Nghiên cứu xác định hàm lượng anthocyanin và hoạt tính chống oxy hóa từ đậu đen (vigna cylindrica skeels) lên men bằng nấm mốc aspergillus oryzae

BỘ CÔNG THƢƠNG TRƢỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH NGUYỄN HUỲNH NI NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH HÀM LƢỢNG ANTHOCYANIN VÀ HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HĨA TỪ ĐẬU ĐEN (Vigna cylindrica Skeels) LÊN MEN BẰNG NẤM MỐC ASPERGILLUS ORYZAE Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM Mã chuyên ngành: 60540101 LUẬN VĂN THẠC SĨ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2019 BỘ CÔNG THƢƠNG TRƢỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH NGUYỄN HUỲNH NI NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH HÀM LƢỢNG ANTHOCYANIN VÀ HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA TỪ ĐẬU ĐEN (Vigna cylindrica Skeels) LÊN MEN BẰNG NẤM MỐC ASPERGILLUS ORYZAE Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM Mã chuyên ngành: 60540101 LUẬN VĂN THẠC SĨ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2019 Cơng trình đƣợc hồn thành Trƣờng Đại học Cơng nghiệp TP Hồ Chí Minh Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: (Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị chữ ký) Ngƣời phản iện 1: (Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị chữ ký) Ngƣời phản iện 2: (Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị chữ ký) Luận văn thạc sĩ đƣợc bảo vệ Hội đồng ch m ảo vệ Luận văn thạc sĩ Trƣờng Đại học Công nghiệp thành phố Hồ Chí Minh ngày tháng năm Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm: - Chủ tịch Hội đồng - Phản biện - Phản biện - Ủy viên - Thƣ ký (Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị Hội đồng chấm bảo vệ luận văn thạc sĩ) CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG VIỆN TRƢỞNG CÔNG NGHỆ SINH HỌC – THỰC PHẨM BỘ CÔNG THƢƠNG TRƢỜNG ĐẠI HỌC CƠNG NGHIỆP THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH CỘNG HỊA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự - Hạnh phúc NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ Họ tên học viên: Nguyễn Huỳnh Ni MSHV: 16003111 Ngày, tháng, năm sinh: 13/07/1990 Nơi sinh: Kiên Giang Chuyên ngành: Công nghệ thực phẩm Mã chuyên ngành: 60540101 I TÊN ĐỀ TÀI: ―Nghiên cứu xác định hàm lƣợng anthocyanin hoạt tính chống oxy hóa đậu đen (Vigna cylindrica Skeels) lên men n m mốc Aspergillus oryzae‖ NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG: Xác định hàm lƣợng anthocyanin hoạt tính chống oxy hóa đậu đen lên men n m mốc Aspergillus oryzae môi trƣờng đậu đen II NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: Theo Quyết định số 1838/QĐ-ĐHCN việc giao đề tài cử ngƣời hƣớng dẫn luận văn thạc sĩ Hiệu trƣởng trƣờng Đại học Công nghiệp TP HCM ngày 28 tháng 08 năm 2018 III NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ:28/8/2019 IV NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS TS Nguyễn Thị Minh Nguyệt Tp, Hồ Chí Minh, ngày NGƢỜI HƢỚNG DẪN tháng năm 2019 CHỦ NHIỆM BỘ MÔN ĐÀO TẠO PGS.TS Nguyễn Thị Minh Nguyệt VIỆN TRƢỞNG VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ THỰC PHẨM LỜI CẢM ƠN Trong thời gian thực công trình nghiên cứu tơi nhận đƣợc nhiều giúp đỡ, đóng góp ý kiến bảo chân tình Thầy Cơ, gia đình ằng nỗ lực thân, tơi hồn thành luận văn nghiên cứu Trƣớc hết, tơi xin phép bày tỏ lịng cảm ơn chân thành đến Cô Nguyễn Thị Minh Nguyệt tận tình hƣớng dẫn, truyền đạt kiến thức, kinh nghiệm q báu để giúp đỡ tơi q trình thực đề tài hồn thành luận văn Tơi xin chân thành gửi lời cảm ơn đến Ban Giám Hiệu trƣờng Đại học Cơng Nghiệp thành phố Hồ Chí Minh nói chung q thầy Viện Cơng nghệ Sinh học Thực phẩm nói riêng tạo điều kiện thuận lợi sở vật ch t nhƣ tận tình giảng dạy, truyền đạt cho tơi kiến thức chuyên ngành, kinh nghiệm quý báu suốt thời gian học tập thực dề tài Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Công ty Cổ phần Nosafood tạo điều kiện để tơi đƣợc hồn thành tốt thí nghiệm Phịng nghiên cứu phát triển sản phẩm công ty Để tỏ lịng biết ơn, tơi xin chúc thầy tồn thể giảng viên, cán cơng nhân viên trƣờng Đại học Cơng Nghiệp thành phố Hồ Chí Minh lời chúc sức khỏe đạt nhiều thành công cơng sống! i TĨM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ Anthocyanin vỏ đậu đen đƣợc sử dụng nhƣ ch t màu tự nhiên tạo nhiều màu sắc h p dẫn cho thực phẩm an tồn thay cho ch t màu tổng hợp với khả chống oxy hóa cao, anthocyanin đƣợc sử dụng để bảo quản thực phẩm, kháng khuẩn, kháng n m, chống oxy hóa cho thực phẩm Tuy nhiên anthocyanin dễ bị ảnh hƣởng nhiệt độ ánh sáng nên bị phân hủy trình chế biến Trong nghiên cứu này, qua trình xử lý nguyên liệu nhận th y hàm lƣợng anthocyanin đƣợc xử lý phƣơng pháp ngâm kéo dài (4 giờ) h p nhiệt độ 900C (PP1) hạn chế phân hủy anthocyanin so với phƣơng pháp ngâm đậu đen h p nhiệt độ 1100C (PP2) Hàm lƣợng anthocyanin PP1 đạt (1,069  0,019 mg/g CK) khác biệt có ý nghĩa so với PP2 (1,690  0,010 mg/g CK) Khả kháng oxy hóa tăng hàm lƣợng anthocyanin tăng Việc thay đổi điều kiện sơ chế đậu trƣớc lên men làm cải thiện hàm lƣợng hoạt tính anthocyanin, nhiên hàm lƣợng protein thay đổi không đáng kể không làm ảnh hƣởng thành phần dinh dƣỡng sản phẩm Từ khóa: Anthocyanins, Aspergillus oryzae, delphinidin -3-O, DPPH, đậu đen lên men ii ABSTRACT Anthocyanins in the skin of black bean are used as natural pigments to create attractive colors for food and can safely replace synthetic pigments with high antioxidant capacity Anthocyanins are used for food preservation, antibacterial, antifungal, and antioxidant for foods However, anthocyanins are susceptible to heat and light so they will decompose during processing In this study, the anthocyanin content treated by the long-term immersion method (4 hours) at 900C (PP1) was found to limit anthocyanin decomposition more than the hour by immersion method at 1100C (PP2) The anthocyanin content in PP1 (1.069  0.019 mg/g) different PP2 (1.690  0.010 mg/g) The antioxidant capacity also increases as anthocyanin content increases The change in fermentation conditions has improved anthocyanin content and activity, ut the protein content didn’t change significantly and didn’t affect the nutritional content of the product Keywords: Anthocyanins, aspergillus oryzae, delphinidin -3-O, DPPH, fermented black bean iii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu thân Các kết nghiên cứu kết luận luận văn trung thực, không chép từ b t kỳ nguồn dƣới b t kỳ hình thức Việc tham khảo nguồn tài liệu đƣợc thực trích dẫn ghi nguồn tài liệu tham khảo quy định Học viên Nguyễn Huỳnh Ni iv MỤC LỤC MỤC LỤC .v DANH MỤC HÌNH ẢNH vii DANH MỤC BẢNG BIỂU viii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT .ix Đặt v n đề Mục tiêu nghiên cứu Đối tƣợng phạm vi nghiên cứu Cách tiếp cận phƣơng pháp nghiên cứu Ý nghĩa đề tài CHƢƠNG TỔNG QUAN .4 1.1 Tổng quan đậu đen 1.1.1 Giá trị dinh dƣỡng đậu đen .5 1.1.2 Tổng quan anthocyanins .7 1.1.3 Các yếu tố ảnh hƣởng đến màu sắc độ bền màu anthocyanin 1.1.4 Anthocyanin với vai trò thực phẩm 13 1.2 Tổng quan n m mốc Aspergillus oryzae 14 1.3 Tổng quan lên men tƣơng hoisin .15 1.4 Một số nghiên cứu ứng dụng 17 CHƢƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.1 Phƣơng tiện nghiên cứu .20 2.1.1 Địa điểm thời gian 20 2.1.2 Dụng cụ thiết bị 20 2.1.3 Hóa ch t 20 2.1.4 Nguyên liệu nghiên cứu 21 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu .21 v 2.2.1 Chuẩn bị mẫu .21 2.2.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát .23 2.2.3 Phƣơng pháp phân tích đo đạc 25 2.2.4 Phƣơng pháp xử lý kết 30 2.2.5 Nội dung nghiên cứu 30 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 40 3.1 Kết khảo sát quy trình xử lý mẫu để tách chiết cao anthocyanin xác định anthocyanin tổng 40 3.1.1 Kết quy trình chiết tách anthyanin đậu đen nguyên liệu .40 3.1.2 Kết quy trình chiết tách anthocyanin đậu đen lên men 40 3.1.3 Kết khảo sát dung môi pha động, dựng đƣờng chuẩn để xác định hàm lƣợng delphinidin 3-0 glucose phƣơng pháp HPLC 41 3.1.4 Kết iện pháp xử lý ngun liệu để giảm th t hồn lƣợng anthocyanins .46 3.2 So sánh hàm lƣợng anthocyanin delphinidin phƣơng pháp lên men 47 3.3 Kết khảo sát khả kháng oxy hóa 48 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 52 Kết luận 52 Kiến nghị 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO 54 PHỤ LỤC .61 LÝ LỊCH TRÍCH NGANG CỦA HỌC VIÊN 74 vi 112, no 1, pp 226–231, 2009 [57] M C P de A Santiago et al ―Analytical standards production for the analysis of pomegranate anthocyanins y HPLC,‖ Brazilian Journal and Food Technology Vol 17, no 1, pp 51–57, 2014 [58] Z Huang et al ―Identification of anthocyanins in muscadine grapes with HPLC-ESI-MS,‖ LWT - Food Science and Technology Vol 42, no.4, pp 819–824, 2009 [59] E N Aquino-Bolaños et al ―Anthocyanin, polyphenol, and flavonoid contents and antioxidant activity in Mexican common bean (Phaseolus vulgaris L.) landraces,‖ Emirates Journal of Food and Agriculture, pp 581-588, 2016 [60] Phan Vĩnh Hƣng Nguyễn Thị Thêu ―Khảo sát ảnh hƣởng chế độ nƣớng đến hàm lƣợng anthocyanin q trình sản xu t," Tạp chí Khoa học công nghệ Thực phẩm Số 11, tr 32-36, 2017 60 PHỤ LỤC Phụ Lục : Các phƣơng pháp xác định đặc tính nguyên liệu Xác định độ ẩm : dùng cân s y ẩm MB25 Đối với cân s y ẩm MB25, sau cắm điện khởi động nguồn, lắp đĩa cân cho mẫu vào.Đợi đến ổn định máy hiển thị kết quả.Thực lần để l y giá trị trung bình Xác định pH Sau dùng dung dịch đệm để hiệu chỉnh pH, cắm điện cực máy vào dung dịch cần đo, đợi đến ổn định đọc kết Thực lần để l y giá trị trung bình Phụ lục : Kết trình tách cao mẫu Kết thu hồi cao tổng nguyên liệu đậu đen (Mẫu 1) Sau chuẩn i mẫu theo quy trình 2.4, ứng với khối lƣợng gam đậu đen nguyên liệu lƣợng cao thu đƣợc đem cân đƣợc trình ày ảng 2.1 từ lƣợng cao thu đƣợc tiếp tục cân cân 0,1 gam cao (cân phân tích số lẻ Sartorius) để pha loãng nhiều lần ằng Methanol thu đƣợc dãy pha loãng nồng độ nhƣ hình PL2.1 Hình PL2.1 Cao đậu đen pha loãng để khảo sát 61 Bảng PL2.1 Khối lƣợng cao thu đƣợc khối lƣợng cao pha loãng để xác định hàm lƣợng STT Khối lƣợng mẫu (g) Khối lƣợng cao (g) 2,4132 2,7351 2,3695 ̅ SD 2,5059 0,0398 Khối lƣợng cao đậu đen: 2,5095±0,0398 (g) Kết thu hồi cao tổng nguyên liệu tƣơng theo PP1 (Mẫu 2) Để trình trích ly flavonoids đạt đƣợc hiệu cao, việc dùng dung mơi hexane loại ỏ ch t éo có nguyên liệu tƣơng hoisin cần thiết Mẫu đƣợc xử lý học, sau đƣợc trích ly lỏng – lỏng với dung môi hexane dung môi etyl acetate theo sơ đồ đƣợc trình ày 2.2.5.2 Kết sau q trình trích ly lỏng – lỏng với dung môi etyl acetate đƣợc thể ảng 2.2 Bảng PL2.2 Kết tách cao etyl acetate từ đậu đen lên men.* STT Khối lƣợng mẫu (g) Khối lƣợng cao (g) 500,67 2,2298 500,58 2,1644 500,42 2,1913 ̅ SD 2,1952 0,0329 Khối lƣợng cao etyl acetate: 2,1952±0,0329 (g) Kết thu hồi cao tổng nguyên liệu tƣơng theo PP2 (Mẫu 3) 62 Mẫu đƣợc xử lý theo sơ đồ đƣợc trình ày 2.2.5.2 thu đƣợc ghi nhận kết ảng 2.3 Bảng PL2.3 Kết tách cao etyl acetate từ đậu đen lên men.* STT Khối lƣợng mẫu (g) Khối lƣợng cao (g) 500,19 2,2371 500,34 2,2152 500,12 2,1431 ̅ SD 2,1984 0,002 Khối lƣợng cao etyl acetate: 2,1984±0,002 (g) Phụ lục 3: Sắc ký đồ khảo sát hệ dung môi pha động điều kiện chạy HPLC Hình PL3.1 Sắc ký đồ delphinidin-3-O-glucose chạy theo hệ 95:5 (axit formic 5%: acetonitril) 63 Hình PL3.2 Sắc ký đồ delphinidin-3-O-glucose chạy theo hệ 80:20 (axit formic 5%: acetonitril) Hình PL3.3 Sắc ký đồ delphinidin-3-O-glucose chạy theo hệ 85:15 (axit formic 5%: acetonitril) 64 Hình PL3.4 Sắc ký đồ delphinidin-3-O-glucose chạy theo hệ 90:10 (axit formic 5%: acetonitril) Hình PL3.5 Sắc ký đồ delphinidin-3-O-glucose 2.5 ppm chạy theo gradient (axit formic 5% - axit formic-methanol = 5:95) 65 Hình PL3.6 Sắc ký đồ delphinidin-3-O-glucose ppm chạy theo gradient (axit formic 5% - axit formic:methanol = 5:95) Hình PL3.7 Sắc ký đồ delphinidin-3-O-glucose 10 ppm chạy theo gradient (axit formic 5% - axit formic:methanol = 5:95) 66 Hình PL3.8 Sắc ký đồ delphinidin-3-O-glucose 25 ppm chạy theo gradient(axit formic 5% - axit formic:methanol = 5:95) Hình PL3.9 Sắc ký đồ delphinidin-3-O-glucose 100 ppm chạy theo gradient (axit formic 5% - axit formic:methanol = 5:95) 67 Phụ lục 4: Kết đƣờng chuẩn Hình PL4.2 Đường chuẩn delphinidin chloride dựng phương pháp HPLC Phụ lục 5: Kết thô thí nghiệm Độ ẩm Summary Statistics for A.Col_2 A.Col_1 Count Average Standard deviation M1 M2 M3 Total 10.5567 76.82 77.9367 55.1044 0.0378594 1.06226 0.700381 33.4204 3 ANOVA Table for A.Col_2 by A.Col_1 Source Sum of Squares Between groups 8932.14 Df Mean Square 4466.07 Within groups Total (Corr.) 0.540122 3.24073 8935.38 Multiple Range Tests for A.Col_2 by A.Col_1 Method: 95.0 percent LSD A.Col_1 Count Mean M1 M2 3 10.5567 76.82 M3 77.9367 F-Ratio 8268.63 Homogeneous Groups X X X 68 P-Value 0.0000 Delphinidin Summary Statistics for B.Col_2 B.Col_1 Count M1 M2 Average 0.194533 0.119267 Standard deviation 0.00285715 0.00128582 M3 Total 0.137833 0.150544 0.0025697 0.0340175 ANOVA Table for B.Col_2 by B.Col_1 Source Sum of Squares Between groups 0.00922468 Df Mean Square 0.00461234 Within groups Total (Corr.) 0.00000547333 0.00003284 0.00925752 F-Ratio 842.69 P-Value 0.0000 Multiple Range Tests for B.Col_2 by B.Col_1 Method: 95.0 percent LSD B.Col_1 Count Mean Homogeneous Groups M2 M3 3 0.119267 0.137833 X M1 0.194533 X X Anthocyanin Summary Statistics for C.Col_2 C.Col_1 Count M1 M2 M3 Total Average 4.22917 1.06933 1.69 2.3295 Standard deviation 0.155171 0.0186039 0.01 1.45199 ANOVA Table for C.Col_2 by C.Col_1 Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups Within groups 8.40857 0.00817472 1028.61 0.0000 16.8171 0.0490483 Total (Corr.) 16.8662 Multiple Range Tests for C.Col_2 by C.Col_1 Method: 95.0 percent LSD C.Col_1 Count Mean Homogeneous Groups M2 1.06933 X M3 1.69 M1 4.22917 X X 69 Protein Summary Statistics for Col_2 Col_1 Count Average Standard deviation M1 23.2267 0.748421 M2 5.10667 0.533042 M3 4.60333 0.339755 Total 10.9789 9.20147 ANOVA Table for Col_2 by Col_1 Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups Within groups 337.708 0.3199 1055.67 0.0000 675.416 1.9194 Total (Corr.) 677.336 Multiple Range Tests for Col_2 by Col_1 Method: 95.0 percent LSD Col_1 Count Mean Homogeneous Groups M3 4.60333 X M2 5.10667 X M1 23.2267 X Bảng trung bình kết pH vi sai pH = pH = 4,5 ABS max= 530 ABS 700 ABS max= 530 ABS 700 A kq(mg/g) Mâu 2.9471 0.0687 2.9543 0.1850 0.1091 10.0657 Mâu 2.9187 0.0699 2.9380 0.1338 0.0446 4.7293 Mâu 2.9194 0.0673 2.9236 0.1298 0.0583 5.2571 Mẫu 0.5942 0.1130 0.5478 0.2076 0.0482 2.6883 Mẫu 0.5995 0.1110 0.5788 0.1872 0.0555 2.9750 Mẫu 0.5984 0.1187 0.5792 0.1898 0.0519 2.8860 Mẫu 0.5959 0.1242 0.5638 0.1632 0.0711 3.7043 Mẫu 0.59385 0.1276 0.5998 0.1697 0.0362 1.8593 0.65001 0.1298 0.5821 0.1403 0.0784 4.6613 Mẫu KQTB 6.68 2.85 3.41 Bảng trung bình kết giá trị kháng oxy hóa Mẫu nguyên hạt Mẫu lên men PP1 Mẫu lên men PP2 Mẫu acid ascor ic NH 0,10 % DPPH 18.470.68 % DPPH 1.480.71 % DPPH 5.450.59 % DPPH 37.650.57 NH 0,20 NH 0,4 NH 0,6 NH 0,8 NH 1,0 25.660.70 43.22 53.8780 56.350.59 74.320.19 4.850.94 26.61 28.770.57 30.050.44 31.6733 8.6274 28.950.27 29.680.15 34.710.48 37.95 47.100.52 84.420.43 79.880.11 88.640.55 90.410.55 Mẫu 70 Bảng két kiểm nghiệm 71 72 73 LÝ LỊCH TRÍCH NGANG CỦA HỌC VIÊN I LÝ LỊCH SƠ LƢỢC: Họ tên: Nguyễn Huỳnh Ni Giới tính: Nữ Ngày, tháng, năm sinh: 13/7/1990 Nơi sinh: Kiên Giang Email: nguyen_huynhny@yahoo.com Điện thoại: 0909400772 II QUÁ TRÌNH ĐÀO TẠO: Từ 2008 – 2012: học đại học Cơng nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh - ngành công nghệ thực phẩm – trƣờng Đại học Công nghiệp TP HCM – 475A Điện Biên Phủ , Phƣờng 25, quận Bình Thạnh, TP HCM Từ 2016 – nay: học cao học ngành công nghệ thực phẩm – trƣờng Đại học Công nghiệp TP HCM – 12 Nguyễn Văn Bảo, Phƣờng 4, quận Gò V p, TP HCM III Q TRÌNH CƠNG TÁC CHUN MƠN: Thời gian 8/2013 – 6/2016 Nơi công tác Công việc đảm nhận Công ty cổ phần Nosafood QC Tp HCM, ngày tháng Năm 20 Ngƣời khai (Ký tên) 74 ... chống oxy hóa đậu đen (Vigna cylindrica Skeels) lên men nấm mốc Aspergillus oryzae? ?? đƣợc thực nhằm xác định hàm lƣợng anthocyanin hoạt tính chống oxy hóa đậu đen ngun liệu đậu đen qua lên men Mục... ? ?Nghiên cứu xác định hàm lƣợng anthocyanin hoạt tính chống oxy hóa đậu đen (Vigna cylindrica Skeels) lên men n m mốc Aspergillus oryzae? ?? NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG: Xác định hàm lƣợng anthocyanin hoạt. .. HỒ CHÍ MINH NGUYỄN HUỲNH NI NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH HÀM LƢỢNG ANTHOCYANIN VÀ HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HĨA TỪ ĐẬU ĐEN (Vigna cylindrica Skeels) LÊN MEN BẰNG NẤM MỐC ASPERGILLUS ORYZAE Chuyên ngành: CÔNG