷ lệ nước cất/môi trường 75%/25% + Dung dịch (DD4): tỷ lệ nước cất/môi trường 100%/0% - Bước 1: sau tinh dịch đ ly giải hoàn toàn, tiến hành đánh giá chất lượng mẫu tinh dịch theo quy trình thường quy, gồm thơng số mật độ, tỷ lệ sống chết nhuộm eosin, độ di động, hình thái theo WHO (2010) [3] Những mẫu bất động 100% tiếp tục thí nghiệm - Bước 2: nghiên cứu lựa chọn loại dung dịch HOS test phù hợp, thời gian tối ưu ủ tinh trùng dung dịch HOS test - Cho 0,1 ml tinh dịch vào ống Falcon đựng sẵn ml DD1 đ ủ ấm, trộn pipet, ủ ấm - Sau phút, nhỏ 10 µl hỗn dịch lên lam kính, đếm số lượng tinh trùng có phản ứng HOS test dương tính tổng số 95 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 200 tinh trùng kính hiển vi có độ phóng đại 400 Xác định thay đổi tỷ lệ tinh trùng sống/chết sau nghiệm pháp HOS test hỗn dịch test eosin - Đánh giá lại sau: phút, 10 phút, 15 phút, 30 phút, 90 phút, 120 phút - Thực tương tự với DD2, DD3, DD4 - Xác định thời gian ủ tinh trùng phù hợp cho phản ứng HOS test tối ưu - Độ nhạy, độ đặc hiệu, giá trị tiên đoán dương HOS test * Xử lý số liệu: số liệu thu thập xử lý theo phương pháp thống kê y sinh học theo t-test phần mềm Microsoft Excel 2010, SPSS 20.0 * Chỉ tiêu nghiên cứu: * Địa điểm thời gian nghiên cứu: - Tỷ lệ phần trăm tinh trùng có phản ứng HOS test loại dung dịch áp lực thẩm thấu khác nghiên cứu thực Bộ môn Mô phôi, Trường Đại học Y Hà Nội từ tháng 10 2016 đến - 2017 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Xác định loại dung dịch HOS test phù hợp thời gian tối ƣu ủ tinh trùng dung dịch HOS test 50 Tỉ lệ (%) 40 HOST (+)_dung dịch HOST (+)_dung dịch HOST (+)_dung dịch HOST (+)_dung dịch 30 20 10 10 15 30 90 120 Thời gian (phút) Biểu đồ 1: Tỷ lệ tinh trùng có phản ứng HOS test loại dung dịch khảo sát, biến đổi theo thời gian - Tỷ lệ tinh trùng có phản ứng HOST (+) tăng dần theo thời gian từ - 30 phút, sau biến đổi tất loại dung dịch khảo sát - Phản ứng phản ứng HOST (+) đạt cao DD4, thấp DD1; DD2 DD3 gần tương đồng 96 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 100 Tỉ lệ (%) 80 Eosin (+)_dung dịch 60 Eosin (+)_dung dịch 40 Eosin (+)_dung dịch 20 Eosin (+)_dung dịch 10 15 30 90 120 Thời gian (phút) Biểu đồ 2: Tỷ lệ tinh trùng chết (eosin +) loại dung dịch HOS test, biến đổi theo thời gian - Tỷ lệ tinh trùng chết tăng dần sau thời gian ủ dung dịch HOS test, đặc biệt sau giai đoạn 30 phút - DD3 DD4 ln có tỷ lệ tinh trùng chết cao so với DD1 DD2 Bảng 1: Tỷ lệ tinh trùng có phản ứng HOS test loại dung dịch khảo sát, thời điểm 30 phút DD1 DD2 DD3 DD4 HOST (+) (%) 24,5 30,2 31,9 37,9 Tỷ lệ tinh trùng chết trước HOST test (%) 64,4 64,4 64,4 64,4 Tỷ lệ tinh trùng chết sau HOST test (%) 65,9 67,7 78,1 81,2 - Tại thời điểm 30 phút, DD4 có tỷ lệ tinh trùng HOS test dương tính cao (37,9%); dung dịch DD1 có tỷ lệ tinh trùng phản ứng HOS test thấp (24,5%), khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) - Khơng có khác biệt tỷ lệ tinh trùng có phản ứng HOS test dung dịch DD2 DD3 - Tỷ lệ chết tinh trùng sau HOS test tăng cao loại dung dịch DD3 DD4 (78,1% 81,2%); khác biệt có ý nghĩa so với DD1 DD2 (p < 0,01) - DD2 cho phản HOS test rõ ảnh hưởng đến sống tinh trùng Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu giá trị chẩn đoán dƣơng nghiệm pháp HOS test với DD2 thời điểm 30 phút Với loại dịch DD2 (50/50), ủ 37oC 30 phút, giá trị phản ứng HOS test tinh trùng biểu qua bảng 2: 97 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 Bảng 2: Giá trị phản ứng HOS test với DD2 Số ƣợng tinh trùng sống Số ƣợng tinh trùng chết Tổng Tinh trùng HOST (+) 1.897 274 2.171 Tinh trùng HOST (-) 668 4.361 5.029 2.565 4.635 7.200 Tổng - Độ nhạy phản ứng HOS test hay tỷ lệ dương tính thật số tinh trùng sống có HOS test (+) tổng số tinh trùng sống (= 73,9%) - Độ đặc hiệu phản ứng HOS test hay tỷ lệ âm tính thật số tinh trùng chết có HOS test (-) tổng số tinh trùng chết (= 94,1%) - Giá trị tiên đoán dương phản ứng HOS test số tinh trùng sống có HOS test (+) tổng số tinh trùng có HOS test (+) 87,4% BÀN LUẬN Khi tinh trùng tiếp xúc với dung dịch áp lực thẩm thấu thấp, tỷ lệ tinh trùng có phản ứng HOS test (+) tăng theo thời gian, từ phút 30 trở tỷ lệ tinh trùng có phản ứng HOS test khơng thay đổi bốn loại dịch (biểu đồ 1) Do vậy, đánh giá lựa chọn loại dịch phù hợp, ta đánh giá thời điểm 30 phút DD4 có tỷ lệ tinh trùng HOS test dương tính cao (37,9%), thấp DD1 (24,5%), khơng có khác biệt tỷ lệ tinh trùng có phản ứng HOS test DD2 DD3 (bảng 1) Sự khác biệt loại dịch có áp lực thẩm thấu khác Khi tinh trùng mơi trường nhược trương, nước từ ngồi vào tế bào đạt cân áp lực thẩm thấu tế bào Ở loại DD1, áp lực thẩm thấu gần với áp lực thẩm thấu tế bào, lượng nước vào tế bào ít, số tinh trùng có biểu HOS test (+) thấp Ở loại dịch 2, với tỷ lệ 50% nước cất, lượng nước vào tinh trùng mức độ đủ để có tỷ lệ tinh trùng biểu HOS test (+) cao Ở loại dịch 3, 4, với áp lực thẩm thấu thấp, 98 lượng nước vào tế bào lớn, số tinh trùng có HOS test (+) cao Khi đánh giá loại dịch thẩm thấu thấp phù hợp, phản ứng HOS test tinh trùng loại dịch 50% môi trường 50% nước cất tối ưu Tối ưu hiểu điều kiện mà tỷ lệ tinh trùng có phản ứng HOS test cao, đồng thời tỷ lệ tinh trùng chết thấp Ở loại dịch 50/50, tỷ lệ tinh trùng có phản ứng HOS test cao, đồng thời tổn thương stress áp lực thẩm thấu thấp tương đối thấp, biểu phần trăm tinh trùng chết nhuộm eosin sau HOS test thấp đáng kể (67,7%) so với loại dịch 100% nước cất (81,2%), p < 0,01 (biểu đồ 2, bảng 1) Tỷ lệ tinh trùng chết loại DD1 DD2 sau HOS test thấp so với hai loại dịch lại, khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0,01), hai nhóm khơng có khác biệt đáng kể (p > 0,05) Ngược lại, tỷ lệ tinh trùng có phản ứng HOS test loại dịch 100% nước cất cao phần trăm tinh trùng chết sau HOS test cao (81,2%), khác biệt có ý nghĩa TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 thống kê (p < 0,01) Tỷ lệ tinh trùng sống loại dịch (18,8%) giảm gần nửa so với trước thực HOS test (35,6%) (bảng 1) Có khác biệt do: loại dịch 4, lượng nước vào tế bào lớn làm cân thành phần nội bào, cấu trúc màng tinh trùng bị thay đổi nhiều dẫn đến tổn thương hồi phục, tổn thương chức màng tinh trùng, hậu làm chết tinh trùng Ngược lại loại DD1, DD2, lượng nước vào tế bào mức độ vừa phải, thay đổi thành phần nội bào cấu trúc chức màng tinh trùng giới hạn khả tinh trùng điều chỉnh được, số tinh trùng chết sau HOS test thấp hai loại DD3, DD4 Ở loại DD4 (100% nước cất), tinh trùng có phản ứng HOS test mạnh nhất, tồn tinh trùng tròn căng Những tinh trùng có sức sống khơng bền thường chết nhanh, bị stress áp lực thẩm thấu, biểu tỷ lệ tinh trùng chết sau HOS test cao nhuộm eosin Trong số nghiên cứu thực HOS test chu kỳ ICSI cho thấy khả hồi phục tinh trùng sau thực HOS test môi trường 50/50 cho vào môi trường cân đạt tỷ lệ cao, khả hồi phục tinh trùng sau HOS test môi trường 100% nước cất kém, tinh trùng thường không hồi phục hồi phục chậm Tỷ lệ 50/50 cho phù hợp với kỹ thuật ICSI, với kết khả quan thao tác đơn giản, dễ thực [4, 5] Khi nghiên cứu phản ứng HOS test khoảng thời gian khác cho thấy có biến đổi kết phản ứng HOS test theo thời gian Kết cho thấy cho tinh dịch vào dung dịch thẩm thấu thấp, tinh trùng đ có phản ứng HOS test, tăng dần theo thời gian, tăng tối ưu thời điểm 30 phút so với thời điểm phút, 15 phút đầu, khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) Ở thời điểm 30 phút, kết HOS test tối ưu (biểu đồ 1, bảng 1) Tỷ lệ tinh trùng có phản ứng HOS test cao (30,2%), đồng thời tỷ lệ tinh trùng chết thấp (66,3%) Sau 30 phút, tỷ lệ tinh trùng có phản ứng HOS test tiếp tục tăng nhẹ không khác biệt nhiều so với thời điểm 30 phút (p > 0,05) Cùng với đó, tỷ lệ tinh trùng chết sau HOS test cách nhuộm eosin tăng dần theo thời gian, tăng có ý nghĩa thời điểm 90 phút trở (p < 0,05) (biểu đồ 2) Sau 90 phút, tỷ lệ tinh trùng có phản ứng HOS test khơng tăng có nguy cao bị chết sau HOS test tress áp lực thẩm thấu Khả cân áp lực thẩm thấu tinh trùng khác Có tinh trùng đạt cân phút đầu tiên, có tinh trùng cần thời gian dài đạt cân bằng, biểu tỷ lệ tinh trùng có phản ứng HOS test cao thời điểm sau Tuy nhiên, kéo dài thời gian môi trường áp lực thẩm thấu thấp, thay đổi thành phần nội bào, cấu trúc chức màng stress áp lực thẩm thấu thấp ảnh hưởng mạnh đến sống tinh trùng, biểu tỷ lệ tinh trùng chết ngày tăng thời điểm sau Thực tế, nhiều nghiên cứu trước đ stress áp lực thẩm thấu thấp kéo dài dẫn đến tổn thương khơng hồi phục hậu gây chết tế bào Điều khẳng định tỷ lệ tinh trùng chết tăng cao sau 90 phút [6, 7] 99 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 Trong nghiên cứu đánh giá mẫu tinh dịch nói chung, thời gian tinh trùng tiếp xúc với dung dịch HOS test phù hợp 30 phút Tuy nhiên, thực ICSI, thời gian ủ tinh trùng dung dịch HOS test khuyến cáo vòng phút đầu, tinh trùng có biểu phản ứng HOS test, tiến hành dừng chuyển tinh trùng sang môi trường cân để tránh tổn thương stress áp suất thẩm thấu thấp Lúc tinh trùng đ sẵn sàng cho kỹ thuật ICSI [7] Với giá trị tiên đốn dương 87,4%, có nghĩa tinh trùng có phản ứng HOS test, khả tinh trùng sống 87,4% Kết tương đồng với nghiên cứu Buckett (84,2%) [8] Với độ nhạy 73,9%, độ đặc hiệu 94,1%, giá trị tiên đoán dương 87,4%, nghiên cứu đ chứng minh HOS test nghiệm pháp đáng tin cậy cho đánh giá tính tồn vẹn màng bào tương tỷ lệ sống chết tinh trùng; đặc biệt có ý nghĩa cho việc lựa chọn tinh trùng sống mẫu tinh trùng bất động hoàn toàn phục vụ kỹ thuật ICSI KẾT LUẬN Nghiên cứu đánh giá giá trị HOS test mẫu tinh trùng bất động hoàn toàn, nhận thấy: - Loại dung dịch áp lực thẩm thấu tối ưu cho nghiệm pháp 50% nước cất/50% môi trường G-IVF Phản ứng HOS test xảy sau tinh trùng tiếp xúc với dung dịch thử; phản ứng đầy đủ sau 30 phút - Với độ nhạy 73,9%, độ đặc hiệu 94,1%, giá trị tiên đốn dương tính 87,4%, HOS test nghiệm pháp đáng tin cậy cho việc 100 lựa chọn tinh trùng sống mẫu tinh trùng bất động hoàn toàn phục vụ kỹ thuật ICSI TÀI LIỆU THAM KHẢO Hồ Mạnh Tường, Đặng Quang Vinh, Vương Thị Ngọc Lan Thụ tinh ống nghiệm Nhà xuất Giáo dục Việt Nam 2011, (1) Jeyendran P.S, Van der Ven H.H, Perez-Pelaez M et al Development of an assay to assess the functional integrity of the human sperm membrane and its relationship to other semen characteristics Reproduction 1984, 70, pp.219-228 WHO WHO laboratory manual for the examination and processing of human semen World health organization 2010, fifth Esteves S.C, Sharma R.K, Thomas A.J Jr et al Suitability of the hypo-osmotic swelling test for assessing the viability of cryopreserved sperm Science direct 1996, 66 (5), pp.798-804 Verheyen G, Joris H, Crits K et al Comparison of different hypo-osmotic swelling solutions to select viable immotile spermatozoa for potential use in intracytoplasmic sperm injection European Society for Human Reproduction and Embryology 1997, (3), pp.195-203 Hossain A.M, Rizk B, Barik S et al Time course of hypo-osmotic swellings of human spermatozoa: evidence of ordered transition between swelling subtypes Human reproduction 1998, 13 (6), pp.1578-1583 Mohammad A.K, Farzaneh M.R, Seyyed M.K Application of vitality tests on asthenozoospermic semen from infertile men Iranian Biomedical Journal 1999, (3 &4), pp.77-81 Buckett W.M Predictive value of hypoosmotic swelling test to identify viable nonmotile sperm Human reproduction 2003, (3), pp.209-212 ... thích hợp cho phản ứng, giá trị HOS test mẫu tinh trùng bất động hoàn toàn chưa nghiên cứu nhiều sâu Với mong muốn đánh giá cách đầy đủ giá trị HOS test mẫu tinh trùng bất động hồn tồn, làm tăng... có ý nghĩa cho việc lựa chọn tinh trùng sống mẫu tinh trùng bất động hoàn toàn phục vụ kỹ thuật ICSI KẾT LUẬN Nghiên cứu đánh giá giá trị HOS test mẫu tinh trùng bất động hồn tồn, chúng tơi nhận... lệ thành cơng chu kỳ thụ tinh ống nghiệm, đặc biệt với mẫu tinh trùng bất động hồn tồn, chúng tơi thực nghiên cứu nhằm: Đánh giá giá trị HOS test mẫu tinh trùng bất động + Dung dịch (DD1): tỷ