Phân lập huperzinin từ cây thạch tùng dương (lycopodium casuarinoides spring, lycopodiaceae)

Nghiên cứu đặt vấn đề - mục đích nghiên cứu về: Nhóm alkaloid của họ thạch tùng thu hút sự quan tâm của nhiều nhà khoa học trên thế giới. Trong số những loài thạch tùng mọc ở Việt Nam, cây thạch tùng dương phân bố nhiều ở các tỉnh Tây Nguyên. Nghiên cứu phân lập alkaloid trong loài này làm cơ sở cho các thử nghiệm sinh học tiếp theo.

Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ Số * 2013 Nghiên cứu Y học PHÂN LẬP HUPERZININ TỪ CÂY THẠCH TÙNG DƯƠNG (LYCOPODIUM CASUARINOIDES SPRING, LYCOPODIACEAE) Nguyễn Ngọc Chương*, Trần Cơng Luận** TĨM TẮT Đặt vấn đề - Mục đích nghiên cứu: Nhóm alkaloid họ Thạch tùng thu hút quan tâm nhiều nhà khoa học giới Trong số loài thạch tùng mọc Việt Nam, Thạch tùng dương phân bố nhiều tỉnh Tây Nguyên Nghiên cứu phân lập alkaloid loài làm sở cho thử nghiệm sinh học Đối tượng - Phương pháp nghiên cứu: Sử dụng phương pháp sắc ký trao đổi Diaion HP-20 sắc ký cột cổ điển quy trình phân lập alkaloid Thạch tùng dương Thực phương pháp đo phổ UV, phổ hồng ngoại, điểm chảy, phổ cộng hưởng từ hạt nhân để xác định cấu trúc hóa học chất phân lập Kết quả: Sử dụng hai phương pháp sắc ký trao đổi ion phương pháp sắc ký cột cổ điển thuận lợi để phân lập Huperzinin Thạch tùng dương Kết luận: Kết đề tài sở để thực nghiên cứu phân lập alkaloid thạch tùng thử nghiệm sinh học Từ khóa: Họ Thạch tùng, Thạch tùng dương, Huperzinin, alkaloid họ Thạch tùng ABSTRACT ISOLATION HUPERZININE FROM LYCOPODIUM CASUARINOIDES SPRING, LYCOPODIACEAE Nguyen Ngoc Chuong, Tran Cong Luan * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 18 - Supplement of No – 2014: 191 - 196 Background - Objectives: Lycopodium alkaloids have attracted great attention from scientists in the world Lycopodium casuarinoides, a member of Lycopodiaceae, widely distributes in the Highland Central of Viet Nam Studying on isolation of lycopodium alkaloids from this species would have contributed to subsequent biological tests Methods: Ion exchange chromatography with Diaion Hry P-20 and column chromatography were used in alkaloid extraction and isolation processes from Lycopodium casuarinoide The chemical structure of isolated compound was elucidated by UV spectrum, infrared spectrum, melting points, nuclear magnetic resonance spectrum Results: Both two methods of ion exchange chromatography and column chromatography method are very useful for isolation Huperzinine from Lycopodium casuarinoide Conclusion: The results of this research would have contributed to subsequent isolation study of other lycopodium alkaloids and biological testing Keywords: Lycopodiaceae, Lycopodium casuarinoides, Huperzinine, lycopodium alkaloids Thạch tùng có khung cấu trúc ĐẶT VẤN ĐỀ lycodin, lycopodin, fawcettimin nhóm có Những hợp chất tự nhiên alkaloid họ * Khoa Y học Cổ Truyền – Đại học Y Dược Tp HCM ** Trung Tâm Sâm Dược liệu Tp Hồ Chí Minh-Viện Dược liệu Tác giả liên lạc: ThS Nguyễn Ngọc Chương ĐT: 0913649750 Email: chuong0911@yahoo.com Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 191 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ Số * 2013 cấu trúc khác Vào năm 1986, tác giả Liu cộng phát khả ức chế enzyme acetylcholinesterase huperzin A huperzin B phân lập từ Thạch tùng alkaloid họ Thạch tùng quan tâm nhiều nhà khoa học nghiên cứu phân lập, thử tác dụng sinh học tổng hợp hữu Hàng loạt cơng trình nghiên cứu nhiều nước giới thuộc họ Thạch tùng công bố thời gian gần đây(1,2,6) Ở nước ta, có nhiều lồi họ Thạch tùng tìm thấy vùng núi cao thuộc tỉnh Tây Nguyên chưa nghiên cứu, có Thạch tùng dương (3,5) Để góp phần nghiên cứu phân lập hợp chất tự nhiên loài này, làm sở để thực nghiên cứu tác dụng sinh học sau, tiến hành nghiên cứu phân lập alkaloid Thạch tùng dương NGUYÊNLIỆU -PHƯƠNGPHÁP NGHIÊNCỨU Nguyên liệu Toàn Thạch tùng dương (Lycopodium casuarinoides Spring, Lycopodiaceae) thu hái rừng Quốc gia Bidoup - Núi Bà, Lâm Đồng, rửa sạch, phơi khô âm can, tán thành bột thơ Hóa chất trang thiết bị Hóa chất - dung mơi Dicloromethan, cloroform, methanol, ethyl acetat, diethyl ether, aceton, n-hexan, isopropanol (Trung Quốc), NH4OH, HCl 5% NaOH 1N (Việt Nam), thuốc thử Dragendorff Trang thiết bị Bản mỏng silica gel 60 F254, silica gel cỡ hạt 40-63 µm (Merck, Đức) Diaion loại hạt HP-20 hãng Misubishi (Nhật) sản xuất Cân phân tích Satorius độ nhạy 0,1 mg (Nhật), bếp cách thủy Memmert WB.14 (Đức), máy cô quay buchi R300 (Thụy sỹ), máy siêu âm Sanorex RK510 H (Pháp), máy đo phổ hồng ngoại FTIR - 820PC Bruker, máy đo cộng hưởng từ hạt nhân Bruker 192 AV 500 (500 MHz), máy soi UV hai bước sóng 254 nm 365 nm Vilber Lourmat (Pháp), máy quang phổ UV-Vis 1800 Shimadzu (Nhật) Phương pháp nghiên cứu Nghiên cứu thực vật học Nguyên liệu toàn Thạch tùng dương tươi, có đầy đủ rễ, thân, thu hái rừng Quốc gia Bidoup - Núi Bà, Lâm Đồng Mẫu thu thập chụp hình ghi nhận đặc tính sinh thái Kết hợp với đặc điểm hình thái, sử dụng tài liệu tham khảo thực vật học chuyên ngành, để định danh xác tên khoa học loài nghiên cứu Nguyên liệu cắt nhỏ, phơi khơ bóng râm, xay bột dùng để soi bột, nghiên cứu sơ thành phần hóa học hóa học, thử tinh khiết Chiết xuất 10 kg bột thô Thạch tùng dương làm ẩm methanol, cho vào bình ngấm kiệt, chiết kiệt alkaloid methanol Cô dịch chiết áp suất giảm, cắn thu chiết tiếp tục hòa tan với acid HCl 5%, lọc thu dịch acid, dịch lắc với diethyl ether để loại tạp chất phân cực, sau kiềm hóa NH4OH đến pH=10 thu dịch alkaloid toàn phần Phân lập tinh chế Sắc ký cột trao đổi ion Dịch alkaloid toàn phần nạp vào cột Diaion HP 20 Sau đó, cho dung môi nước khử ion, methanol 20%, methanol 100%, dicloromethan Phân đoạn methanol 100% dicloromethan cô đến cắn thu hai phân đoạn alkaloid Kiểm tra phân đoạn sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi CH2Cl2-MeOH-NH3 (90:10:0,1), phát đèn UV 254 nm thước thử Dragendorff Sắc ký cột cổ điển Cột thủy tinh (6 x 70 cm), pha tĩnh silica gel cỡ hạt 40-63 µm, nạp mẫu ướt cách hòa tan mẫu vừa đủ với dicloromethan, mẫu nạp Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ Số * 2013 phân đoạn methanol 100% Pha động ban đầu triển khai dung mơi dicloromethan, sau tăng dần thể tích methanol đến tỉ lệ dicloromethan:methanol (90:10), thể tích hứng lần 100 ml, tốc độ ml/phút Kiểm tra phân đoạn sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi CH2Cl2-MeOH-NH3 (90:10:0,1), phát đèn UV 254 nm thuốc thử Dragendorff Kiểm tra độ tinh khiết Kiểm tra độ tinh khiết phương pháp sắc ký lớp mỏng, triển khai mỏng ba hệ dung mơi có độ phân cực khác Sắc ký đồ chất tinh khiết phải cho vết gọn soi đèn UV 254 nm có màu cam với thuốc thử Dragendorff Đo điểm chảy Thân lưỡng phân Lá Nghiên cứu Y học Xác định nhiệt độ nóng chảy máy đo điểm chảy Đo phổ UV Xác định cấu trúc Dùng phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân chiều chiều KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Thực vật học Đặc điểm hình thái Cây thảo mọc bò mặt đất khác; thân cứng, dài, thân rộng khoảng mm, lưỡng phân đều; hình kim hay dải nhọn, khơng cuống, thân nhỏ mọc thưa, nhánh mọc dày lớn Lá sinh sản khác thường tập trung thành bào tử đỉnh nhánh, dạng chùy Túi bào tử hình thận Bơng bào tử Lá Rễ Hình Đặc điểm hình thái Thạch tùng dương Đặc điểm vi phẫu A B C Hình 2.Vi phẫu rễ (A), thân (B), (C) Thạch tùng dương Vi phẫu rễ Vi phẫu rễ Thạch tùng dương có tiết diện tròn gần tròn Cấu tạo từ ngồi vào Chun Đề Y Học Cổ Truyền gồm lớp ngoại bì mang lơng hút, vòng đai mơ cứng hóa sợi, vùng tủy chứa libe gỗ xếp xen kẽ (phân hóa chưa rõ rệt) 193 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ Số * 2013 Nghiên cứu Y học Vi phẫu thân Vi phẫu thân Thạch tùng dương có tiết diện tròn gần tròn, có nhiều rãnh Cấu tạo từ vào gồm lớp biểu bì, mơ mềm vỏ, mơ mềm có vách hóa gỗ, số bó dẫn phụ nằm vùng mơ mềm vỏ, vòng đai mơ cứng bao quanh vùng tủy, vùng tủy gồm libe gỗ xếp đặc sắc, gỗ xếp thành dãy Bào tử Đặc điểm bột dược liệu Cảm quan: Bột màu nâu vàng, mùi thơm nhẹ Quan sát kính hiển vi thấy: Biểu bì mang lỗ khí, mảnh mơ mềm, mảnh nhựa, bào tử, sợi, mạch vạch, mạch xoắn Biểu bì mang lỗ khí Mảnh mơ mềm Mảnh nhựa Hình Đặc điểm bột dược liệu Thạch tùng dương Kết đo độ ẩm, độ tro hàm lượng chất chiết Bảng Độ ẩm Thạch tùng dương Lần đo Độ ẩm (%) Lần Lần Lần 8,68 8,47 8,30 Trung bình 8,48 Bảng Độ tro Thạch tùng dương Lần đo 4,30 3,83 Trung bình 3,98 0,15 0,12 0,13 Lần Lần Lần Độ tro tồn phần (%) 3,81 Độ tro khơng tan HCl 0,13 (%) Bảng Hàm lượng chất chiết Thạch tùng dương Lần đo 19,20 Trung bình 19,20 18,60 18,55 Lần Lần Lần Chiết lạnh với nước (%) 19,10 19,25 Chiết lạnh với methanol 18,35 18,65 (%) Khảo sát sơ thành phần hóa thực vật Sơ định tính thành phần hóa thực vật Thạch tùng dương gồm có triterpenoid tự do, alkaloid, coumarin, saponin, acid hữu chất khử Kết phân đoạn từ cột Diaion HP-20 Trong phân đoạn thu từ cột Diaion HP-20 có phân đoạn methanol 100% (6,6g) 194 Vi phẫu Vi phẫu Thạch tùng dương có cấu tạo từ ngồi vào gồm lớp biểu bì mang lỗ khí, mơ mềm giậu, vùng tủy gồm bó dẫn chưa phân hóa, xung quanh có tế bào tẩm mộc tố Mạch vạch Mạch xoắn dicloromethan (0,7g) dương tính với thuốc thử Dragendroff Phân đoạn nước methanol 20% khơng có alkaloid Chuẩn bị mẫu: 6,6 g cắn alkaloid thu từ phân đoạn methanol 100% hòa tan với lượng vừa đủ với dichloromethan, nạp mẫu ướt vào cột sắc ký (6 x70 cm) Pha tĩnh khoảng 450 g sillicagel hạt vừa (kích thước 0,040-0,063 mm) Nhồi cột ổn định cột khoảng dung môi dicloromethan Khai triển cột với hệ dung mơi CH2Cl2-MeOH có tỷ lệ thay đổi từ 100:0 đến 80:20 Tốc độ 2ml/ phút Thể tích hứng 100 ml Kết thu phân đoạn bao gồm alkaloid khác Phân đoạn I sau thu hồi dung mơi, bình cầu xuất tinh thể màu vàng nhạt, tinh thể rửa aceton kết tinh lại aceton-methanol (1:1) Tái kết tinh lại nhiều lần đến thu tinh thể không màu, đặt tên HT1 Kết thu 1,07g HT1 Kiểm tra độ tinh khiết chất HT1 Tiến hành triển khai SKLM với hệ dung môi khác nhau, phát soi đèn UV 254 nm, 365 nm, thuốc thử Dragendorff Hình cho thấy HT1 chất tinh khiết Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ Số * 2013 CH2Cl2-MeOH-NH3 (90:10:0,5) UV 254 UV 365 TT Dragedorff EtOAc-MeOH-H2O-NH3 (100:13,5:10:0,5) UV 254 UV 365 Nghiên cứu Y học n-hexan-EtOAc-NH (40:60:0,5) TT Dragedorff UV 254 UV 365 TT Dragedorff Hình 4: Sắc ký đồ kiểm tra độ tinh khiết HT1 Xác định cấu trúc HT1 HT1 kết tinh dạng tinh thể hình kim khơng màu, dễ tan CH3Cl3, CH2Cl2, MeOH; cho màu cam bền với thuốc thử Dragendorff Phổ IR HT1 Các băng hấp thụ 1660, 1619, 1554 cho thấy HT1 có tín hiệu nhóm ceton, nối đôi carbon α-β Phổ MS HT1 Phổ LC MS (ESI+) có mảnh m/z = 271,25 cho thấy [M+H]+ = 271,25 dạng dimer [2M+H]+ = 541,31 Do HT1 có khối lượng phân tử tương đương 270, tương ứng với công thức phân tử C17H22N2O (Ω=8) nhóm methylen, gồm: nhóm -CH2- sp3 (δC 29,152 44,469 ppm), nhóm =CH2 sp2 (δC 116,258 ppm) nhóm methin, gồm: nhóm >CH- sp3(δC 38,808 45,840); nhóm =CH- sp2 (δC 117,624; 124,479; 140,221 142,433 ppm) nhóm Carbon bậc 4, gồm: nhóm –NHC=O (δC 165,119 ppm); nhóm >C= sp2 (δC 118,723; 134,315 142,823 ppm); nhóm >C-N< (δC 59,888 ppm) Từ liệu phân tích được, định hướng HT1 hợp chất huperzinin 16 15 Phổ UV HT1 Phổ UV MeOH HT1 cho cực đại hấp thu 229,50 nm 308,00 nm Phổ NMR HT1 Phổ 13C-NMR cho 16 tín hiệu carbon Phổ 1H-NMR lấy tích phân cho 22 nguyên tử hydro Phổ NMR cho thấy diện 16 nhóm tín hiệu carbon, có tín hiệu của carbon tương đương, bao gồm: nhóm methyl, gồm: CH3-C= (δC 22,849 ppm); 1nhóm (CH3)2-N (δC 39,512 ppm) Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 14 H 10 12 11 13 N H N O Hình Cơng thức phân tử huperzinin Các kết phổ NMR chiều chiều chứng minh alkaloid HT1 huperzinin 195 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ Số * 2013 Nghiên cứu Y học Bảng Bảng liệu phổ NMR HT1và So sánh liệu phổ 1H-NMR 13C-NMR HT1với huperzinin tài liệu (4) Huperzinin(400MHz, CDCl3)[4] HT1 (500MHz, CDCl3) C DEPT δC(ppm) δH (ppm,m,J) HMBC COSY δC(ppm) C 165,1 ─ ─ ─ 165,1 CH 117,6 6,45 (d, J=9,4) 1, 117,6 6,45 (d, J=9,4) CH 142,4 7,66 (d,J=9,45) 1, 5, 13 142,4 7,66 (d,J=9,45) C 118,7 ─ ─ ─ 118,7 C 142,8 ─ ─ ─ 142,8 5, 7, 8, 12 29,2 2,98 (dd, J=17,6/5,1)2,42 (s) CH2 29,2 2,98 (dd, J=17,6/5,1) 2,42 (s) CH 38,8 2,42 (s) 8, 12, 13 6, 8, 12 38,8 2,42 (s) CH 124,5 5,36 (d, J=5,1) 7, 14, 16 7, 14 124,5 5,36 (d, J=5,1) 10 CH2 116,3 5,19 (dd, J=17/1,7) 5,05 (dd, J=10,1/1,85) 11, 12 11 116,3 5,19 (dd, J=17/1,7) 5,05 (dd, J=10,1/1,85) 11 CH 140,2 5,96(ddd, J=17/10,1/10,1) 12 10 140,2 5,96(ddd, J=17/10,1/10,1) 12 CH 45,8 2,86 (dd, J=10,1/3,9) 6, 7, 10, 13 7, 11 45,8 2,86 (dd, J=10,1/3,9) 13 C 59,9 ─ ─ ─ 59,9 14 CH2 44,5 1,62 (d, J=17,35) 2,79 (d, J=17,35) 15 C 134,3 ─ ─ ─ 134,3 16 CH3 22,8 1,54 (s) 6, 8, 14, 15 14 22,8 1,54 (s) CH3 39,5 2,42 (s) 7, 12, 13, ─ 39,5 2,42 (s) CH3 39,5 2,42 (s) 12, 13 ─ 39,5 2,42 (s) 13,00 (s) ─ ─ N(Me)2 N-H 4, 8,12, 13, 15, 16 8, 16 KẾT LUẬN Kết nghiên cứu xác định mặt thực vật học phương pháp nghiên cứu hóa học phù hợp Thạch tùng dương, xây dựng quy trình chiết xuất, phân lập alkaloid từ Đã kiểm tra tiêu hóa lý điểm chảy, độ hấp thu UV, phổ IR Cấu trúc xác định phương pháp phổ nghiệm 1D 2D NMR chứng minh alkaloid huperzinin phân lập từ Thạch tùng dương Việt Nam Kết nghiên cứu sở phục vụ cho nghiên cứu phân lập tiếp tục alkaloid khác loài thử nghiệm sinh học TÀI LIỆU THAM KHẢO δH (ppm,m,J) 44,5 1,62 (d, J=17,35) 2,79 (d, J=17,35) (2013).“Lycopodium alkaloid: Pharmacology” Natural products, 39, pp 1241, 1243, 1248, 1252 -1 253 Liu JS and MF Huang (1994) “The alkaloids huperzines C and D and huperzinine from “Lycopodiastrum casuarinoides” Phytochemistry, 37(6), pp 1759 - 1761 Phạm Hoàng Hộ (2000) Cây cỏ Việt nam NXB Trẻ, 1, tr 22 - 26 Yin S, Fan CQ, ang, XN W and Jian-Min Yue (2006).“LycodineType Alkaloid from Lycopodium casuarinoides”, Helvetica Chimica Acta, 89, pp 138, 140 Võ Văn Chi, Trần Hợp (1999) Cây cỏ có ích Việt Nam, NXB Giáo dục, tập1, tr 34, 58 Xiaoqiang Ma and David R Gang (2004) “The lycopodium alkaloid” Nat.Prod Rep., 21, pp 753 ,758 - 759 Ngày nhận báo: 3/10/2013 Ngày phản biện nhận xét báo: 15/10/2013, 17/10/2013 Ngày báo đăng: 02/01/2014 Olafsdottir ES, Halldorsdottir ES, Pich NM, and Omarsdottir S 196 Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền ... B phân lập từ Thạch tùng alkaloid họ Thạch tùng quan tâm nhiều nhà khoa học nghiên cứu phân lập, thử tác dụng sinh học tổng hợp hữu Hàng loạt cơng trình nghiên cứu nhiều nước giới thuộc họ Thạch. .. điểm hình thái Thạch tùng dương Đặc điểm vi phẫu A B C Hình 2.Vi phẫu rễ (A), thân (B), (C) Thạch tùng dương Vi phẫu rễ Vi phẫu rễ Thạch tùng dương có tiết diện tròn gần tròn Cấu tạo từ ngồi vào... dược liệu Thạch tùng dương Kết đo độ ẩm, độ tro hàm lượng chất chiết Bảng Độ ẩm Thạch tùng dương Lần đo Độ ẩm (%) Lần Lần Lần 8,68 8,47 8,30 Trung bình 8,48 Bảng Độ tro Thạch tùng dương Lần đo