ĐÁNH GIÁ GIÁ TRỊ của HOS TEST TRÊN các mẫu TINH TRÙNG bất ĐỘNG

Với sự phát triển mạnh mẽ củangành hỗ trợ sinh sản hiện nay, HOS Test có vai trò quan trọng trong việcphát hiện tinh trùng sống trong mẫu tinh trùng bất động hoàn toàn với mụcđích sử dụn

NGUYỄN THỊ THANH THẢO

§¸nh gi¸ gi¸ trÞ cña HOS test

Chuyên ngành : Mô học - Phôi thai học

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP BÁC SỸ NỘI TRÚ

Người hướng dẫn khoa học:

PGS.TS NGUYỄN KHANG SƠN

HÀ NỘI - 2017 LỜI CẢM ƠN

học tập và nghiên cứu để tôi có thể hoàn thành luận văn này.

Tôi xin trân trọng gửi lời cảm ơn, biết ơn chân thành nhất đến PGS TS Nguyễn Khang Sơn, phó trưởng bộ môn Mô – Phôi, Trường Đại học Y Hà

Nội, người thầy đã hướng dẫn chỉ bảo tận tình và giúp đỡ tôi trong quá trìnhhọc tập và hoàn thành luận văn

Tôi xin trân trọng cảm ơn các thầy cô, anh chị trong bộ môn Mô – Phôi,Trường Đại học Y Hà Nội đã luôn bên cạnh giúp đỡ tôi để tôi có điều kiện tốtnhất vừa học tập vừa hoàn thành luận văn này

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các anh chị em đồng nghiệp và bạn

bè đã quan tâm động viên, khích lệ và giúp đỡ tôi những lúc khó khăn trongsuốt thời gian học tập

Cuối cùng tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến bác và mẹ kínhyêu, những người thân trong gia đình đã thông cảm, động viên và ở bên tôitrong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Xin trân trọng cảm ơn!

LỜI CAM ĐOAN

1 Đây là luận văn do bản thân tôi trực tiếp thực hiện dưới sự hướng dẫn

của PGS TS Nguyễn Khang Sơn.

2 Công trình này không trùng lặp với bất kì nghiên cứu nào khác đã đượccông bố tại Việt Nam

3 Các số liệu và thông tin trong nghiên cứu là hoàn toàn chính xác, trung thực,khách quan, đã được xác nhận và chấp thuận của cơ sở nơi nghiên cứu

Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước pháp luật về những cam kết này

Hà Nội, ngày 1 tháng 10 năm 2017

Người viết cam đoan

Nguyễn Thị Thanh Thảo

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

Tiêm tinh trùng vào bào tương noãn

Thụ tinh trong ống nghiệm cổ điển

Tổ chức y tế thế giới

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3

1.1 Tình hình vô sinh trên thế giới và tại Việt Nam 3

1.1.1 Vô sinh nam do tinh trùng di động kém 4

1.2 Cấu tạo tinh trùng 8

1.2.1 Tinh trùng bình thường 8

1.2.2 Tinh trùng bất thường 11

1.2.3 Tinh dịch đồ 11

1.3 Một số phương pháp đánh giá khả năng sống của tinh trùng trước khi có HOS Test 11

1.3.1 Phương pháp nhuộm eosin, eosin - nigrosin, trypan blue 12

1.3.2 Phương pháp kích thích cơ học 12

1.3.3 Kỹ thuật laser 13

1.3.4 Sử dụng pentoxyfiline 13

1.4 Nguyên lý của HOS Test 15

1.4.1 Cấu tạo và chức năng màng bào tương 15

1.4.2 Nguyên lý của HOS Test 18

1.5 Các nghiên cứu về HOS Test 18

1.6 Ứng dụng của HOS Test 24

1.6.1 Đánh giá mẫu tinh dịch 24

1.6.2 HOS Test trong dự đoán khả năng thụ tinh của tinh trùng, góp phần chẩn đoán vô sinh nam 25

1.6.3 HOS Test giúp lựa chọn tinh trùng có sự toàn vẹn DNA cao 25

1.6.4 HOS Test ứng dụng trong thụ tinh trong ống nghiệm 28

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31

2.1 Đối tượng 31

2.2 Phương pháp nghiên cứu 31

2.2.1 Mô hình nghiên cứu 31

2.2.2 Chuẩn bị dụng cụ và hóa chất 32

2.3 Qui trình nghiên cứu 32

2.4 Chỉ tiêu nghiên cứu 34

2.7 Đạo đức nghiên cứu 35

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 36

3.1 Đặc điểm đối tượng nghiên cứu 36

3.2 Tỉ lệ các dạng biểu hiện của phản ứng HOS Test theo thời gian 37

3.3 Xác định loại dung dịch HOS Test phù hợp và thời gian tối ưu khi ủ tinh trùng trong dung dịch HOS Test .45

3.4 Mối tương quan giữa tỉ lệ tinh trùng có phản ứng HOS Test với tỉ lệ tinh trùng sống và tỉ lệ tinh trùng có hình thái bình thường 50

3.5 Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu và giá trị chẩn đoán dương của nghiệm pháp HOS Test với dung dịch DD2, tại thời điểm 30 phút .52

CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 53

4.1 Bàn luận về đặc điểm đối tượng nghiên cứu 53

4.2 Các dạng phản ứng HOS Test 54

4.3 Loại dịch và thời gian thực hiện HOS Test phù hợp 62

4.4 Mối tương quan giữa tỉ lệ tinh trùng có phản ứng HOS Test và tỉ lệ tinh trùng sống, tỉ lệ tinh trùng có hình thái bình thường .68

4.5 Giá trị phản ứng HOS Test 70

4.6 Phương pháp HOS Test 72

KẾT LUẬN 73

KHUYẾN NGHỊ VÀ HƯỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO 74

TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Một số đặc điểm của đối tượng nghiên cứu 36

Bảng 3.2 Các dạng biểu hiện của phản ứng HOS Test trong dung dịch 1 thay đổi theo thời gian 39

Bảng 3.4 Các dạng biểu hiện của phản ứng HOS Test trong dung dịch 3 thay

đổi theo thời gian 42Bảng 3.5 Các dạng biểu hiện của phản ứng HOS Test trong dung dịch 4 thay

đổi theo thời gian 43Bảng 3.6 Tỉ lệ phần trăm tinh trùng có phản ứng HOS Test ở bốn loại dung

dịch biến đổi theo thời gian 45Bảng 3.7 Tỉ lệ phần trăm tinh trùng chết ở bốn loại dịch thay đổi theo thời gian 47Bảng 3.8 Tỉ lệ tinh trùng có phản ứng HOS Test ở bốn loại dung dịch khảo

sát, tại thời điểm 30 phút 49Bảng 3.9 Giá trị của phản ứng HOS Test với dung dịch DD2 52

Biểu đồ 3.1 Các dạng biểu hiện của phản ứng HOS Test trong dung dịch 1

thay đổi theo thời gian 39 Biểu đồ 3.2 Các dạng biểu hiện của phản ứng HOS Test trong dung dịch 2

thay đổi theo thời gian 41Biểu đồ 3.3 Các dạng biểu hiện của phản ứng HOS trong dung dịch 3 thay

đổi theo thời gian 42Biểu đồ 3.4 Các dạng biểu hiện của phản ứng HOS Test trong dung dịch 4

thay đổi theo thời gian 44Biểu đồ 3.5 Tỉ lệ tinh trùng có phản ứng HOS Test ở bốn loại dung dịch khảo

sát, biến đổi theo thời gian 46Biểu đồ 3.6 Tỉ lệ tinh trùng chết (eosin +) ở mỗi loại dung dịch HOS Test,

biến đổi theo thời gian 48Biểu đồ 3.7 Mối tương quan giữa tỉ lệ tinh trùng sống và tỉ lệ tinh trùng có

phản ứng HOS Test với r= 0,890, n= 37, p= 0,000< 0,001 50Biểu đồ 3.8 Mối tương quan giữa tỉ lệ tinh trùng có phản ứng HOS Test và tỉ lệ tinh

trùng có hình thái bình thường với r= 0,111, n= 37, p= 0,511 51

Hình 1.1 Cấu tạo siêu vi của tinh trùng 10Hình 1.2 Hình dạng tế bào trong các môi trường áp suất thẩm thấu khác nhau 17Hình 1.3 Các dạng biểu hiện của tinh trùng trong phản ứng HOS Test 23Hình 1.4 Các dạng biểu hiện của tinh trùng có phản ứng HOS Test dưới kính

hiển vi quang học với độ phóng đại 400 lần 23Hình 3.1 Một số dạng biểu hiện của phản ứng HOS Test 37Hình 3.2 Hình ảnh tinh trùng có cuộn đuôi sau HOS Test nhưng vẫn bắt màu eosin 47

ĐẶT VẤN ĐỀ

Kỹ thuật ICSI ra đời là một phương pháp điều trị hiệu quả cho nhữngcặp vợ chồng vô sinh, đặc biệt nguyên nhân do nam giới với tinh trùng rất ít,yếu kèm hình dạng bất thường cao hoặc tinh trùng thu nhận từ mào tinh, tinhhoàn Tinh trùng tươi hoặc trữ đông sau lọc rửa được lựa chọn để tiêm vàotrứng dựa trên hình thái và khả năng di động của chúng Tuy nhiên, trongnhiều trường hợp, mẫu tinh trùng thu nhận được bất động hoàn toàn gây khókhăn cho việc lựa chọn này Thực tế cho thấy, một số trường hợp mẫu tinhtrùng bất động hoàn toàn vẫn có một tỉ lệ đáng kể tinh trùng sống Việc lựachọn một cách ngẫu nhiên hay chỉ dựa vào hình thái tinh trùng trong các mẫutinh trùng bất động hoàn toàn để thực hiện ICSI gây giảm đáng kể tỉ lệ thụtinh và có thai Để cải thiện kết quả ICSI trong những trường hợp này, nhiềuphương pháp đã được mô tả để lựa chọn tinh trùng bất động nhưng còn sống.Một số phương pháp để xác định tinh trùng sống: kỹ thuật nhuộm eosin,trypan blue, kích hoạt tinh trùng bằng cách bổ xung pentoxyfilline, kích thích

cơ học - kỹ thuật laser, tuy nhiên tất cả những phương pháp này đều có nhượcđiểm là gây độc cho tinh trùng, ảnh hưởng đến khả năng sống của tinh trùng[1] HOS Test ra đời đã khắc phục được các hạn chế trên

Khi đưa tế bào vào trong môi trường áp lực thẩm thấu thấp (môi trườngnhược trương) thì nước sẽ đi vào trong tế bào để cân bằng áp lực giữa bêntrong và bên ngoài màng tế bào; tế bào nào sống với chức năng màng cònnguyên vẹn sẽ có biểu hiện trương phồng lên Ứng dụng điều này năm 1984,Jeyendran và cộng sự đã thử nghiệm đánh giá tính toàn vẹn chức năng màngbào tương tinh trùng người bằng dung dịch có áp suất thẩm thấu thấp [2].Màng tinh trùng không chỉ có vai trò quan trọng trong quá trình trao đổi chất,đảm bảo sự sống cho tinh trùng mà nó còn rất cần thiết trong quá trình thụtinh của noãn và tinh trùng như tham gia vào quá trình hoạt hóa tinh trùng,phản ứng cực đầu, giúp tinh trùng bám trên bề mặt noãn

Nghiệm pháp HOS Test ban đầu được xem như một tiêu chí đánh giá về

tỷ lệ sống của tinh trùng trên những mẫu tinh trùng hoàn toàn bất động, đãđược WHO 1992, 2010 ghi nhận là phương pháp đánh giá tỷ lệ sống, được ápdụng rộng rãi cho các xét nghiệm tinh dịch Sau đó được dùng để đánh giákhả năng thụ tinh của mẫu tinh trùng [3], [4] Với sự phát triển mạnh mẽ củangành hỗ trợ sinh sản hiện nay, HOS Test có vai trò quan trọng trong việcphát hiện tinh trùng sống trong mẫu tinh trùng bất động hoàn toàn với mụcđích sử dụng tinh trùng sống đó để tiêm vào bào tương của noãn (ICSI) Sựkết hợp HOS Test với ICSI đã làm tăng hiệu quả của các chu kỳ ICSI với mẫutinh trùng bất động hoàn [2], [5]

Trong những trường hợp mẫu tinh trùng bất động hoàn toàn, việc kiểmtra sự sống của tinh trùng rất quan trọng, quyết định sự thành công củaIVF Chọn nhầm tinh trùng chết để ICSI sẽ đưa đến tỉ lệ thụ tinh thấp vàkhông tạo được phôi Với mong muốn đánh giá một cách đầy đủ giá trị củaHOS Test trên các mẫu tinh trùng bất động, làm tăng tỉ lệ thành công trongcác chu kỳ ICSI, đặc biệt với các mẫu tinh trùng bất động hoàn toàn, chúng

tôi thực hiện nghiên cứu này với mục tiêu: Đánh giá giá trị của HOS Test

trên các mẫu tinh trùng bất động.

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Tình hình vô sinh trên thế giới và tại Việt Nam

Vô sinh là tình trạng một cặp vợ chồng quan hệ tình dục đều, khôngdùng bất cứ biện pháp tránh thai nào mà không có thai tự nhiên trong thờigian một năm (ở phụ nữ < 35 tuổi) hoặc không có thai tự nhiên sau 6 tháng (ởphụ nữ > 35 tuổi) [6] Vô sinh ảnh hưởng tới tâm lý, tình hình kinh tế, dẫnđến các tổn thương về mặt y học, căng thẳng, đặc biệt trong một xã hội nhưchúng ta mà vấn đề sinh được con rất được chú trọng

Vô sinh và các vấn đề về suy giảm khả năng sinh sản đã và đang là mốiquan tâm lớn của các nhà y học, là một vấn đề lâm sàng có ý nghĩa lớn, ảnhhưởng tới 8 -12% các cặp vợ chồng trên toàn thế giới Trong tất cả các trườnghợp vô sinh, khoảng 40 - 50% là vô sinh nam - vô sinh do yếu tố nam giới Cácbất thường có thể đơn độc hoặc kết hợp với nhau như mật độ tinh trùng thấp, khảnăng di động kém, hình thái bất thường Tỉ lệ vô sinh ở các nước kém phát triểncao hơn và nguyên nhân chủ yếu do ảnh hưởng của các bệnh truyền nhiễm [7].Mặc dù chưa có số liệu chính xác về tỉ lệ vô sinh toàn cầu, nhưng ướctính gần 72,4 triệu cặp vợ chồng trên toàn thế giới gặp vấn đề về sinh sản.Theo ước tính của WHO có khoảng 60.000.000 - 80.000.000 cặp vợ chồngtrên toàn thế giới bị vô sinh Tại Mỹ, theo trung tâm quốc gia về thống kê y

tế, khả năng sinh sản suy giảm ở phụ nữ tăng 2,7 triệu, từ 4,56 triệu năm 1982lên 7,26 triệu năm 2002 Hơn nữa tỉ lệ sinh sản của nam giới dưới 30 tuổicũng suy giảm 15% trên toàn thế giới [8], [9]

Tại Việt Nam, nghiên cứu trên toàn quốc do Bệnh viện Phụ sản Trungương và Đại học Y Hà Nội năm 2015 tiến hành trên 14 300 cặp vợ chồngtrong độ tuổi sinh đẻ (15 - 49) ở 8 tỉnh đại diện cho 8 vùng miền sinh thái ởnước ta đã cho thấy tỉ lệ vô sinh của các cặp vợ chồng trong độ tuổi sinh đẻ là7,7%, nghĩa là có từ 700 000 đến 1 triệu cặp vợ chồng vô sinh Trong đó vôsinh nguyên phát là 3,9%, vô sinh thứ phát là 3,8%, có tới 50% cặp vợ chồng

vô sinh có độ tuổi dưới 30

Theo thống kê ở Anh, nguyên nhân vô sinh do nam giới dao động từ 57% các cặp vợ chồng hiếm muộn [10] Tại Việt Nam, nghiên cứu củaNguyễn Thị Được và Nguyễn Thị Thanh Mai (2001) trên 220 cặp vợ chồng

19-vô sinh đến khám tại phòng khám sản Đại học Y Thái Bình nhận thấy tỷ lệ 19-vôsinh do chồng chiếm 43,2% [11], [12] Như vậy vô sinh nam chiếm khoảng35%, trong đó hơn 90% các nguyên nhân đều dẫn đến kết quả gây bất thườngtinh trùng Người ta ước tính các bất thường của tinh trùng về sản xuất hayhoạt động chức năng chiếm từ 35- 50% các trường hợp vô sinh [13]

Nam giới với các thông số tinh dịch đồ thấp hơn giá trị bình thường củaWHO được xem là có yếu tố vô sinh nam Đáng kể nhất trong số này là mật

độ thấp (oligospermia), di động kém (asthenospermia), hình thái bất thường(teratospermia) hay dạng kết hợp Các yếu tố khác cũng được quan tâm nhưbệnh lý tiền liệt tuyến, túi tinh…[14], [15], [16], [17], [18]

1.1.1 Vô sinh nam do tinh trùng di động kém

Asthenozoospermia là thuật ngữ chỉ tình trạng tinh trùng của nam giới diđộng kém Nguyên nhân của tình trạng này có thể do các bất thường về traođổi chất ảnh hưởng tới di động của tinh trùng, bất thường đuôi như đuôi gập,đuôi cuộn, bất thường siêu cấu trúc trong cấu tạo của đuôi, bất thường đoạncổ…Việc tinh trùng di động kém ảnh hưởng rất lớn đến khả năng thụ tinh

giữa noãn và tinh trùng Trong thụ tinh tự nhiên, muốn thụ tinh được tinhtrùng phải bơi qua cả một quãng đường dài để tới nơi thụ tinh, mà khả năngbơi của tinh trùng phụ thuộc rất lớn vào tính toàn vẹn của đuôi [16].

Trong quá trình trưởng thành tự nhiên của tinh trùng, khả năng di độngcủa tinh trùng được hoàn thiện khi tinh trùng qua mào tinh Sự di động của tinhtrùng có vai trò rất quan trọng để tinh trùng di chuyển từ âm đạo tới vòi tử cung,xuyên qua lớp tế bào hạt để tham gia thụ tinh Do đó, có mối liên quan rõ rànggiữa khả năng di động của tinh trùng và khả năng có thai tự nhiên

Trong những trường hợp tinh trùng di động kém tỉ lệ thụ tinh thường rấtthấp, thậm chí không có thai tự nhiên Đặc biệt với các mẫu tinh trùng bấtđộng hoàn toàn thì mong ước có con của chính họ của các cặp vợ chồng vôsinh do tinh trùng bất động hoàn toàn là không thể Với sự tiến bộ của y học,

sự phát triển mạnh mẽ của lĩnh vực hỗ trợ sinh sản hiện nay thì nguyện vọngcủa các cặp vợ chồng trên có thể thực hiện được

1.1.2 Thụ tinh trong ống nghiệm cổ điển (IVF) và tiêm tinh trùng vào bào tương noãn (IVF/ICSI)

1.1.2.1 Thụ tinh trong ống nghiệm cổ điển

Em bé IVF đầu tiên trên thế giới ra đời năm 1978 Đến nay, đã cókhoảng 4 triệu trẻ ra đời từ IVF, hàng năm trên toàn thế giới có gần một triệutrường hợp IVF và các kỹ thuật tương đương được thực hiện Ở các nước pháttriển như Bắc Âu, Tây Âu và Úc, có từ 1 - 5% trẻ mới sinh ra đời hàng năm là

từ IVF IVF đã làm thay đổi quan niệm của nhân loại về sinh sản Với các kỹthuật hỗ trợ sinh sản, quan hệ tình dục và sinh sản để duy trì nòi giống có thểđược tách biệt thành hai vấn đề riêng biệt Ngoài ra việc có con của một cặp

vợ chồng có thể có sự tham gia của người thứ 3: cho noãn, cho tinh trùng,mang thai hộ…[5]

R.G Edwards, người Anh, là một trong những nhà khoa học tiên phongtrong việc nghiên cứu về IVF trên người Năm 1966, Edwards cùng mộtnhóm nhà khoa học Mỹ đứng đầu là giáo sư Howard Jones, lần đầu tiên công

bố trường hợp lấy được noãn người qua phẫu thuật nội soi tại Mỹ Đến năm

1971, Steptoe và Edwards ở Anh lần đầu tiên báo cáo nuôi cấy được phôinang người trong ống nghiệm và chuyển các phôi này vào buồng tử cungngười phụ nữ Đến năm 1976, sau hàng trăm trường hợp thất bại, bác sĩSteptoe và tiến sĩ Edwards công bố trường hợp có thai đầu tiên từ IVF ởngười trên thế giới Năm 1978, em bé đầu tiên từ IVF, Louise Brown ra đời

đã đánh dấu bước đầu cho sự phát triển của IVF trên người [5]

Kỹ thuật IVF được thực hiện để điều trị hiếm muộn cho các cặp vợchồng có các chỉ định sau: tắc vòi tử cung, bất thường về số lượng và chấtlượng tinh trùng, lạc nội mạc tử cung, hiếm muộn không rõ nguyên nhân…Ngoài ra IVF còn được chỉ định cho các trường hợp xin noãn, chẩn đoán ditruyền tiền làm tổ

Trong thời gian đầu, IVF được chỉ định chủ yếu cho vô sinh nữ Dần dầnIVF được áp dụng cho các trường hợp thiểu năng tinh trùng Tuy nhiên các thửnghiệm áp dụng IVF cho vô sinh nam, đặc biệt các trường hợp có bất thườngtinh trùng nặng, không có tinh trùng, tinh trùng sau rã đông…cho kết quả kháthất vọng với tỉ lệ thụ tinh giữa noãn và tinh trùng rất thấp và nhiều trường hợphoàn toàn không có thụ tinh Với mẫu tinh trùng bất động hoàn toàn thì không

áp dụng IVF được Rõ ràng là số lượng, chất lượng và khả năng di động củatinh trùng ảnh hưởng rất lớn đến sự thành công của phương pháp Kỹ thuậtICSI ra đời năm 1992 đã tạo ra một bước ngoặt lớn trong lĩnh vực hỗ trợ sinhsản, đặc biệt với vô sinh nam [19], [20]

1.1.2.2 Tiêm tinh trùng vào bào tương của noãn

Năm 1992 kỹ thuật tiêm tinh trùng vào bào tương noãn (ICSI) được báocáo thành công lần đầu tiên tại Bỉ bởi Palermo và cộng sự Trong kỹ thuật nàycác tác giả tiêm trực tiếp một tinh trùng vào bào tương noãn để hỗ trợ sự thụtinh Các thử nghiệm đầu tiên cho thấy sau khi tiêm tinh trùng vào bào tươngnoãn, tế bào noãn vẫn có thể hồi phục, sự thụ tinh diễn ra và phôi sau đó pháttriển khá tốt Tỉ lệ có thai lâm sàng của kỹ thuật ICSI luôn cao hơn so với kỹthuật IVF cổ điển, mặc dù số lượng và chất lượng tinh trùng kém Sự thànhcông này đã thực sự là một cuộc cách mạng trong điều trị vô sinh nam Nếunhư trong sinh lý tự nhiên người đàn ông cần sản xuất ra hàng chục triệu đếnhàng trăm triệu tinh trùng trong một lần phóng tinh để có thể thụ tinh với mộtnoãn trong vòi trứng thì với kỹ thuật ICSI, sự thụ tinh có thể diễn ra giữa duynhất một tinh trùng với một noãn Cho đến nay, do vấn đề vô sinh nam ngàycàng phổ biến đi kèm với hiệu quả của kỹ thuật ICSI được cải thiện khôngngừng, ICSI đã dần dần trở thành kỹ thuật được thực hiện nhiều nhất tại cáctrung tâm hỗ trợ sinh sản Hiện nay, đặc biệt tại một số trung tâm lớn, ICSIcòn được áp dụng thay thế hoàn toàn kỹ thuật IVF cổ điển ngay cả đối với cáctrường hợp không liên quan đến vô sinh nam [16], [20], [21], [22]

Với sự ra đời của ICSI, những cặp vợ chồng vô sinh do yếu tố nam giớibao gồm cả tinh trùng di động kém có thể có thai của chính họ Tỉ lệ thụ tinh và

có thai của những trường hợp này cao nếu tinh trùng di động được chọn để ICSI.Tuy nhiên, với các tinh trùng bất động hoàn toàn, việc lựa chọn ngẫunhiên tinh trùng bất động để ICSI làm tỉ lệ thành công sau ICSI đều giảm hẳn.Trong những trường hợp này việc tìm ra phương pháp giúp phát hiện tinhtrùng bất động nhưng còn sống để tiêm vào bào tương noãn mà không ảnhhưởng tới sự sống của tinh trùng, trứng cũng như sự phát triển của phôi là cực

kỳ quan trọng

1.2 Cấu tạo tinh trùng [23]

1.2.1 Tinh trùng bình thường

Tinh trùng có cấu tạo bình thường dài khoảng 60µm và gồm ba đoạn làđầu, cổ và đuôi Đầu hình bầu dục, hơi dẹt, dài 4 - 5µm, rộng 2µm Nhân lớnchiếm gần hết đầu tinh trùng Cổ là đoạn ngắn và hẹp, gắn thẳng trục với đầu.Đuôi dài khoảng 55µm, chia làm 3 đoạn:

+ Đoạn trung gian: dài khoảng 4 - 5µm Giữa đoạn trung gian và đoạnchính, màng tế bào dày lên tạo thành vòng Zensen

+ Đoạn chính: dài nhất, khoảng 45µm, gồm một dây trục nằm ở trungtâm, vây quanh bởi một bao sợi xơ và bọc ngoài bởi màng tế bào

+ Đoạn cuối: dài khoảng 2 - 3µm, tạo thành bởi dây trục được bọc bởimàng tế bào

Quan sát dưới kính hiển vi điện tử thấy đầu tinh trùng chứa nhân ở phầnphình nằm về phía giáp với cổ Đoạn 2/3 trước của nhân được chụp bởi túicực đầu có hình cái mũ Thành túi có cấu tạo màng kép, gồm hai lá ngoài vàtrong Lòng túi chứa nhiều enzyme có tác dụng tiêu huỷ các chướng ngại vậtbao quanh noãn chín để tinh trùng tiến vào bào tương của noãn khi thụ tinh:hyaluronidase, neuramidase, acrosin

Ở lá ngoài của túi cực đầu và phần bào tương phía trước lá này có mộtloại protein đặc hiệu gọi là protein gắn vào noãn nguyên phát (primary eggbinding protein) có tác dụng gây ra kết dính giữa đầu tinh trùng và màngtrong suốt bọc noãn trong quá trình thụ tinh Ở lá trong của túi cực đầu có mộtloại protein đặc hiệu khác gọi là protein gắn vào noãn thứ phát (secondary eggbinding protein) có tác dụng gắn màng kép của túi cực đầu với màng trongsuốt bọc noãn khi lớp bào tương mỏng ở phía trước túi cực đầu đã bị tiêu huỷ

và lá ngoài của túi cực đầu bị rách trong quá trình tiếp xúc với màng trongsuốt Những protein này mang tính đặc hiệu cho loài, do đó sự gắn kết giữatinh trùng và màng trong suốt của noãn chỉ xảy ra ở động vật cùng loài.

Ở cổ có tấm đáy, hố cắm, tiểu thể trung tâm và 9 cột chia đoạn xếp thànhhình ống Dây trục nằm chính giữa cổ chạy suốt từ cổ đến chỗ tận cùng củađuôi Có 9 sợi đặc nối tiếp với 9 cột chia đoạn và tiến về phía đuôi tinh trùng.Những ti thể hình que dài, xếp thành một hàng nằm ở phía bên ngoài và songsong với cột chia đoạn ở đoạn trên cổ và sợi đặc ở đoạn đuôi

Đuôi gồm:

+ Đoạn trung gian có dây trục nằm chính giữa, 9 sợi đặc bao xungquanh Bao ti thể được cấu tạo bởi những ti thể xếp với nhau theo kiểu xoắn

ốc, cuốn quanh dây trục, được bọc bởi màng tế bào

+ Đoạn chính: từ trung tâm ra ngoại vi gồm: dây trục, 9 sợi đặc, bao xơ,màng tế bào

+ Đoạn cuối: cấu trúc rất đơn giản, chỉ gồm dây trục bọc ngoài bởi màng

tế bào

Phần đuôi tinh trùng chính là nơi chứa các thành phần cần thiết cho hoạtđộng trao đổi chất và di động Tinh trùng tự di động được là nhờ các vi sợi ởđuôi tinh trùng Các tinh trùng di động được chắc chắn là tinh trùng sống Tuynhiên, không phải tất cả tinh trùng không di động đều là tinh trùng chết Tinhtrùng còn sống mà không di động được thường do các bất thường nặng củatinh trùng, đặc biệt là các bất thường về đuôi như gập cổ, đoạn cổ không cânđối, đuôi ngắn, đuôi cuộn, đuôi gập, tế bào chất còn dư ở đuôi

+ Tinh trùng già : đầu lỗ rỗ vì bào tương có nhiều không bào chứa sắc tố.+ Tinh trùng thoái hoá: đầu bị biến dạng hay bị teo hoặc có hai đầu,hai đuôi.

Hình 1.1 Cấu tạo siêu vi của tinh trùng

I Thiết đồ đứng dọc toàn bộ tinh trùng; II Phóng to một phần đoạn đầu, cổ và một phần đoạn trung gian của tinh trùng ở hình I; III Thiết đồ ngang đoạn cổ tinh trùng theo đường A ở hình II;

IV Thiết đồ ngang đoạn trung gian theo đường B ở hình II; V Thiết đồ ngang đoạn chính ở hình I; VI Thiết đồ ngang đoạn cuối theo đường D ở hình I.

1 Đầu; 2 Cổ; 3 Đoạn trung gian; 4 Đoạn chính ; 5 Đoạn cuối; 6 Túi cực đầu; 7 Khoảng dưới túi cực đầu; 8 Màng nhân; 9 Nếp gấp màng nhân; 10 Tấm đáy (capitellum); 11 Cột chia đoạn; 12 Tiểu thể trung tâm gần; 13 Ti thể dài; 14 Ti thể tạo thành bao ti thể hình lò xo; 15 Lưới nội bào; 16 Giọt bào tương; 17 Sợi đặc; 18 Dây trục (axonema); 19 Vòng Zensen; 20 Bao xơ; 21 Cột dọc.

- Tổng số tinh trùng mỗi lần phóng tinh ≥39 triệu

- Tổng di động tiến tới ≥32% hay tổng di động tiến tới và không tiến tới ≥40%

- Tỉ lệ sống ≥58%

- Tỉ lệ tinh trùng hình thái bình thường ≥4%

1.3 Một số phương pháp đánh giá khả năng sống của tinh trùng trước khi có HOS Test

Đã có nhiều kỹ thuật đã được thực hiện nhằm phân biệt tinh trùng bấtđộng nhưng sống với tinh trùng bất động và chết sử dụng trong ICSI để cơ hội

có thai của các cặp đôi là lớn nhất Một số kĩ thuật như nhuộm chất màu, sửdụng pentoxyfiline, kích thích cơ học, sử dụng laser Tuy nhiên mỗi phươngpháp đều có ưu, nhược điểm riêng

1.3.1 Phương pháp nhuộm eosin, eosin - nigrosin, trypan blue

Một số chất nhuộm quan sát được dưới kính hiển vi trường sáng nhưeosin, eosin - nigrosin, trypan blue, hoặc với kính hiển vi huỳnh quang một sốchất được dùng như propidium iodine, hoechst, ethidium homodimer- 1, Yo-Pro- 1 đều được dùng để nhuộm tinh trùng nhằm phân biệt tinh trùng sống,tinh trùng chết [24]

 Nguyên lý: Dựa trên sự toàn vẹn về cấu trúc màng tế bào Khi nhuộm

màu, tế bào nào bị tổn thương cấu trúc màng tế bào đồng nghĩa là tế bào đãchết, chất màu qua được màng tế bào vào bên trong nội bào dẫn đến tế bào có

màu theo chất nhuộm Tế bào nào còn sống, không tổn thương cấu trúc màngthì tế bào không bắt màu [3], [4], [24].

 Phương pháp: Dùng các chất màu để nhuộm tinh trùng, quan sát dưới

kính hiển vi ở độ pháng đại 400 lần Đếm số tinh trùng sống là những tinhtrùng mà phần đầu không bị nhuộm màu và số tinh trùng chết là những tinhtrùng mà phần đầu bị nhuộm màu trên tổng số 200 tinh trùng, [4]

 Ưu điểm: Đơn giản, dễ thực hiện ở mọi labo, rẻ tiền, độ nhạy và độ đặc

hiệu cao Ban đầu được dùng để kiểm tra tế bào nào chết, tế bào nào cònsống Sau đó được WHO khuyến cáo dùng để đánh giá nhanh chóng tỉ lệ tinhtrùng sống trong một mẫu tinh dịch, một thông số quan trọng trong đánh giátinh dịch đồ [24]

 Nhược điểm: Các kỹ thuật nhuộm dẫn tới chết tế bào, chất nhuộm màu

ảnh hưởng tới sự sống của tinh trùng cũng như sự thụ tinh của noãn, phát triểncủa phôi, do đó các tinh trùng đã bị nhuộm màu không sử dụng được cho các

kỹ thuật hỗ trợ sinh sản [1], [2], [4]

1.3.2 Phương pháp kích thích cơ học

 Nguyên lý: đuôi tinh trùng có thể uốn cong hình cung mà không có

chuyển động của đầu khi bị kích thích bằng kim ICSI được xem là có thể cònsống và do đó được chọn để ICSI Ngược lại nếu đầu di chuyển cùng đuôi thìtinh trùng đó đã chết [25]

 Ưu điểm: ngắn gọn, đơn giản, tiện dụng, làm được luôn trong quá trình

ICSI Không có các chất khác ảnh hưởng thêm đến tinh trùng, trứng cũng như

sự phát triển của phôi [25], [26]

 Nhược điểm: phụ thuộc vào độ “cứng” của đuôi tinh trùng, tinh trùng có

khả năng hồi phục về trạng thái hình dạng ban đầu hay không khi dừng kíchthích Nó cũng phụ thuộc rất lớn vào kỹ thuật cũng như kinh nghiệm củangười làm Thêm vào đó phương pháp chỉ dựa trên tính chất vật lý mà khôngchú ý tới tính toàn vẹn hóa học của màng tinh trùng [25], [26]

1.3.3 Kỹ thuật laser

 Nguyên lý, phương pháp: Kỹ thuật laser sử dụng tia laser đơn ngắn bước

sóng 1,48µm, tốc độ 6 - 7ms chiếu trực tiếp tới phần cuối của đuôi tinh trùng.Tinh trùng nào sống biểu hiện bằng phần cuối của đuôi uốn cong lại tại vị tríchiếu tia laser trong khi tinh trùng chết thì không uốn cong [27], [28]

 Ưu điểm: Laser là một phương pháp an toàn để lựa chọn tinh trùng sống

nhưng bất động Tỉ lệ thụ tinh, phôi chia cũng như tỉ lệ trẻ sinh sống khi ápdụng laser để lựa chọn tinh trùng bất động nhưng sống cao hơn khi lựa chọntinh trùng ngẫu nhiên Sử dụng tia laser tỉ lệ thụ tinh tăng từ 20,4% lên đến45,4% [27], [29]

 Nhược điểm: đắt, và không phải ở đơn vị labo nào cũng làm được.

Phương pháp chỉ dựa trên tính chất vật lý mà không chú ý tới tính toàn vẹnhóa học của màng tinh trùng [29], [30]

 Nguyên lý: Pentoxifilline là một chất ức chế 3’,5’- nucleotide phosphodiesterase,

giúp tinh trùng di động bằng cách kéo dài thời gian tồn tại của cAMP trong tế bào,chất cần bổ sung trong quá trình hoạt động của tinh trùng [32]

 Phương pháp: Trộn tinh dịch với pentoxifilline nồng độ 7,2mM theo tỉ lệ

1:1, ủ ấm 30 phút trong tủ 37oC có 5% CO2, 95% O2 Sau ủ ấm nhỏ một giọtlên buồng đếm và đánh giá tỉ lệ di động của mẫu sau ủ [31]

 Ưu điểm: Với những mẫu tinh dịch có tỉ lệ tinh trùng di động thấp

pentoxifilline có tác dụng khởi động sự di động của tinh trùng, làm tăng tỉ lệtinh trùng di động Pentoxifilline có tác dụng làm tăng tỉ lệ tinh trùng di độngtrong các trường hợp khuyết trục sợi đuôi (hội chứng lông bất động), khuyếttật về enzym (thiếu protein - carboxyl methylase), khuyết thiếu chức năngđuôi tinh trùng, các mẫu tinh dịch bất thường nặng về di động, tinh trùng lấy

từ mào tinh, tinh hoàn qua MESA, TESE Tuy nhiên với các trường hợp tinhtrùng bất động hoàn toàn vẫn cần có phương pháp giúp phát hiện tinh trùngsống ví dụ như HOS Test Pentoxifilline làm tăng tỉ lệ di động từ 51,8% lên70,8% so với nhóm không sử dụng thì tỉ lệ di động không thay đổi Trước đâypentoxifilline được sử dụng khá rộng rãi trong các labo để làm tăng tỉ lệ diđộng trong các mẫu tinh dịch làm IVF mà có tỉ lệ tinh trùng di động thấp Kếtquả cho thấy tỉ lệ thụ tinh và có thai trong các mẫu có sử dụng pentoxifillinetương đương với các mẫu có tỉ lệ tinh trùng di động trong giới hạn bìnhthường Nhìn chung pentoxifilline chủ yếu sử dụng trong các chu kỳ IVF cổđiển với các mẫu tinh trùng có tỉ lệ tinh trùng di động thấp [31], [33], [34].

 Nhược điểm: ảnh hưởng của pentoxyfiline lên trứng, lên sự phát triển của

phôi vẫn chưa được đánh giá đầy đủ và có thể gây hại tới phôi Phương phápnày cũng chỉ áp dụng với các mẫu vẫn có tỉ lệ tinh trùng di động thấp, một sốmẫu bất động nhưng vẫn còn tiềm năng di động sau khi sử dụng pentoxyfilline.Với những mẫu bất động hoàn toàn thì không áp dụng được [34]

Để khắc phục những nhược điểm trên, HOS Test đã được phát triển Ưuđiểm là phát hiện được tinh trùng bất động mà còn sống, không làm chết tinhtrùng cũng như không ảnh hưởng tới sự sống của tinh trùng, sự thụ tinh củanoãn, phát triển của phôi

1.4 Nguyên lý của HOS Test

1.4.1 Cấu tạo và chức năng màng bào tương [35], [36]

Màng tế bào là ranh giới ngăn tế bào sống với môi trường xung quanh

nó Màng tế bào điều khiển sự vào ra của vật chất xuyên qua màng Giốngnhư các màng sinh học khác nó là màng thấm chọn lọc cho phép một số chất

đi qua dễ dàng hơn những chất khác Màng tế bào được cấu tạo bởi lipids,proteins, carbohydrates Trên màng có các kênh protein xuyên màng kết hợpvới tính linh hoạt mềm dẻo của màng giúp vận chuyển vật chất qua màng có

tính chọn lọc Trên màng tế bào xảy ra hiện tượng khuếch tán, thẩm thấu quamàng tạo ra áp suất thẩm thấu và cũng bị tác động bởi áp suất thẩm thấu.

Thẩm thấu là sự khuyếch tán của dung môi từ dung dịch có nồng độ thấpsang dung dịch có nồng độ cao hơn qua màng Áp suất thẩm thấu là lực đẩycủa các phân tử dung môi từ dung dịch có nồng độ thấp đến dung dịch cónồng độ cao qua màng

Quá trình thẩm thấu giữa hai dung dịch sẽ tiếp tục cho đến khi nồng độcủa hai dung dịch bằng nhau Khi nồng độ của hai dung dịch cân bằng nhauthì sẽ không có sự khuyếch tán của dung môi qua màng, tạo cân bằng áp suấtthẩm thấu

 Hiện tượng khuếch tán

Khuếch tán (Gradient nồng độ) là hiện tượng chất khuếch tán vậnchuyển từ nơi có nồng độ cao sang nơi có nồng độ thấp, nhờ năng lượngchuyển động nhiệt

Các yếu tố ảnh hưởng đến sự khuếch tán:

- Bản chất của chất khuếch tán: tỉ lệ thuận với độ hoà tan trong lipidnhưng tỉ lệ nghịch với trọng lượng phân tử

- Nhiệt độ: tỉ lệ thuận với nhiệt độ, nhiệt độ tăng làm tăng chuyển độngcủa phân tử và ion trong dung dịch

- Trạng thái của màng: tỉ lệ nghịch với độ dày của màng nhưng tỉ lệthuận với số kênh trên 1 đơn vị diện tích màng

- Sự khuếch tán của 1 chất khác xảy ra đồng thời

- Ảnh hưởng của sự chênh lệch nồng độ: tỷ lệ thuận với sự chênh lệchnồng độ hai bên màng

Có các hình thức khuếch tán sau:

- Khuếch tán đơn giản theo 2 cách là khuếch tán qua lớp lipid kép vàkhuếch tán qua các kênh protein

- Khuếch tán được gia tốc: chất khuếch tán là chất hữu cơ không tantrong lipid và có kích thước phân tử lớn, đặc biệt là glucose, acid amin

 Hiện tượng thẩm thấu (Gradient áp suất thẩm thấu= ASTT)

Sự thẩm thấu là sự chuyển động của các phân tử dung môi (trong cơ thểchủ yếu là nước, trong bài này đề cập chính là nước) qua màng tế bào theohướng từ nơi có áp suất (nồng độ) thẩm thấu thấp đến nơi có áp suất (nồngđộ) thẩm thấu cao hơn

Theo luật Van’t Hoff định nghĩa ASTT của một dung dịch tỉ lệ thuận vớinồng độ thẩm thấu theo công thức P= R.T.C trong đó R là hằng số khí lýtưởng, T là nhiệt độ tuyệt đối, C là nồng độ thẩm thấu

Trong sinh lý, đơn vị đo nồng độ thẩm thấu là Osmolarity, 1 Osmol =

1000 mosmol

Sự thẩm thấu thực chất là một quá trình khuếch tán của các phân tử dungmôi (ở đây là nước) Sự thẩm thấu diễn ra rất nhanh, nhằm cân bằng nồng độthẩm thấu giữa trong và ngoài tế bào hay các ngăn dịch trong cơ thể

Độ lớn của áp suất thẩm thấu phụ thuộc vào nồng độ các phân tử bé vàion Dung dịch nhược trương (hypotonic) là dung dịch có áp suất thẩmthấu thấp hơn áp suất thẩm thấu của tế bào, nghĩa là nếu cho tế bào vàodung dịch này thì nước sẽ đi vào tế bào, tế bào trương lên (hình 1.2)

a b c

Hình 1.2 Hình dạng tế bào trong các môi trường áp suất thẩm thấu

khác nhau [37]

(a) tế bào trong môi trường bình thường

(b) tế bào trong môi trường ưu trương

(c) tế bào trong môi trường nhược trương

Như vậy áp suất thẩm thấu đóng vai trò quan trọng đối với hoạt độngsống của tế bào

Màng tế bào có tính thấm chọn lọc, nghĩa là màng để cho nước và cácchất hoà tan trong nước đi qua nhiều hơn so với các chất khác Vì vậy mà ápsuất thẩm thấu được giữ ổn định nhờ có cơ chế điều hoà nồng độ các chất hoàtan trong nước ở trong tế bào

Để đánh giá tế bào sống hay chết người ta thường dùng thuốc nhuộmnhư trypan blue, eosin Những tế bào chết sẽ bắt mầu thuốc nhuộm do màngcủa tế bào chết không còn khả năng ngăn cản sự xâm nhập của thuốc nhuộmvào nội bào Trong khi tế bào sống thì không bắt mầu Tuy nhiên tế bào saukhi làm nghiệm pháp nhuộm mầu không thể được sử dụng tiếp

Tinh trùng là một tế bào hoàn chỉnh, được bao bên ngoài bởi màng tếbào với đầy đủ các chức năng của màng sinh chất Vì vậy các nhà khoa học

đã ứng dụng tính chất tính thấm có chọn lọc của màng bào tương để phát hiệntinh trùng bất động nhưng còn sống mà không gây ảnh hưởng đến sự sống củatinh trùng thông qua HOS Test

1.4.2 Nguyên lý của HOS Test

HOS Test đánh giá sự toàn vẹn màng bào tương bằng cách xác định xemmàng tinh trùng còn khả năng duy trì sự cân bằng giữa bên trong và bên ngoàimàng tinh trùng hay không Trong HOS Test, khi tinh trùng trong môi trường

áp lực thẩm thấu thấp, nước đi vào tinh trùng cho đến khi cân bằng đạt đượcgiữa trong và ngoài màng tinh trùng Sự chuyển dịch của dòng nước do stress

áp lực thẩm thấu thấp gây ra làm màng tinh trùng phồng lên không đồng đềulàm đuôi cuộn lại hay phồng đồng đều làm đuôi ngắn lại Những tinh trùng cóbiểu hiện như vậy cho thấy màng tinh trùng vẫn còn nguyên vẹn và đầy đủchức năng, hay đơn giản là tinh trùng đó còn sống.

Do nước đi vào tinh trùng, tinh trùng nở rộng ra, phồng lên Những sợi ởphần đuôi tinh trùng (phức hợp sợi trục) bình thường được bao quanh bởimàng tinh trùng Khi màng tinh trùng phồng lên do nước đi vào dưới điềukiện áp suất thẩm thấu thấp, phần sợi ở đuôi sẽ uốn cong, cuộn lại bên trongmàng tinh trùng Sự thay đổi ở đuôi này dễ dàng quan sát thấy dưới kính hiển

vi Vì không thể nhận diện rõ ràng màng bào tương tinh trùng ở tình trạngkhông nhuộm màu dưới kính hiển vi ánh sáng, nhưng phức hợp sợi đuôi cóthể xác định được, quan sát được dưới kính hiển vi, phần đuôi sẽ cuộn lại, uốncong và hiện tượng này gọi là cuộn đuôi Cuộn đuôi là do sự phồng lên củamàng bào tương (thể tích nội bào tăng tối đa, màng căng tối thiểu) Chỉ nhữngtinh trùng có màng bào tương toàn vẹn cả về cấu trúc và chức năng mới thểhiện phồng lên và cuộn đuôi, những tinh trùng màng bào tương không nguyênvẹn thì không có hiện tượng này [38]

1.5 Các nghiên cứu về HOS Test

HOS Test lần đầu tiên được mô tả bởi Jayendran và cộng sự vào năm 1984

Vì đường và các chất điện phân được biết đến là các chất duy trì tínhtoàn vẹn chức năng tinh trùng nên ban đầu ba loại đường với trọng lượngphân tử khác nhau đã được thử nghiệm là fructose, melitose, sucrose và cácchất điện phân là natri citrate, natri chlorid Các chất trên hòa tan trong nướccất, tạo dung dịch với các loại áp suất thẩm thấu khác nhau từ 0 mosmol/l đến

ở 100 mosmol/l là 44,4%, ở 150 mosmol/l là 60,0%, ở 250 mosmol/l là 47,1%, ở

300 mosmol/l là 34,1%) Kết quả cho thấy ở 150 mosmol/l tỉ lệ tinh trùng cuộnđuôi cao hơn đáng kể so với các loại dịch còn lại Ở 150 mosmol/l, trong ba loạiđường thì đường melitose cho kết quả cuộn đuôi thấp nhất với 36,1% tinh trùng

có phản ứng, sucrose là 43,2% và fructose là cao nhất với 60,0% [2], [38]

Trong nghiên cứu về HOS Test, Jayendran cuối cùng đã đưa ra loại dungdịch HOS Test có áp lực thẩm thấu phù hợp là 150 mosmol/l bằng cách pha7,35 gram muối citrate và 13,5 gram đường fructose trong 1000ml nước cất.Hỗn hợp tinh trùng và dung dịch HOS Test sau đó được ủ ít nhất là 30 phútnhưng không quá 3- 4 giờ Với loại dịch cùng thời gian ủ như trên cho thấy tỉ

lệ tinh trùng có phản ứng HOS Test cao, quan sát dễ dàng hình ảnh cuộn đuôicủa tinh trùng dưới kính hiển vi [2], [38]

Nghiên cứu của Jayendran ban đầu với mục đích đánh giá tính toàn vẹnchức năng màng tinh trùng Sau đó HOS Test là test duy nhất được WHO

2010 khuyến cáo sử dụng như một test đánh giá tỉ lệ tinh trùng sống trongmẫu tinh dịch có thể thay thế cho phương pháp nhuộm màu trước đó [4], [39].Qua các nghiên cứu thấy rằng hỗn hợp HOST natri citrate – fructose cóphần trăm tinh trùng có phản ứng HOS Test tối ưu ở tinh trùng các loài dê,cừu, người (ở 150 mosmol/l trong môi trường chứa fructose tỉ lệ cuộn đuôi là60,0% cao hơn đáng kể so với môi trường chứa sucrose tỉ lệ cuộn đuôi là43,2%) trong khi đó hỗn hợp natri citrate- sucrose gây phản ứng HOS Test tối

ưu ở tinh trùng các loài thỏ, ngựa [40], ]41] Có sự khác biệt này là do nhữngyếu tố ảnh hưởng đến qua trình khuếch tán như đã trình bày ở trên, trong đóyếu tố ảnh hưởng ở đây là trọng lượng, kích thước phân tử của chất hòa tan,fructose là monosaccharide, sucrose là dicaccharide và độ dày cũng như tínhchất màng tinh trùng ở mỗi loài Sự khác biệt này làm dòng nước vào tinhtrùng là khác nhau ở các loài, [42], [43]

Vì vậy với mỗi loài có thể lựa chọn loại dịch áp suất thẩm thấu phù hợpnhất để thực hiện HOS Test với kết quả tối ưu nhất

Các loại dịch áp suất thẩm thấu thấp ngày càng được phát triển để tănghiệu quả phản ứng HOS Test, thực hiện dễ dàng và thuận tiện hơn cũng nhưđảm bảo tính an toàn cho tinh trùng để sử dụng cho các mục đích khác, đặcbiệt là dùng cho ICSI Loại dung dịch như Jayendran đã đề cập ở trên kháphức tạp trong quá trình thực hiện, dung dịch đơn thuần chỉ có đường vàmuối, trong khi môi trường xung quanh tinh trùng và trứng cần nhiều thànhphần hơn để đảm bảo khả năng tồn tại của tinh trùng cũng như sự sống củatrứng là tốt nhất đặc biệt trong quá trình ICSI ta cần tạo ra loại dịch áp lựcthẩm thấu thấp nhanh chóng, gọn gàng, dễ làm và cũng cung cấp môi trườngsao cho sau HOS Test tinh trùng có khả năng hồi phục nhanh hơn.

Năm 1995, Bourne báo cáo việc sử dụng dung dịch áp suất thẩm thấuthấp 100mosmol/l bằng cách pha môi trường nuôi cấy tế bào với nước cất đểlựa chọn tinh trùng sống trong mẫu tinh trùng bất động để ICSI Kết quả chothấy tỉ lệ thụ tinh cao hơn so với nhóm không dùng HOS Test [44]

Casper (1996) đã sử dụng dung dịch áp suất thẩm thấu thấp bằng cáchpha 75mM fructose với 25mM muối citrate trong nước cất để lựa chọn tinhtrùng sống trong mẫu tinh trùng bất động để ICSI [45]

Liu, Tsai và cộng sự (1997) đã sử dụng dung dịch áp suất thẩm thấuthấp gồm hỗn hợp NaCl 0,9% và nước cất với áp suât thẩm thấu là150mosmo/l để lựa chọn tinh trùng bất động nhưng còn sống trong mẫu tinhtrùng bất động hoàn toàn tiêm vào bào tương noãn, kết quả là đã có thai 1trong 3 bệnh nhân [46]

Năm 1997, Verheyen đã so sánh ba loại dịch áp suất thẩm thấu thấptrong việc lựa chọn tinh trùng sống trong các mẫu bất động hoàn toàn, loạidịch thứ nhất là dung dịch Jeyendran cổ điển chứa muối natri citrat và đườngfructose, thứ hai là nước cất, loại dịch thứ ba là dung dịch áp suất thẩm thấuthấp cải tiến gồm 50% môi trường và 50% nước cất [47]

Khi đánh giá ảnh hưởng của dịch thẩm thấu thấp, mặc dù cả ba loại dungdịch đều quan sát thấy tinh trùng có phản ứng HOS Test nhưng phản ứng

HOS Test của tinh trùng ở loại dịch 50% môi trường và 50% nước cất là tối

ưu nhất, tác động có hại trên khả năng sống của tinh trùng là ít nhất với dịch

Ở môi trường 50/50 này tỉ lệ phản ứng HOS Test của tinh trùng khá cao đồngthời tổn thương do áp suất thẩm thấu thấp là tương đối ít, khả năng hồi phụccủa tinh trùng sau khi cho vào môi trường cân bằng đạt tỉ lệ cao rất phù hợptrong các tình huống thực hiện ICSI với mẫu tinh trùng bất động hoàn toàn.Ngược lại, tỉ lệ tinh trùng có phản ứng HOST ở loại dịch 100% nước cất tuy

cao nhưng chủ yếu là loại g - loại phản ứng HOST mạnh nhất, những tinh

trùng có phản ứng mạnh này có sức sống không bền và thường chết sau đó dostress áp lực thẩm thấu Kết quả đã cho thấy loại dịch thẩm thấu thấp chophản ứng HOST tối ưu là dịch với tỉ lệ 50/50 [47] Kết quả này cũng thấy trêntinh trùng của một số loài như bò, dê, lợn [42], [43], [48]

Trong nghiên cứu của Hossain (2010) và cộng sự thấy rằng phản ứngHOS Test ở 37 độ C trong các khoảng thời gian khác nhau cho thấy có sựbiến đổi kết quả phản ứng HOS Test theo thời gian Với mục đích xác định sựbiến đổi các dạng biểu hiện của tinh trùng trong phản ứng HOS Test theo thờigian, mẫu tinh trùng thử nghiệm được lọc rửa để lấy mẫu thực nghiệm HOSTest là 100% tinh trùng di động, tinh trùng có biểu hiện cuộn đuôi ngay khitiếp xúc với dung dịch HOS Test và tăng nhanh ở những phút đầu (phút đầutiên tỉ lệ phản ứng là 41%) Phần trăm tinh trùng có phản ứng HOS Test tăngdần lên (ở 5 phút là 66%), tăng mạnh ở thời điểm 15 phút (89%) và đạt tối ưuxung quanh thời điểm 30 phút (93%) tính từ khi cho tinh trùng vào môitrường áp lực thẩm thấu thấp Trong khoảng thời gian từ 30 phút đến 60 phútphần trăm tinh trùng có phản ứng HOST có tăng lên chút ít (97%) nhưngkhông có sự khác biệt nhiều so với thời điểm 30 phút, nhìn chung là khôngthay đổi Sau 60 phút tỉ lệ tinh trùng có phản ứng HOS Test có tăng lên nhưngchủ yếu là tinh trùng có biểu hiện loại g- loại phản ứng mạnh nhất, loại này cónguy cơ cao bị chết sau HOS Test do tress áp lực thẩm thấu thấp Thực tế,nhiều nghiên cứu trước đó đã chỉ ra rằng stress do áp lực thẩm thấu thấp kéo

dài có thể dẫn đến những tổn thương không thể hồi phục và hậu quả là gâychết tế bào Điều này được khẳng định bằng test sống chết thấy tỉ lệ tinh trùngchết tăng lên sau 60 phút thực hiện HOS Test [49].

Nhiều khoảng thời gian đã được khuyến cáo cho quá trình HOS test từvài phút cho tới hai giờ Khi nghiên cứu trên mẫu tinh trùng của một số độngvật khác như khỉ, voi, chuột, ngựa…Neild (2009) [50], Matson (1999) [51]cũng nhận định rằng HOS test dương tính xuất hiện sớm trong những phútđầu tiên và sự thay đổi sau nhiều khoảng thời gian khác nhau sau 30 phútkhông có ý nghĩa thống kê

Trong quá trình đánh giá phản ứng HOS Test của mẫu tinh dịch,Jayendran (1984) [2], đã quan sát thấy một số dạng biểu hiện của phản ứngHOS Test, gồm 7 dạng như sau (hình 1.3; hình 1.4):

a Không có phản ứng, đuôi thẳng, không phồng

b Phần nhỏ ở cuối của đuôi phồng lên, những phần còn lại bình thường

c Phần cuối của đuôi phồng kèm cuộn đuôi hình kẹp tóc

d Phần cuối của đuôi và phần giữa đuôi phồng kèm cuộn đuôi hình kẹp tóc

e Phần giữa đuôi phồng kèm cuộn đuôi hình kẹp tóc

f Đuôi phồng ít và đồng đều, đuôi ngắn lại

g Toàn bộ đuôi to phồng lên và ngắn lại

Hình 1.3 Các dạng biểu hiện của tinh trùng trong phản ứng HOS Test [2].

a Tinh trùng không có đáp ứng với HOS Test

b – g Các dạng tinh trùng có đáp ứng HOS Test khác nhau

Hình 1.4 Các dạng biểu hiện của tinh trùng có phản ứng HOS Test dưới

kính hiển vi quang học với độ phóng đại 400 lần [52].

A: ảnh chụp mẫu tươi; B: ảnh chụp sau nhuộm màu

A Tinh trùng không đáp ứng với HOS Test

B – G Các dạng tinh trùng có đáp ứng HOS Test khác nhau

Các nghiên cứu của một số tác giả về sau như Chan (1989) [49], Hossain(1998) [52], James và cộng sự (2010) [53] cũng khẳng định điều trên.

Có nhiều loại biểu hiện cuộn đuôi như chỉ cuộn ở phần cuối của đuôi,cuộn hình kẹp tóc, đuôi ngắn lại và dầy lên, toàn bộ đuôi đều phồng lên vàcuộn lại, đuôi cuộn ở nhiều mức độ

Có sự chuyển dạng giữa các loại biểu hiện HOS Test từ dạng b ban đầu thành các loại c, d, e, f, g Trong đó, loại a giảm dần, loại g tăng dần, loại b tăng đột ngột lúc ban đầu sau đó giảm dần Sự chuyển từ dạng b sang g có thể

trực tiếp hoặc thông qua các dạng trung gian Phân tích siêu cấu trúc cho thấy

có các dạng khác nhau của biểu hiện HOS Test là do có sự khác biệt về cấutrúc khung xương tế bào ở đuôi tinh trùng ở các nhóm tinh trùng khác nhau,phản ánh sự thay đổi về sinh lý học giữa các nhóm

1.6 Ứng dụng của HOS Test

1.6.1 Đánh giá mẫu tinh dịch [4]

HOS Test đã được sử dụng rộng rãi như một test đánh giá tỉ lệ tinh trùngsống trong mẫu tinh dịch bên cạnh các kỹ thuật khác như nhuộm sống chếtbằng eosin, eosin - nigrosin HOS Test có giá trị để đánh giá chất lượng tinhdịch bằng cách đánh giá tính toàn vẹn màng bào tương tinh trùng trên người

và nhiều loài động vật khác như ngựa, heo, gia súc Jayendran (1984) bắt đầu

sử dụng HOS Test để đánh giá tính toàn vẹn chức năng màng tinh trùng năm

1984 [2] Sau đó năm 1993, Kumi Diaka đã sử dụng HOS Test để đánh giáchất lượng tinh trùng của chó [54], năm 1988 Watson và Duncan sử dụngHOS Test để đánh giá tinh trùng cừu [55], Rod Gil đánh giá tinh trùng lợnnăm 1996 [56], đánh giá tinh trùng sư tử năm 1998 do Vidament thực hiện[57] và đánh giá tinh trùng bò đực năm 2008 do Samard thực hiện [58]

Trong đánh giá các thông số tinh dịch, mẫu tinh dịch được coi là bìnhthường nếu có từ 60% tinh trùng có phản ứng HOS Test trở lên, và được coi

là bất thường nếu có ít hơn 50% tinh trùng có phản ứng HOS Test Khoảnggiới hạn từ 50- 59% được gọi là khoảng “xám” hay khoảng nghi ngờ vì chưathể kết luận được là mẫu bình thường hay bất thường [4], [38]

HOS Test dựa trên khả năng sưng phồng của tinh trùng khi thực hiệntrong loại dịch áp suất thẩm thấu thấp Hiện nay WHO khuyến cáo sử dụngHOS Test trong các labo về nam học, hỗ trợ sinh sản như một thông số quantrọng trong đánh giá tinh dịch do mối tương quan mạnh của nó với các thông

số tinh dịch khác [4]

1.6.2 HOS Test trong dự đoán khả năng thụ tinh của tinh trùng, góp phần chẩn đoán vô sinh nam

Một trong những khó khăn nhất khi đối mặt với việc đánh giá và điều trị

vô sinh nam là các phân tích tinh dịch theo chuẩn không có khả năng dự đoánkhả năng thụ tinh của tinh trùng Các kiểm tra cần được phát triển để đánh giácác chức năng thực thể khác nhau của tinh trùng hơn là các thông số tiêuchuẩn thông thường, cùng với các thông số chuẩn cần có cái nhìn toàn diện vềhoạt động chức năng của mẫu tinh trùng Vì màng tinh trùng với đầy đủ chứcnăng rất cần thiết cho quá trình thụ tinh nên việc kiểm tra đặc tính của màng

là một chỉ dẫn hữu dụng cho khả năng thụ tinh HOS Test là một test như vậy,

vì test này kiểm tra được tính toàn vẹn màng tinh trùng bằng cách đánh giáphản ứng của nó dưới điều kiện áp suất thẩm thấu thấp [59], [60]

1.6.3 HOS Test giúp lựa chọn tinh trùng có sự toàn vẹn DNA cao

Mối quan tâm lớn trong quá trình lựa chọn tinh trùng cho ICSI là tinhtrùng được lựa chọn có thể làm tăng nguy cơ đứt gãy DNA Phân mảnh DNA

là một trong những bất thường di truyền của tinh trùng, chiếm 20% cáctrường hợp vô sinh nam Bất thường này ảnh hưởng đến khả năng thụ tinh củatinh trùng Xét nghiệm mức độ phân mảnh DNA có vai trò quan trọng trongviệc chẩn đoán và đưa ra hướng điều trị vô sinh nam [61], [62]

Quá trình thụ tinh giữa trứng và tinh trùng thành công trải qua nhiều giaiđoạn phức tạp như sự trưởng thành của trứng, quá trình giải nén nhân tinhtrùng, sự xuất hiện tiền nhân đực, tiền nhân cái và quá trình hòa nhập hai tiềnnhân Bản chất hòa nhập hai tiền nhân là quá trình sắp xếp lại bộ nhiễm sắcthể loài Quan điểm truyền thống cho rằng tinh trùng đóng góp một nửa bộgen, được coi như là véc tơ đưa DNA vào trứng Tuy nhiên các nghiên cứu

gần đây cho thấy sự đóng góp quan trọng của tinh trùng đến quá trình thụ tinhcũng như sự phát triển của phôi Sự phát triển của phôi phụ thuộc vào một sốcấu trúc, cơ quan, phân tử có trong tinh trùng như bộ gen, tín hiệu kích hoạttrứng, trung thể Trung thể định hướng cho sự hình thành trục thoi phân bào,giúp cho hợp tử phân chia trong lần phân bào đầu tiên [62], [63]

Trong ICSI tinh trùng được lựa chọn chủ yếu dựa trên hình thái bênngoài và độ di động và tiêm thẳng vào bào tương trứng Chính vì vậy đã bỏqua một số giai đoạn so với thụ tinh tự nhiên Việc lựa chọn tinh trùng chỉ dựatrên hình thái và độ di động có thể chọn cả những tinh trùng có tổn thươngDNA, vì những tổn thương DNA là những tổn thương rất tinh tế Một sốnghiên cứu đã chỉ ra rằng tinh trùng bị đứt gãy DNA hoặc phân mảnh DNAkhông có khả năng thụ tinh, vẫn có khả năng thụ tinh nhưng phôi không pháttriển hay chỉ phát triển đến một giai đoạn nhất đinh rồi thoái triển, sảy thai,thai lưu, có thể có trẻ được sinh ra nhưng những ảnh hưởng của tổn thươngDNA lên sự phát triển của trẻ như trẻ đó sau này có thể bị vô sinh, ung thư….Nhũng tinh trùng trong các mẫu bất động thì tỉ lệ phân mảnh DNA cũng nhưtổn thương DNA cao hơn so với tinh trùng trong các mẫu bình thường Tỉ lệtổn thương DNA trong các tinh trùng có hình thái bất thường cũng cao hơn sovới những tinh trùng có ình thái bình thường Để đảm bảo DNA của các tinhtrùng tham gia thụ tinh là toàn vẹn, bình thường cũng như vì một thế hệ trẻcủa thụ tinh ống nghiệm khỏe manh mai sau, HOST đã được sử dụng để lựachọn những tinh trùng ít tổn thương DNA nhất, có sự toàn vẹn của DNA [62].Trước khi sử dụng HOS Test, một số phương pháp dùng để đánh giá sựtổn thương DNA đã được áp dụng như:

- Phương pháp Comet: nhuộm huỳnh quang tinh trùng và soi dưới kính hiển

vi huỳnh quang, do vậy tinh trùng không sử dụng cho ICSI được nữa [64], [65]

- Phương pháp khảo sát chromatin tinh trùng: dựa vào sự thay đổi màu sắccủa acridin organge từ màu xanh khi liên kết với DNA mạch đôi không bị biếntính sang màu đỏ khi liên kết với DNA bị đứt gãy mạch đơn bằng máy đo dòngchảy tế bào Tinh trùng sau kiểm tra không sử dụng cho ICSI được [66]

- Phương pháp đánh dấu đứt gãy DNA bằng các dUTP (TUNEL): địnhlượng sự gắn kết của dUTP tại các mạch đơn hoặc mạch đôi DNA bị đứt gãytrong phản ứng được xúc tác bởi enzyme TdT Tinh trùng sau kiểm tra không

sử dụng cho ICSI được [67]

- Phương pháp khảo sát sự phân tán chất nhiễm sắc của tinh trùng(Halosperm test): tinh trùng trải qua quá trình nhuộm giemsa nên không sửdụng cho ICSI được [68]

HOS Test được sử dụng vì tính ưu việt của nó là không làm tổn thương chotinh trùng, tinh trùng sau nghiệm pháp vẫn sự dụng tiếp cho mục đích khác được.Như đã trình bày ở phần trên, tinh trùng loại a là tinh trùng không cóphản ứng HOS Test nghĩa là tinh trùng không còn chức năng màng bàotương Các loại tinh trùng từ b đến g là các mức độ biểu hiện phản ứng HOSTest, thể hiện mức độ toàn vẹn về mặt chức năng màng tinh trùng khác nhau.Nhiều nghiên cứu sau khi đánh giá sự toàn vẹn của DNA trên các mẫu tinhtrùng khác nhau bằng HOS Test đã cho thấy tinh trùng loại d, e, f có sự tổnthương DNA là tối thiểu Khi đánh giá chi tiết hơn thì tinh trùng loại b, c, d cóliên quan đến tỉ lệ phần trăm và tần suất tổn thương DNA tối thiểu Tinh trùng

có tổn thương tối thiểu DNA nhất là tinh trùng loại d - loại có mức độcuộn/phồng đuôi vừa phải, tiếp theo là loại c Tinh trùng loại a, g có liên quanđến các tổn thương DNA nhiều nhất cũng như tình trạng thiếu protamine,hình thái bất thường và chết theo chương trình Những kết quả này cho thấymức độ cuộn đuôi tinh trùng có liên quan đến chất lượng và đặc biệt là chứcnăng tinh trùng Chính vì vậy cần tránh tiêm các tinh trùng có tổn thươngDNA nhiều vào trứng [69], [70]

Trong chu kỳ ICSI, mẫu tinh dịch sau khi được xử lý, có thể là lọc rửavới những mẫu có di động tốt hay chỉ rửa với mẫu bất động hoàn toàn sẽ đượcđưa vào nơi thực hiện tiêm tinh trùng vào bào tương trứng Các dải dịch áplực thẩm thấu thấp được tạo trên các đĩa petri sau đó phủ dầu lên và ủ ấm.Dùng kim nhỏ đưa khoảng 5 tinh trùng vào mỗi dải nói trên, ủ ấm và quan

sát Những tinh trùng có biểu hiện HOS Test loại c hoặc d sẽ được lựa chọn là

đủ tiêu chuẩn để tiêm vào bào tương trứng Những tinh trùng này được đưasang dải môi trường, rửa từ 3 đến 5 lần, khi tinh trùng trở về hình dạng banđầu thì tiến hành bất động tinh trùng bằng cách siết đuôi rồi tiêm vào trứng Kết quả cho thấy tỉ lệ thụ tinh không có sự khác biệt nhiều giữa nhómthực hiện HOS Test với nhóm chứng Tuy nhiên tỉ lệ phôi phát triển, phôi tốt

để chuyển cũng như tỉ lệ thai tiên triển ở nhóm HOS Test cao hơn đáng kể sovới nhóm chứng Dựa trên các nghiên cứu trước đây và hiện nay, việc lựachọn tinh trùng dựa trên HOS Test cho thấy cải thiện chất lượng tinh trùngbao gồm sự toàn vẹn về DNA, chức năng màng, hình thái cũng như sự chếttheo chương trình Ngoài ra HOS Test còn là một kỹ thuật kiểm tra đơn giản,chi phí thấp, an toàn, có thể thực hiện được ở các labo hỗ trợ sinh sản

1.6.4 HOS Test ứng dụng trong thụ tinh trong ống nghiệm

Sự khác biệt giữa tinh trùng bất động nhưng còn sống với tinh trùng bấtđộng nhưng đã chết trong các mẫu tinh trùng bất động hoàn toàn là một tháchthức lớn khi điều trị các trường hợp vô sinh đặc biệt trong lĩnh vực hỗ trợ sinhsản Việc tiêm tinh trùng chết vào noãn dẫn tới thụ tinh thất bại, trong khi đótiêm tinh trùng sống nhưng bất động vào noãn thì tỉ lệ thụ tinh và làm tổ caohơn so với chọn ngẫu nhiên [40]

Để làm tăng kết quả ICSI trong các trường hợp mẫu tinh trùng bất độnghoàn toàn, nhiều phương pháp đã được mô tả để chọn được tinh trùng bấtđộng nhưng còn sống trong các mẫu tinh trùng bất động hoàn toàn, làm tăngtối đa cơ hội có thai cho các cặp vợ chồng này như thêm pentoxifyllin, canthiệp cơ học, kỹ thuật lazer và HOS Test Kỹ thuật nhuộm tinh trùng phânbiệt được tinh trùng sống hay chết, tuy nhiên việc nhuộm như vậy khiến tinhtrùng bị chết, chất nhuộm màu ảnh hưởng không tốt tới tinh trùng, tỉ lệ thụtinh, tỉ lệ tạo phôi Kỹ thuật cơ học phụ thuộc vào “độ cứng” của tinh trùng vàkhông có khả năng hồi phục lại vị trí ban đầu của chính nó, phụ thuộc vào kỹthuật của người thực hiện Tương tự, kỹ thuật lazer rất đắt nên không thể áp

dụng rộng rãi ở hầu hết các trung tâm IVF Thêm vào đó, sự tin cậy của cả haiphương pháp dựa trên tính toàn vẹn vật lý của màng tế bào mà không tính đếnchức năng màng Trong khi đó, ảnh hưởng của pentoxifyline lên noãn chưađược biết rõ và có thể ảnh hưởng có hại đến phôi.

Mẫu tinh trùng bất động tươi hoặc sau rã đông được rửa với môi trường,

ly tâm lấy cặn dịch treo Trước khi ICSI, 10µl tinh dịch được cho vào dải môitrường có phủ dầu đã được chuẩn bị từ trước Dải môi trường gồm 50% môitrường và 50% nước cất Những tinh trùng có biểu hiện cuộn đuôi sau tối đa 10s

sẽ được lựa chọn để tiêm vào bào tương noãn Những tinh trùng trên sau đóđược đưa sang dải môi trường để rửa ba lần nhằm lập lại cân bằng áp lực thẩmthấu trước khi chuyển sang dải PVP Khi tinh trùng đã trở lại trạng thái cân bằngdùng kim bất động tinh trùng như quy trình thường quy và tiêm vào bào tươngcủa noãn Thường thì tinh trùng xuất hiện cuộn đuôi khá sớm, trong vòng 1 - 2giây đầu khi đưa tinh trùng vào môi trường áp lực thẩm thấu thấp [41]

Kahraman và cộng sự (1996) đã sử dụng HOS Test để lựa chọn tinhtrùng sống trong mẫu bất động hoàn toàn cho ti lệ thụ tinh là 53,5% cao hơn

so với nhóm chọn tinh trùng ngẫu nhiên (41,1%) [72] Vandervorst và cộng

sự (1997) cũng đã báo cáo tỉ lệ thụ tinh trong nhóm sử dụng HOS Test là12,4% [73] Theo Nagy và cộng sự (1998) cho thấy tỉ lệ thụ tinh khi dùngHOS Test là 21% [74] Shulman và cộng sự (1999) cũng đã công bố tỉ lệ thụtinh là 51% khi sử dụng HOS Test ở nhóm mẫu tinh trùng bất động so với62% ở mẫu tinh trùng di động [75] Hassan và cộng sự (2005) cũng cho thấy

tỉ lệ thụ tinh cao hơn có ý nghĩa thống kê ở nhóm sử dụng HOS Test (43,6%)

so với nhóm không sử dụng HOS Test (28,2%) Theo Hassan tỉ lệ phôi độ I

và II cao hơn, tỉ lệ phôi làm tổ cao hơn (17,5% so với 5,7%) Tỉ lệ phôi có khảnăng chuyển phôi được cao hơn ở nhóm HOS Test so với nhóm không sửdụng HOS Test (77,3% so với 60%) Tỉ lệ có thai và thai tiến triển cao hơntrong nhóm sử dụng HOS Test (27,3% và 20,5%) so với nhóm không sử dụngHOST (5,7% và 2,9%) Kết quả của nhóm sử dụng tinh trùng tươi với nhómtinh trùng sau rã đông không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê [1]

Từ các kết quả trên cho thấy việc lựa chọn tinh trùng sống từ những tinhtrùng bất động trước khi ICSI bằng HOS Test làm tăng tỉ lệ thụ tinh, tỉ lệ phôiphát triển và làm tổ, tăng tỉ lệ có thai và thai tiến triển khi so sánh với việc lựachọn tinh trùng bất động nhưng sống chỉ dựa trên hình thái.

HOS Test là một phương pháp lựa chọn tinh trùng bất động nhưng cònsống khả thi nhất vì ít ảnh hưởng tới sự sống của tinh trùng Hiện nay HOSTest có thể được thực hiện một cách dễ dàng ở mỗi lab với giá thành thấp.Điều này cho thấy rằng HOS Test có thể cung cấp thông tin về khả năng thụtinh của tinh trùng tốt hơn các thông số phân tích tinh dịch truyền thống [76]

Vì tầm quan trọng rất lớn của màng tinh trùng trong thụ tinh, cần cân nhắcviệc đánh giá tính toàn vẹn màng bào tương tinh trùng [77] Sự thụ tinh giữatinh trùng với trứng sẽ không xảy ra nếu màng bào tương tinh trùng bị tổnthương về mặt chức năng Do đó HOS Test là chỉ thị rất tốt cho khả năng thụtinh hơn là nhuộm tươi [78]

Tóm lại: Trong HOS Test, nhằm tìm ra tinh trùng sống, tinh trùng được

cho vào môi trường nhược trương (hypo - osmotic medium), nếu còn sống,nghĩa là màng bao tinh trùng từ đầu đến đuôi còn nguyên vẹn cả về cấu trúc

và chức năng, tinh trùng sẽ cong đuôi Có nhiều dạng phản ứng khác nhautrong HOS Test, đã được nhiều tác giả mô tả, tuy nhiên sự thay đổi về tỉ lệcủa các dạng theo thời gian vẫn chưa được nghiên cứu đánh giá nhiều Nhiềuloại dung dịch áp lực thẩm thấu khác nhau đã được một số tác giả đề xuất, vớimỗi loại sẽ cho mức độ HOS Test dương tính khác nhau Nghiên cứu này củachúng tôi nhằm mục đích tiến hành làm rõ những vấn đề trên

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng

Mẫu tinh trùng bất động hoàn toàn của 37 người đàn ông

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Mô hình nghiên cứu

Mẫu tinh dịch người

Đánh giá mẫu tinh dịch:

mật độ, tỉ lệ sống bằngeosin, hình thái

Rửa mẫu tinh dịch đểloại tinh tươngThực hiện HOS Test

Nhóm 4: Dungdịch có 100%

là nước cất

Nhóm 3: Dungdịch có tỉ lệ nướccất/môi trường là75%/25%

Nhóm 2: Dungdịch có tỉ lệ nướccất/môi trường là50%/50%

Nhuộm eosin ở mỗi khoảng thời gian trên

sau khi đã đánh giá HOS Test

So sánh/Đánh giá kết quả