Bài viết nhằm đánh giá sơ bộ về tác dụng chống oxy hóa của các phân đoạn từ phần trên mặt đất của VCLN và phân lập các chất tinh khiết từ phân đoạn có tác dụng chống oxy hóa mạnh để sử dụng cho những nghiên cứu tiếp theo.
Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 PHÂN LẬP FLAVONOID TỪ PHÂN ĐOẠN CĨ TÍNH CHỐNG OXY HĨA CỦA CÂY VIỄN CHÍ LÁ NHỎ (POLYGALA PANICULATA L.) Lê Văn Huấn*, Nguyễn Thùy Dung**, Bùi Thế Vinh**, Trần Cơng Luận** TĨM TẮT Mở đầu: Viễn chí nhỏ (VCLN) (Polygala paniculata) xếp vào nhóm thuốc an thần danh mục dược liệu Bộ Y tế công nhận chủ yếu sử dụng sở khám chữa bệnh (Thông tư ban hành ngày 29/04/2010) Dân gian dùng rễ làm thuốc xoa bóp chữa tê thấp, nhức mỏi; nước sắc dùng chữa chứng đầy hơi, sổ mũi, hen suyễn Dịch chiết từ P paniculata chứng minh hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm, kháng virus, chống khối u… Mục tiêu: Đề tài nhằm đánh giá sơ tác dụng chống oxy hóa phân đoạn từ phần mặt đất VCLN phân lập chất tinh khiết từ phân đoạn có tác dụng chống oxy hóa mạnh để sử dụng cho nghiên cứu Đối tượng phương pháp nghiên cứu: Nguyên liệu phần mặt đất VCLN (Polygala paniculata L.) thu hái Lâm Hà-Lâm Đồng, phơi khô, xay bột thô, bảo quản nhiệt độ phòng Bột VCLN chiết ngấm kiệt với methanol, sau lắc phân bố với ether dầu hỏa, ethyl acetat, n-butanol, cô thu hồi dung môi thu cao tương ứng Các cao dùng để đánh giá hoạt tính chống oxy hóa thử nghiệm qt gốc tự DPPH Phân đoạn có tác dụng chống oxy hóa mạnh phân tách kỹ thuật sắc ký cột Sau kiểm tra độ tinh khiết, chất phân lập xác định cấu trúc phổ MS NMR Kết quả: Đã đánh giá hoạt tính chống oxy hóa cao phân đoạn ether dầu hỏa, ethyl acetat, nbutanol cao nước cho thấy hoạt tính chống oxy hóa Từ cao ethyl acetat thể hoạt tính chống oxy hóa mạnh phân lập xác định cấu trúc hợp chất F (52 mg) ombuosid (4ʹ,7-di-Omethylquercetin-3-O-rutinosid) Kết luận: Phân đoạn ethyl acetat chứng minh có hoạt tính chống oxy hóa mạnh thử nghiệm quét gốc tự DPPH Từ 90 g cao ethyl acetat phân lập hợp chất F Bằng kỹ thuật phổ học xác định cấu trúc hóa học 4ʹ,7-di-O-methylquercetin-3-O-rutinosid (ombousid), lần hợp chất F công bố phân lập từ VCLN thu hái Lâm Đồng Từ khóa: Polygala paniculata L., Viễn chí nhỏ, ombuosid, chống oxy hóa ABSTRACT BIO-GUIDED ISOLATION FLAVONOID FROM ANTIOXIDANT EXTRACTS OF POLYGALA PANICULATA L Le Van Huan, Nguyen Thuy Dung, Bui The Vinh, Tran Cong Luan * Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Supplement of Vol 23 - No 2- 2019: 06 – 11 Background: In Viet Nam, Polygala paniculata L is a popular medicinal herb used for preparing traditional ointment for the treatment of rheumatism, aches, runny nose, cough, asthma or for intestinal support Extracts from this medicinal plant were demonstrated effectively on treatment of antibacteria, antivirus, anti-tumor * Trung tâm Khoa học Cơng nghệ Dược Sài Gòn, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh Trung tâm Sâm Dược liệu Thành phố Hồ Chí Minh - Viện Dược liệu Tác giả liên lạc: ThS Lê Văn Huấn ĐT: 0934126086 Email: lvhuan@ump.edu.vn ** Chuyên Đề Dược Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 Nghiên cứu Y học Objective: The aim of this study is to preliminarily investigate the antioxidant activities of fractions from the aerial parts of P paniculata and to isolate of the potential compounds from the active fractions for further studies Materials and Methods: The aerial parts of of Polygala paniculata were collected in Lam Dong province (October, 2015), dried and ground to coarse powders, macerated with methanol, partitioned with increasing polar solvents (petroleum ether, ethyl acetate and n-butanol) to yield fractions, respectively Antioxidant activity survey of extracts was obtained by radical scavenging DPPH method, isolation of the compounds from the highest activity extract was carried out by VLC, conventional column chromatography The structures of these compounds were identified by MS and NMR spectral data Results: This study found out that all of extracts of the aerial parts of P paniculata exhibited antioxidant activity Among them, EtOAc fraction possessed the highest level of activity From ethyl acetate fraction, compound named F (52 mg) was isolated and determined as 4ʹ,7-di-O-methylquercetin-3-Orutinoside (ombuoside) Conclusion: The highest antioxidant fraction was identified as ethyl acetate by radical scavenging DPPH method From ethyl acetate fraction, pure compound was isolated, then its structure was determined as 4ʹ,7-di-O-methylquercetin-3-O-rutinoside (ombuoside) according to MS and NMR spectral data This is the first time ombouside is reported as the constituent of P paniculata collected in Lam Dong Key words: Polygala paniculata L., ombuoside, antioxidant ĐẶT VẤNĐỀ NGUYÊNLIỆU-PHƯƠNGPHÁP NGHIÊNCỨU Theo kinh nghiệm dân gian, Viễn chí nhỏ dùng làm thuốc xoa bóp chữa tê thấp, nhức mỏi; nước sắc dùng chữa chứng đầy hơi, sổ mũi; nước hãm VCLN chữa ho, hen suyễn phối hợp thuốc chữa tiêu chảy(8) Trên giới, nghiên cứu hoá thực vật cho thấy VCLN chứa hợp chất lignan, flavonoid, saponin, xanthon, coumarin (1,2); nhiều cơng trình nghiên cứu dược lý xác định hoạt tính bảo vệ tế bào thần kinh, bảo vệ dày, khả giảm đau chế ức chế thụ thể cảm nhận đau(3,7) Những đặc tính cho thấy Viễn chí nhỏ dược liệu q, có nhiều hoạt tính sinh học thu hút quan tâm nhiều nhà nghiên cứu Do đó, nước ta, việc nghiên cứu hóa học đặc biệt hoạt tính sinh học loài cần thiết, định hướng cho nghiên cứu ứng dụng sâu hơn, nâng cao giá trị khoa học sử dụng phổ biến ngành dược loại dược liệu Nguyên liệu Chuyên Đề Dược Cây VCLN nhóm điều tra thuộc Trung tâm Sâm Dược liệu thu hái vùng rừng thuộc huyện Lâm Hà-Lâm Đồng Mẫu định danh lưu môn Dược Liệu, khoa Dược, Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh Phần mặt đất VCLN phơi khô, xay thành bột thơ, bảo quản nhiệt độ phòng Phương pháp nghiên cứu Chiết xuất Bột nguyên liệu chiết ngấm kiệt methanol, thu dịch chiết Cô giảm áp dịch chiết đến dạng cao sệt thu cao methanol thơ Cao methanol thơ hòa với nước lắc phân bố với dung môi ether dầu hỏa (PE), ethyl acetat (EA), n-butanol (nBu) cô riêng biệt để thu phân đoạn cao tương ứng Phương pháp xác định khả dập tắt gốc tự (thử nghiệm DPPH) Mẫu nghiên cứu có tác dụng chống oxy hóa sẽ làm giảm màu DPPH ml mẫu thử Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 nồng độ khác cho phản ứng với đồng lượng dung dịch DPPH 0,6 mM methanol Hỗn hợp sau pha để tối, nhiệt độ phòng 30 phút Đo quang bước sóng λ = 517 nm(4) Acid ascorbic (Merck, Garmany) dùng làm chất đối chiếu 221,58 g cao ethyl acetat (13,43%); 174,74 g cao n-butanol (10,59%) 124,14 g cao nước (7,52%) Các phân đoạn cao tiến hành thử hoạt tính chống oxy hóa Phần trăm (%) hoạt tính chống oxi hóa (HTCO) tính theo cơng thức: cao gồm cao cồn, cao ether, cao ethyl acetat, cao n-butanol cao nước mẫu thử để thử tác dụng chống oxy hóa với thuốc thử DPPH nồng độ tính tốn HTCO(%) (ODc ODt) 100 ODc ODc: Mật độ quang dung dịch DPPH MeOH ODt: Mật độ quang DPPH mẫu thử Cách tính IC50: Từ HTCO (%) nồng độ mẫu khảo sát, vẽ đồ thị tương quan phần mềm Microsoft- Excel 2007 Từ đồ thị biểu thị hoạt tính quét gốc tự DPPH chất khảo sát, xác định phương trình hồi quy tuyến tính dạng y = ax + b, thay y = 50 suy giá trị nồng độ mẫu x chất khảo sát Giá trị IC50 thấp tương ứng với HTCO cao ngược lại Tác dụng chống oxy hóa phân đoạn cao từ phần mặt đất VCLN Trong thử nghiệm DPPH, mẫu thử tác dụng với DPPH làm giảm màu chứng tỏ cao phân đoạn Viễn chí nhỏ có chứa nhóm hợp chất chống oxy hóa Dựa vào giá trị IC50 thử nghiệm DPPH cho thấy cao ethyl acetat có hoạt tính chống oxy hóa mạnh nhất, tiếp đến cao n-butanol Phân lập xác định cấu trúc Phân lập hợp chất kĩ thuật sắc ký cột chân không, sắc ký cột cổ điển, phương pháp kết tinh lại Sắc ký lớp mỏng thực mỏng tráng sẵn silica gel 60 F 254 (Merck), hệ dung môi khai triển ethyl acetat - methanolnước (100:17:13, v/v/v) Silica gel (63-200 μm) (Merck) dùng sắc ký cột Phổ 1H-NMR, 13C-NMR đo máy Bruker AM500 FT-NMR JEOL JNM GX-400, dung môi đo DMSO (Dimethyl sulfoxid) KẾT QUẢ Chiết xuất Từ kg bột VCLN, thu khoảng 36 lít dịch chiết Sau giảm áp, thu 1650 g cao MeOH Hòa nước vào cao MeOH (1:1), lắc phân bố với dung môi ether dầu hỏa (PE), ethyl acetat (EA), nbutanol (n-Bu), cô giảm áp riêng biệt, thu 95,92 g cao ether dầu hỏa (5,81%); Hình 1: Giá trị IC50 hoạt tính quét gốc tự DPPH cao chiết Phân lập hợp chất từ phân đoạn cao ethyl acetat Dựa kết thử nghiệm hoạt tính chống oxy hóa, cao ethyl acetat tiếp tục nghiên cứu để phân lập chất 90 g cao phân đoạn ethyl acetat phân tách sắc ký cột silica gel với hệ dung mơi rửa giải có độ phân cực tăng dần DCM-MeOH (9:1 4:6), thu phân đoạn (EA1 EA8) Từ g cao phân đoạn EA7 phân tách sắc ký cột silica gel pha thuận với hệ dung mơi có độ phân cực khác EA-MeOH (9:1 6:4), phân lập hợp chất, kí hiệu: chất F (52 mg) Chuyên Đề Dược Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 Nghiên cứu Y học Cao ethyl acetat (90 g) Sắc ký cột VLC phân đoạn Phân đoạn EA1 Phân đoạn EA7 Phân đoạn EA8 Silica gel F (52 mg) Sơ đồ 1: Sơ đồ phân lập chất từ cao ethyl acetat sắc ký cột Hợp chất F Bảng 1: Thông số phổ 1H-NMR (400 MHz, DMS O) 13C-NMR (125 MHz, DMSO) chất F đối chiếu với ombuosid(5) Chất F C 4’-OMe 7-OMe 10 1’ 2’ 3’ 4’ 5’ 6’ 1” 2” 3” 4” 5” 6” 1’’’ 2’’’ 3’’’ 4’’’ 5’’’ 6’’’ δC 150,57 133,81 177,56 160,90 98,08 55,63 56,10 165,17 92,29 156,74 105,04 δH, m, (J, Hz) 6,37 d (1H; 2,0) 3,86 s (3H) 3,86 s (3H) 6,69 s (1H) 122,42 111,35 145,88 156,44 115,78 121,55 100,80 74,06 76,39 69,85 75,84 66,89 100,80 70,38 70,60 71,80 68,23 17,74 Chuyên Đề Dược δC 156,69 133,80 177,52 160,86 97,91 55,61 56,06 165,13 92,23 156,39 104,99 Ombuosid(5) δH, m, (J, Hz) 6,37 d (1H; 2,0) 6,69 d (1H; 2,0) 122,41 7,54 s (1H) 7,04 d (1H; 8,4) 7,73 d (2H; 8,8) 5,39 d (1H; 6,4) 3,25 s (1H) 3,16 s (1H) 3,27 s (1H) 3,33 s (1H) 4,39 d (1H; 1,0) 3,39 s (1H) 3,28 s (1H) 3,08 s (1H) 3,266 s (1H) 0,97 d (3H; 6,0) 115,78 145,84 150,12 111,34 121,50 101,15 74,03 76,37 69,84 75,82 66,85 100,74 70,33 70,57 71,79 68,20 17,67 7,55 d (1H; 2,0) 7,05 d (1H; 8,5) 7,74 dd (2H; 8,5; 2,0) 5,40 d (1H; 7,5) 3,24 s (1H) 3,24 s (1H) 3,11 s (1H) 3,27 s (1H) 3,34 s (1H) 4,40 d (1H; 1,0) 3,42 s (1H) 3,30 s (1H) 3,09 s (1H) 3,28 s (1H) 0,98 d (3H; 6,5) Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 Hình 2: Cấu trúc hóa học ombuosid F chất rắn vơ định hình màu vàng, tan methanol, ethyl acetat SKLM hệ dung môi EtOAc-MeOH-H2O (100:17:13) cho vết tắt quang UV 254 nm, phát thuốc thử FeCl3 10% (TT) xuất vết màu xanh rêu nhạt với Rf = 0,31 Sau kiểm tra đạt độ tinh khiết SKLM với hệ dung mơi có độ phân cực chất khác nhau, F gửi đo phổ NMR xác định cấu trúc Phổ 1H-NMR chất F xuất tín hiệu proton vòng thơm δH (ppm): 6,37 (1H; d; J = 2,0 Hz; H-6); 6,69 (1H; d; J = 2,0 Hz; H-8); 7,54 (1H; d; J = 2,0 Hz; H-2’); 7,04 (1H; d; J = 8,4 Hz; H-5’); 7,73 (2H; d; J = 8,8 Hz; H-6’) Sự xuất tín hiệu đơn vị đường khẳng định tín hiệu proton anomer δH (ppm): 5,39 (1H; d; J = 6,4 Hz; H-1’’) 4,39 (1H; d; J = 1,0 Hz; H-1’’’) Căn giá trị số ghép (J) proton anomer xuất tín hiệu nhóm oxymethylen nhóm methyl 3,33 (1H; s; H-6”) 0,97 (3H; d; J = 6,0 Hz; H-6’’’) cho phép dự đoán xuất phân tử đường β – D – glucopyranose đường α – L – rhamnose Phổ 13C-NMR chất F xuất 29 tín hiệu, tương ứng với 29 carbon bao gồm 15 carbon methin, carbon methylen, carbon methyl 10 carbon bậc Kết đối chiếu phổ NMR chất F với chất dự đốn cơng bố phổ NMR theo tài liệu tham khảo(5,6), chất F nhận định ombuosid (C29H34O16): 4ʹ,7-di-O-methylquercetin3-O-rutinosid 10 Hoạt tính chống oxy hố hợp chất phân lập Hợp chất ombuosid phân lập từ cao ethyl acetat đánh giá hoạt tính chống oxy hóa phương pháp quét gốc tự DPPH Hình 3: Giá trị IC50 hoạt tính quét gốc tự DPPH ombuosid so với Vitamin C Ombuosid thể hoạt tính đánh bắt gốc tự DPPH, với IC50 167,31 g/ml BÀNLUẬN Đề tài sơ đánh giá hoạt tính chống oxy hóa cao phân đoạn chất tinh khiết sau phân lập phần mặt đất VCLN phương pháp quét gốc tự DPPH Phương pháp cho phép thăm dò tác dụng chống oxy hóa mẫu nghiên cứu bước đầu cách nhanh chóng Từ cao ethyl acetat phần mặt đất Viễn chí nhỏ, sử dụng kỹ thuật sắc ký cột silica gel với hệ dung mơi rửa giải có độ phân cực tăng dần, kết hợp với kỹ thuật phổ, đề tài phân lập xác định cấu trúc hợp chất ombuosid Ombuosid dẫn xuất dimethoxyrutin rutin, thể hoạt tính Chuyên Đề Dược Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 đánh bắt gốc tự DPPH thấp so với cao ethyl acetat vitamin C, hoạt tính khơng cao điều góp phần vai trò định hướng đáp ứng chống oxy hóa phân đoạn ethyl acetat nói riêng phần mặt đất VCLN nói chung KẾT LUẬN Từ cao ethyl acetat có hoạt tính chống oxy hóa, sử dụng kỹ thuật sắc ký cột pha thuận, kết hợp kỹ thuật phổ học, đề tài phân lập xác định cấu trúc hợp chất: 4ʹ,7-di-Omethylquercetin-3-O-rutinosid (ombuosid), lần hợp chất ombuosid công bố phân lập từ VCLN (Polygala paniculata L.) thu hái Lâm Đồng TÀI LIỆU THAM KHẢO Da Rocha Lapa F, Setim Freitas C, Hatsuko Baggio C, et al (2007) Gastroprotective activity of the hydroalcoholic extract obtained from Polygala paniculata L in rats Journal of Pharmacy and Pharmacology, 59: pp.1413 – 1419 Da R Lapa F, Gadotti VM, et al (2009) Antinociceptive Properties of the Hydroalcoholic Extract and the Flavonoid Rutin Obtained from Polygala paniculata L in Mic Nordic Chuyên Đề Dược Nghiên cứu Y học Pharmacological Society Basic & Clinical Pharmacology & Toxicology, 104: pp.306 – 315 Farina M, Franco JL, Ribas CM, et al (2005) Protective effects of Polygala paniculata extract against methylmercury-induced neurotoxicity in mice J Pharm Pharmacol, 57: pp.1503-1508 Nguyễn Thị Thu Hương (2010) Nghiên cứu tác dụng chống oxy hóa theo hướng bảo vệ gan nấm Linh chi đỏ Ganoderma lucidum Chuyên đề Dược, Y học TP Hồ Chí Minh, phụ 14(2): tr.131-132 Phạm Thanh Kỳ, Thân Thị Kiều My, Phan Văn Kiệm (2010) Phân lập xác định cấu trúc rutin ombuosid từ Giảo cổ lam Tạp chí Dược liệu, 15(3): tr.168 -171 Rao MS, Raman NV (2003) A novel flavonoid from Polygala chinensis Biochemical Systematics and Ecology, 32: pp.447 – 448 Tsimogiannis DI, Oreopoulou V (2006) The contribution of flavonoid C-ring on the DPPH free radical scavenging efficiency A kinetic approach for the 3′,4′-hydroxy substituted members Innovative Food Science & Emerging Technologies, 7: pp.140 – 146 Wang BS, Li BS, Zeng QX, Liu HX (2008) Antioxidant and free radical scavenging activities of pigments extracted from molasses alcohol wastewater Food Chemistry, 107(3): pp.1198–1204 Ngày nhận báo: 18/10/2018 Ngày phản biện nhận xét báo: 01/11/2018 Ngày báo đăng: 15/03/2019 11 ... Tác dụng chống oxy hóa phân đoạn cao từ phần mặt đất VCLN Trong thử nghiệm DPPH, mẫu thử tác dụng với DPPH làm giảm màu chứng tỏ cao phân đoạn Viễn chí nhỏ có chứa nhóm hợp chất chống oxy hóa Dựa... hoạt tính quét gốc tự DPPH cao chiết Phân lập hợp chất từ phân đoạn cao ethyl acetat Dựa kết thử nghiệm hoạt tính chống oxy hóa, cao ethyl acetat tiếp tục nghiên cứu để phân lập chất 90 g cao phân. .. 4ʹ,7-di-O-methylquercetin3-O-rutinosid 10 Hoạt tính chống oxy hố hợp chất phân lập Hợp chất ombuosid phân lập từ cao ethyl acetat đánh giá hoạt tính chống oxy hóa phương pháp qt gốc tự DPPH Hình 3: Giá trị IC50 hoạt tính quét