Đang tải... (xem toàn văn)
Cao chiết hoa đậu biếc (Clitoria ternatea) thu được bằng cách trích ly trong 2 loại dung môi là ethanol 60% và methanol 50%; các cao phân đoạn được rửa giải bằng hệ dung môi hexane: ethyl acetate có độ phân cực tăng dần. Kết quả nghiên cứu đã xác định được hiệu suất trích ly cao tổng ethanol lớn hơn so với cao tổng methanol lần lượt là 17,01% và 15,22%, so sánh với nguyên liệu.
Vietnam J Agri Sci 2022, Vol 20, No 4: 417-424 Tạp chí Khoa học Nơng nghiệp Việt Nam 2022, 20(4): 417-424 www.vnua.edu.vn XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG FLAVONOID TỔNG, ANTHOCYANIN TỔNG VÀ HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HĨA CỦA CÁC PHÂN ĐOẠN CAO CHIẾT HOA ĐẬU BIẾC (Clitoria ternatea) Trương Văn Xạ*, Trần Kim Thoa, Nguyễn Thị Huỳnh Như Trường Đại học Sư phạm Kỹ thuật Vĩnh Long * Tác giả liên hệ: xatv@vlute.edu.vn Ngày nhận bài: 03.08.2021 Ngày chấp nhận đăng: 01.03.2022 TÓM TẮT Cao chiết hoa đậu biếc (Clitoria ternatea) thu cách trích ly loại dung môi ethanol 60% methanol 50%; cao phân đoạn rửa giải hệ dung môi hexane: ethyl acetate có độ phân cực tăng dần Kết nghiên cứu xác định hiệu suất trích ly cao tổng ethanol lớn so với cao tổng methanol 17,01% 15,22%, so sánh với nguyên liệu Hàm lượng flavonoid tổng phân đoạn cao chiết methanol 621,43 ± 2,33mg QE/g cao chiết anthocyanin tổng phân đoạn cao chiết ethanol 119,58 ± 1,19 mg/g cao chiết lớn Hoạt tính chống oxy hóa cao chiết phân đoạn hoa đậu biếc khảo sát thông qua khả khử H2O2 gốc tự DPPH Trong đó, giá trị IC50 cao phân đoạn methanol 166,29 ± 2,53 µg/ml, có khả khử H2O2 mạnh so với axit ascorbic 176,23 ± 3,21 µg/ml; giá trị IC50 cao phân đoạn methanol 589,27 ± 4,09 µg/ml 412,34 ± 2,91 µg/ml khả khử DPPH mạnh so với axit ascorbic 656,23 ± 3,44 µg/ml Như vậy, cao phân đoạn với dung dung môi rửa giải ethyl acetate thích hợp để tách chiết hợp chất thực vật từ hoa đậu biếc có khả chống oxy hóa mạnh Sản phẩm cao chiết hoa đậu sử dụng chế độ ăn kiêng với khả làm giảm stress oxy hóa Từ khóa: Anthocyanin tổng, cao chiết, đậu biếc, chống oxy hóa, flavonoid tổng Determination of Total Flavonoid, Anthocyanin Content and Antioxidant Activity of the Fractions Extract from Butterfly Pea (Clitoria Ternatea) Flowers ABSTRACT The extract from butterfly pea (Clitoria ternatea) flowers was done in ethanol 60% and methanol 50% and its fractions were eluted by hexane:ethyl acetate with increasing polarity Total efficiency of flower extraction in ethanol (17.01%) was higher than total extraction of the flowers in methanol (15.22%) Fraction of the flowers extracted in methanol showed the highest total flavonoid content (621.43 ± 2.33mg QE/g extract) The highest total anthocyanin content in fraction extracted in ethanol was 119.58 ± 1.19mg QE/g extract The antioxidant activities of extract from butterfly pea flowers were investigated through its ability to reduce H 2O2 and free radical DPPH The IC50 value in high fraction of the extract in methanol was 166.29 ± 2.53 µg/ml and its ability to reduce H2O2 was stronger than that of ascorbic acid at 176.23 ± 3.21 µg/ml The IC50 value in high fraction and of the flower extract in methanol was 589.27 ± 4.09 and 412.34 ± 2.91 µg/ml, respectively and all of these was able to deoxidize DPPH stronger than that of ascorbic acid at 656.23 ± 3.44 µg/ml Thus, high fraction with ethyl acetate eluent was suitable for the extraction of plant compounds from butterfly pea flowers with the strongest antioxidant activities Furthermore, it is suggested that Clitoria ternatea can be used in dietary applications with a the potential to reduce oxidative stresses Keywords: Antioxidant activity, Clitoria ternatea, extract, total anthocyanin, total flavonoid T VN Stress oxy húa l s mỗt cõn bỡng gia vic sõn xuỗt cỏc gc t v hoọt ng ca cỏc chỗt chng oxy hũa thể Stress oxy hóa nguyên nhân nhiều loäi bệnh têt nguy hiểm ung thư, rối loän thổn kinh, tởng huyt ỏp, ri loọn hụ hỗp, x vữa động 417 Xác định hàm lượng flavonoid tổng, anthocyanin tổng hoạt tính chống oxy hóa phân đoạn cao chiết hoa đậu biếc (Clitoria ternatea) mäch, viêm lt dä dày, thối hóa khớp (Bakhtiar & cs., 2017) Hiện nay, có nhiều nghiên cứu sử dụng dðch chiết thc vờt nh l chỗt chng oxy húa t nhiờn như: dðch chiết Có tranh (Imperata cylindrica) (Parvathy & cs., 2011; Võ Thð Kiều Ngân & cs., 2017); bổu ỗt (Gynura procumbens (Lour.) Merr (Rosidah & cs., 2008; Phäm Thð Kim Quyên & cs., 2016); Môn ngứa (Colocasia esculenta) (Pritha & cs., 2015; Nguyễn Vën Bën & cs., 2018); Đinh lëng (Syzygium aromaticum) (Nguyễn Thð Dung & cs., 2019); rễ Me keo (Pithecellobium dulce (ROXB) BENTH) (Katekhaye & Kale, 2012; Nguyễn Thð Ái Lan & cs., 2019); Bình bát nước (Annona glabra L.) (Huỳnh Thanh Duy & cs., 2020) Hp chỗt sinh hc th cỗp c tỡm thỗy cỏc loi thc vờt l ngun dược liệu q có tác dụng phịng chữa bệnh (Kasote & cs , 2015; Lumlerdkij & cs., 2018) Flavonoid l mt nhúm cỏc hp chỗt phenolic cú hoọt tớnh chống oxy hóa có lội thực phèm đặc biệt trái rau quâ với tác dụng giâm nguy míc bệnh mãn tính (Pandey & Agnihotri, 2015) Anthocyanin l hp chỗt mu t nhiờn cú tác dụng chống ung thư (Ding & cs., 2006), ngën ngừa bệnh tim mäch xơ vữa động mäch (Bell & Gochnaur, 2006), bệnh đái tháo đường, phòng ngừa bệnh tác nhân oxy hóa gây nên (Martin & cs., 2017) Cåy hoa đêu biếc (Clitoria ternatean) loài thân thâo sống låu nëm, thuộc họ đêu phỏt trin tt ỗt ốm, trung tớnh (Karel & cs., 2018) Hoa đêu biếc có hai lội đơn kép, hoa có màu xanh tím xanh lam đêm đơi cịn có màu tríng (Bishoyi & Geetha, 2012) Trong hoa ờu bic cú cha cỏc hp chỗt thc vờt th cỗp nh flavonoid, alkaloid, tannin, terpenoid, glycoside, phenolic acid anthocyanin (Rai, 2010; Pendbhaje, 2011; Kavitha & Premalakshmi, 2013) Täi Ấn Độ, hoa đêu biếc sử dụng loäi dược liệu để điều trð loäi bệnh ph bin nh tởng huyt ỏp, ri loọn hụ hỗp, xơ vữa động mäch, viêm loét dä dày (Chauhan & cs., 2012; Bakhtiar & cs., 2017) Hiện nay, hoa đêu biếc sử dung để làm màu thực phèm, làm trà uống giâi nhiệt, 418 chỵ thð màu hàn the thực phèm Nghiên cứu sử dụng dung môi rửa giâi hexane: ethyl acetate cò độ phân cực tëng dỉn nhìm ly trích flavonoid tổng anthocyanin tổng cao chiết hoa đêu biếc; đồng thời khâo sát khâ nëng chống oxy hóa phån độn Mục tiêu nghiên cứu nhìm xác đðnh hàm lượng flavonoid tổng anthocyanin tổng khâ nëng chống oxy hóa phân độn cao chiết hoa đêu biếc thông qua phương pháp: khâ nëng khử gốc tự DPPH H2O2 Sân phèm cao chiết hoa đêu biếc nguồn nguyên liệu tự nhiên tiềm nëng cò thể sử dụng chế độ ën kiêng với khâ nëng làm giâm stress oxy hóa PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu Hoa đêu biếc đươc thu hái thành phố Vïnh Long từ 7-8 sáng vên chuyển phịng thí nghiệm, rửa säch qua nước máy để tiến hành điều chế cao chiết Húa chỗt: Cỏc húa chỗt cổn thit cho nghiờn cu bao gồm: Ethanol (Việt Nam), hexane (Việt Nam), ethyl acetate (Việt Nam), methanol (Việt Nam), Na2SO4 khan (Trung Quốc), quercetin (Trung Quốc), H2O2 30% (Trung Quốc), axit ascorbic (Trung Quốc) v mt s húa chỗt khỏc 2.2 Phng phỏp nghiờn cứu 2.2.1 Tách chiết cao tổng cao phân đoạn Thí nghiệm bố trí lỉn lặp läi, với dung mơi ethanol 60% methanol 50% (tỵ lệ 1:1 w/v) Dðch chiết thu nhên sau 24 giờ, trình lặp läi đến chiết kiệt nguyên liệu (khi cỏnh hoa b mỗt mu tớm hon ton v chuyn sang màu vàng nhät) Méu dðch chiết lọc qua Na2SO4 khan Méu dðch chiết làm giàu bìng hệ thống cô quay chân không nhiệt độ 45C, áp suỗt 0,095atm v tc quay 110 vũng/phỳt (H thng gồm: máy quay WEV-1010, bể điều nhiệt tn hồn länh MaXircu CL-12 bơm chån khơng WEV-0095) Sau đị, mộu c sỗy i lu (t sỗy DS-80) nhit độ 45C 48 Trương Văn Xạ, Trần Kim Thoa, Nguyễn Thị Huỳnh Như Bâng Bố trí thí nghiệm tách chiết cao phân đoạn hoa đậu biếc Nghiệm thức Ký hiệu Hệ dung môi rửa giải Tỷ lệ Cao tổng ethanol CT-E Ethanol 60% 1:1 (w/v) Cao phân đoạn ethanol E-H1 Hexane: Ethyl acetate 10:0 (v/v) Cao phân đoạn ethanol E-H2 Hexane: Ethyl acetate 5:5 (v/v) Cao phân đoạn ethanol E-H3 Hexane: Ethyl acetate 0:10 (v/v) Cao tổng methanol CT-M Methanol 50% 1:1 (w/v) Cao phân đoạn methanol M-H1 Hexane: Ethyl acetate 10:0 (v/v) Cao phân đoạn methanol M-H2 Hexane: Ethyl acetate 5:5 (v/v) Cao phân đoạn methanol M-H3 Hexane: Ethyl acetate 0:10 (v/v) Cao phån độn thu bìng cách trích ly cao tổng ethanol (CT-E) cao tổng methanol (CT-M) với lội dung mơi hexane ethyl acetate cị độ phân cực tëng dæn theo bâng Các cao phån độn tương ứng tiến hành quay chân khụng v sỗy nhit 45C n bay hết dung môi Các sân phèm cao tổng cao phån độn trữ tủ đơng -20C bìng cách o quang ph hỗp th bc súng 520 v 700nm (Wrolstand, 1993; Giusti & cs., 1999; Lee & cs., 2005) Hàm lượng anthocyanin tính theo cyanidin-3-glucoside tương đương Anthocyanin tổng (mg/g cao chiết) = [(A × Mw × DF)/ ( × l)] × (V/m) × 103 2.2.2 Xác định flavonoid tổng Mw: khối lượng phân tử = 449,2 g/mol cho cyanidin-3-glucoside; Đðnh lượng flavonoid tổng thực theo phương pháp Chang & cs (2002) có điều chỵnh Đường chn quercetin với dãy nồng độ 25, 50, 100, 200, 400 µm/ml chuèn bð methanol Hỗn hợp phân ứng gồm 0,5ml méu cao chiết 1,5ml methanol để ổn đðnh phút Sau đò, thêm 0,1ml AlCl3 10% cho phân ứng phút Cuối cùng, thêm 0,1ml CH3COOK 1M 2,8ml nước cỗt, lớc u v n nh 45 phỳt nhiệt độ phịng Méu thí nghiệm tiến hành o quang ph hỗp th tọi 415nm Hm lng flavonoid tổng méu cao chiết tính dựa vào đường chuèn quercetin (QE) theo công thức sau: Flavonoid tổng (mg QE/g cao chiết) = c×V m Trong đị: c hàm lượng flavonoid tổng suy từ đường chuèn quercetin (µm/ml), V thể tích dðch chiết (ml), m khối lượng cao chiết có V (g) 2.2.3 Xác định anthocyanin tổng Hàm lượng anthocyanin tổng xác đðnh theo phương pháp pH vi sai pH pH 4,5 Trong đò: A = (A520nm - A700nm)pH 1.0 - (A520nm A700nm)pH 4.5; DF: hệ số pha loãng méu; l: chiều dày cuvett (1cm); : hệ số hỗp th phõn t ca anthocyanins ( = 26.900); V: tổng thể tích méu chiết (ml); m: khối lượng cao chiết (g) 2.2.4 Khâo sát hoạt tính khử hydrogen peroxide (H2O2) Thí nghiệm xác đðnh hoat tính khử H2O2 cao chiết tiến hành theo phương pháp Rahate & cs (2013) cị điều chỵnh Đường chn phỉn trëm ức chế H2O2 axit ascorbic với dãy nồng độ 50; 100; 150; 200; 250 µg/ml pha methanol; với giá trð x = IC50 axit ascorbic mà täi đò ức chế 50% H2O2 (y = 50%) Hỗn hợp phân ứng gồm 2ml dung dðch cao chiết nồng độ tương ứng 50; 100; 150; 200; 250 µg/ml pha methanol 1ml H2O2 4mm, cho phân ứng 20 phút nhiệt độ phđng, sau đị đo hỗp ph quang ph bc súng 230nm i với méu đối chứng 1ml H2O2 thay bìng 1ml methanol 419 Xác định hàm lượng flavonoid tổng, anthocyanin tổng hoạt tính chống oxy hóa phân đoạn cao chiết hoa đậu biếc (Clitoria ternatea) Xác đðnh phæn trëm ức chế H2O2 (%) = A0 – A ì 100 A0 Trong ũ: A0 l giỏ tr hỗp th mộu i chng, A l giỏ tr hỗp th méu có H2O2 2.2.5 Khâo sát khâ khử gốc tự 2,2’- diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) Khâ nëng khử gốc tự DPPH dðch cao chiết tiến hành theo phương pháp Blois (1958) cị điều chỵnh Hỗn hợp phân ứng gồm ml dung dðch cao chiết nồng độ tương ứng 100; 250; 500; 750; 1.000 µg/ml pha methanol 1ml DPPH 0,1mm, líc ủ tối 30 phút nhiệt độ phñng, sau ũ o hỗp ph quang ph Mộu thớ nghim c tin hnh o quang ph hỗp th tọi 517nm Méu đối chứng 1ml DPPH thay bìng 1ml methanol Xác đðnh khử gốc tự DPPH (%) = A0 – A × 100 A0 Trong đị: A0 l giỏ tr hỗp th mộu i chng, A l giỏ tr hỗp th ca mộu cú DPPH Giỏ tr IC50 nồng độ dðch chiết cho khâ nëng khử gốc tự DPPH 50% 2.2.6 Phân tích xử lý số liệu Kết quâ thực nghiệm nhêp liệu bìng Microsoft Excel 2016 phân tích thống kê bìng phỉn mềm SPSS 16.0 Mỗi thí nghiệm bố trí ba lỉn lặp läi Phån tích phương sai ANOVA theo hai nhân tố với phép thử Duncan để xác đðnh so sánh giá trð trung bình KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Xác định khối lượng cao chiết Kết quâ nghiên cứu xác đðnh khối lượng cao tổng ethanol tách chiết từ 1.000g hoa đêu biếc tươi 170,62 ± 5,21g; cao tng methanol l 152,16 3,74g; hiu suỗt trớch ly cao tổng ethanol cao so với methanol læn lượt 17,01% 15,22% (Bâng 2) Theo Zhang (2015), dung mơi cị độ phân cực khác chit xuỗt hp chỗt t thc vờt khỏc nhau; đị độ phân cực methanol ethanol lỉn lượt 0,762 0,654 (Reichardt & Welton, 2010) Sử dụng lội cao tổng 120g để thực síc ký nhanh cột khơ Trong đị, khối lượng silica gel trộn méu 150g, khối lượng silica gel pha tïnh 300g, cột síc ký cị đường kính 8,5cm, chiều cao lớp silica gel 6cm, dung môi rửa giâi tương ng vi bõng Kt quõ thớ nghim cho thỗy, i vi cao tng ethanol thỡ hiu suỗt nhú nhỗt cao phân đoän (E-H1); cao tổng methanol phån độn (M-H3) Trong đị, phån đoän cao chiết ethanol (E-H2) methanol (M-H2) cú hiu suỗt trớch ly ln nhỗt lổn lt 15,23 ± 0,60% 16,43 ± 1,36% Như vêy, hỗn hợp dung mơi hexane: ethyl acetate (tỵ lệ 5:5 v/v) cho khõ nởng giõi c nhiu hp chỗt thực vêt từ nguồn cao tổng tương ứng nên hiệu suỗt thu hi ca phồn oọn ny luụn cao hn so với phån độn cịn läi Trong thí nghiệm sử dụng dung môi không phân cực (hexane), dung mụi cũ phõn cc thỗp (hexane:ethyl acetate) v dung mơi phân cực trung bình (ethyl acetate, ethanol) để rửa giõi cỏc hp chỗt thc vờt Theo Talla & cs (2014), mt s hp chỗt thc vờt thng cũ xu hướng lưỡng cực chúng có nhóm hydroxyl (OH) mäch carbon mäch carbon läi không phân cc, cú th thớ nhim ny cỏc hp chỗt thực vêt có mäch carbon khơng phân cực tham gia phân ứng với dung mơi cị độ phân cực thỗp, ũ hiu suỗt thu hi cao chit ca dung mơi ln cao dung mơi cđn läi Bâng Khối lượng cao chiết hiệu suất trích ly cao phân đoạn hoa đậu biếc Nghiệm thức CT-E E-H1 E-H2 E-H3 CT-M Cao chiết (g) 170,62 ± 5,21 7,16 ± 0,37 18,28 ± 0,72 10,87 ± 1,06 152,16 ± 3,74 9,72 ± 1,04 19,72 ± 1,65 9,23 ± 0,88 Hiệu suất (%) 17,01 ± 2,21 5,97 ± 0,31 15,23 ± 0,60 9,06 ± 0,88 15,22 ± 0,37 M-H1 M-H2 M-H3 8,10 ± 0,87 16,43 ± 1,36 7,69 ± 0,73 Ghi chú: CT-E: Cao tổng ethanol; E-H1, E-H2, E-H3: Cao phân đoạn 1, 2, ethanol; CT-M: Cao tổng methanol; M-H1, M-H2, M-H3: Cao phân đoạn 1, 2, methanol 420 Trương Văn Xạ, Trần Kim Thoa, Nguyễn Thị Huỳnh Như Bâng Hàm lượng flavonoid tổng anthocyanin tổng cao phân đoạn hoa đậu biếc Nghiệm thức Hàm lượng flavonoid tổng (mg QE/g cao chiết) Hàm lượng anthocyanin tổng (mg/g cao chiết) CT-E 332,20f ± 0,59 94,39c ± 0,76 E-H1 h 123,89 ± 1,19 23,98h ± 0,12 E-H2 499,19c ± 1,93 75,29e ± 1,02 E-H3 403,74e ± 3,10 119,58a ± 1,19 CT-M 423,60d ± 0,44 78,35d ± 0,89 M-H1 215,22g ± 0,53 34,79g ± 0,23 M-H2 a 621,43 ± 2,33 55,34f ± 1,22 M-H3 549,67b ± 1,44 98,92b ± 1,10 Ghi chú: Trên cột giá trị trung bình mang chữ giống khác có ý nghĩa thống kê (P