Tiểu luận Chiết xuất và phân lập Capsaicin từ cây Ớt

Mục lục Mục lục Lời mở đầu ĐẠI CƯƠNG VỀ THỰC VẬT 1.1 Định danh dược liệu 1.2 Mô tả .3 1.3 Thành phần hóa học 1.4 Phân bố sinh thái 1.5 Tác dụng dược lý ớt 1.5.1 Y học cổ truyền: 1.5.2 Y học đại: PHẦN THỰC NGHIỆM .8 2.1 Phương pháp 1: Chiết xuất capsaicinoid toàn phần, sau phân lập tinh khiết hóa capsacin .8 2.1.1 Chiết xuất capsacinoid toàn phần: 2.1.2 Phân lập capsaicin từ capsaicinoid: 12 2.2 Phương pháp 2: Dùng sắc kí ngược dòng tốc độ cao để phân lập tinh khiết hóa chất capsaicinoid 12 2.2.1 Dụng cụ .12 2.2.2 Chuẩn bị cho trình chiết thô 14 2.2.3 Lựa chọn hệ thống dung môi 14 2.2.4 Chuẩn bị dung môi mẫu .15 2.2.5 Quá trình tách 15 2.2.6 Phân tích HPLC xác định cấu trúc phân đoạn HSCCC 15 2.2.7 Kết 15 KẾT LUẬN CHUNG 18 Các chế phẩm có chứa capsaicin .19 Tài liệu tham khảo 20 Báo cáo dược liệu Lời mở đầu Ớt loại tau quả, gia vị quen thuộc người dân, người trồng trọt thu hái từ lâu đời Ớt có nhiều chất dinh dưỡng dễ tiêu hóa đường, đạm, caroten (tiền vitamin A), chất khác vitamin C, B1, B2 Ớt có nguồn gốc vùng nhiệt đới Châu Mỹ, chủ yếu Nam Mỹ, sau tới Mêhicô, Goatêmala, Côlômbia Ớt vào Châu Âu khoảng kỹ XV đầu kỹ XVI, vào Châu Á kỹ XVIII, giới ớt trồng Châu Âu, Châu Á, Châu Mỹ Nước trồng ớt nhiều Ấn Độ, Brazin, Trung Quốc, Ớt " đặc sản" vùng nhiệt đới Ở nước ta ớt trồng kỹ XVIII, trồng ớt rộng rãi nước, chủ yếu vụ Xuân Hè, thời kỳ trồng ớt xuất mạnh từ 1986 - 1990, năm xuất 2000 ớt bột khô Đặc biệt ớt có nhiều chất cay gọi Capsaicin (C 12H7NO3), ankaloid có vị cay, thơm ngon chiếm từ 0,05 - 0,2% Chất cay dùng để chế biến thuốc, chữa bệnh, nước hoa, dùng y học, quốc phòng Tinh dầu ớt chiết để điều chế thuốc chống thấp khớp, rượu thuốc đỏ loại thuốc chống bệnh hoại huyết, ớt dùng làm thực phẩm (còn gọi ớt thực phẩm), làm thực ăn trộn (salat), nhồi thịt ớt cay chủ yếu làm gia vị, dễ chế biến sử dụng, ăn tươi, nấu chín, chế biến làm tương ớt, nước ớt muối chua, muối mặn, xay bột, ép nước ớt có màu sắc đẹp, trang điểm cho bữa ăn, làm tăng thêm phần hấp dẫn, ớt tham gia vào ngành công nghiệp chế biến đồ hộp Với mục đích góp phần nâng cao hiểu biết Dược liệu, nhóm chọn đề tài: “Chiết xuất phân lập Capsaicin từ Ớt” Chân thành cám ơn Thầy Bộ môn tạo hội cho có điều kiện để tìm hiểu mở rộng vốn kiến thức Trang Báo cáo dược liệu ĐẠI CƯƠNG VỀ THỰC VẬT 1.1 Định danh dược liệu Tên khoa học: Capsicum frutescens (L.) Bail Tên thường gọi: Ớt Tên khác: Lạt tiêu, Lạt tử, Ngưu giác tiêu, Hải tiêu Họ: Cà (Solanaceae) 1.2 Mô tả Cây ớt thuộc loại thân thảo, mọc hàng năm nước ôn đới, sống lâu năm thân phía hóa gỗ nước nhiệt đới Hình 1: Cây ớt Cây có nhiều cành, nhẵn Lá mọc so le, mềm, hình thuôn dài, đầu nhọn, phiến dài 2-4cm, rộng 1.52cm trắng, Hình Lá ớt mộc kẽ hoa gần quanh năm nhiều vào tháng 5-6 Trang Hoa màu mọc đơn lá, mùa Báo cáo dược liệu Qủa mọc rủ xuống hay quay lên trời (chỉ thiên), hình dáng thay đổi, có thứ tròn, có thứ dài, chín có màu đỏ, vàng hay tím Trong chứa nhiều hạt dẹt trắng Hình Hoa ớt Hình Quả ớt 1.3 Thành phần hóa học  Trong ớt có 0.04 – 1.5% dẫn chất benzylamin, vị cay, thành phần capsaicin (chiếm tới 70%), phần lớn tập trung biểu bì giá noãn, tán bột giá noãn, nhỏ giọt nước lên soi kính thấy tinh thể hình vuông capsaicin vị cay, pha loãng tới nồng độ 1/10 triệu cảm thấy vị cay  Ngoài ra, có số chất khác dihydrocapsaicin (khoảng 20%), nordihydro-capsaicin (7%), homocapsaicin homodihydrocapsaicin  Các chất carotenoid: chất capsaithin có màu đỏ; có Trang Báo cáo dược liệu capsorubin, krytoxanthin, zeaxanthin, lutein, α β carotene  Capsicosid saponin steroid có tác dụng kháng sinh  Flavonoid (apiin luteolin-7-glucozid)  Vitamin C, tỷ lệ chừng 0.8%-1.8% ớt ta (bộ môn dược liệu định lượng năm 1957) Có tác giả nghiên cứu ớt Châu Phi, Hungary thấy hàm lượng vitamin C lên tới 4.89%  Chất đường tới 7%  Ngoài có acid hữu acid citric, acid malic… 1.4 Phân bố sinh thái Cây ớt có nguồn gốc Nam Mĩ, bắt nguồn từ số loài hoang dại, hóa trồng Châu Âu, Ấn Độ cách 500 năm Christopher Columbus ﾧ người châu Âu thấy ớt (ở Caribe ﾧ), gọi chúng "tiêu" chúng có vị cay tương tự (không phải bề giống nhau) Ớt trồng khắp nơi giới sau thời Columbus Diego Álvarez Chanca ﾧ, thầy thuốc chuyến thứ hai Columbus đến Đông Ấn Độ năm 1493, mang hạt ớt Tây Ban Nha ﾧ, lần đầu viết tác dụng dược lý chúng vào năm 1494 Tuy nhiên nước ta chưa phát triển Tại nhiều nước Nhật Bản, Indonexia, Ấn Độ, Hungari người ta trồng hàng nghìn hecta, năm xuất cảng từ 2.500 đến 3000 ớt khô Hiện nay, Ấn Độ ﾧ nước sản xuất ớt lớn giới với khoảng triệu năm Được trồng khắp nơi Việt Nam Có mọc hoang, có lẽ nhà gần trồng trước sau bỏ nơi khác sống sót lại Ớt có biên độ thời vụ rộng, vùng chuyên canh gieo trồng vào thời vụ chính: - Vụ đông xuân: gieo hạt tháng 10-12, trồng tháng 12-2 - Vụ hè thu: gieo hạt tháng 6-7, trồng tháng 8-9 Điều kiện trồng: Nhiệt độ: ớt ưa nhiệt độ cao, sinh trưởng phát triển tốt 20-300C, nhiệt độ 150C hạt nảy mầm chậm Nhiệt độ thích hợp cho hạt nảy mầm 25-300C Nhiệt độ lớn 320C, sinh trưởng kém, tỷ lệ đậu thấp Nhiệt độ 100C 400C, hạt không nảy mầm Ánh sáng: ớt không bị ảnh hưởng thời gian chiếu sáng Vì ớt sống quanh năm, ưa ánh sáng, nên trời âm u làm hạn chế đậu Độ ẩm: ớt chịu hạn, giai đọan hoa, hình thành cần độ ẩm 70-80%, độ ẩm 70% giai đoạn thường bị cong sần sùi, giảm giá trị thương phẩm, ớt không chịu úng, độ ẩm đồng ruộng >80% rễ sinh trưởng kém, còi cọc Đất trồng: ớt không kén đất, nhiên tốt đất bãi hàng năm có phù sa đất thịt nhẹ có độ màu mỡ, thoát nước, có pH=5,5-7 Trồng đất xa nguồn nước thải, khu công nghiệp, nghĩa trang bệnh viện Trang Báo cáo dược liệu Chăm sóc: Trong điều kiện cho phép phủ nilông màu cho ruộng ớt (phủ trước trồng 4-5 ngày), phủ rơm sau trồng, phủ rơm nilông vừa giữ độ ẩm cho đất vừa hạn chế cỏ dại Tưới giữ ẩm cho sau trồng, sau trồng 20-25 ngày sới xáo bón thúc đợt sau 20 ngày sới sáo bón thúc đợt 2, nên bón thúc đạm vào giai đoạn bắt đầu phát triển Tỉa cành: Tuỳ thuộc vào giống sinh trưởng mà có chế độ tỉa cành cho thích hợp, thông thường nên để 3-4 cành/ cây, thường xuyên tỉa bỏ già Tưới tiêu: ớt chịu hạn sợ úng cần đảm bảo độ ẩm thích hợp cho sinh trưởng để đảm bảo suất nên tưới vào buổi trưa bắt đầu héo, đặc biệt cần tháo kiệt nước sau trời mưa 1.5 Tác dụng dược lý ớt 1.5.1 Y học cổ truyền: • • • cắn Ớt có vị cay, nóng Tác dụng khoan trung, tán hàn, kiện tỳ, tiêu thực, thống (giảm đau), kháng nham (chữa ung thư ) Nhân dân thường dùng để chữa đau bụng lạnh, tiêu hóa kém, đau khớp, dùng chữa rắn rết  Một số thuốc Nam thông dụng có ớt: - Chữa rụng tóc hóa trị liệu: Ớt trái 100g, ngâm với rượu trắng 10-20 ngày Dùng rượu bôi lên da đầu có tác dụng kích thích mọc tóc - Giảm đau ung thư, đau khớp: ăn 5-10g ớt ngày - Chữa ăn uống tiêu ung thư: ớt 100g, hắc đậu xị 100g, tán bột ăn hàng ngày - Chữa ăn uống chậm tiêu: ớt trái dùng làm gia vị, ăn hàng ngày - Chữa đau thắt ngực: ớt trái quả, đan sâm 20g, nghệ đen 20g Sắc uống ngày thang - Chữa đau dày lạnh: ớt trái 1-2 quả, Nghệ vàng 20g, tán bột uống ngày 2-3 lần - Chữa viêm khớp mãn tính: ớt trái 1-2 quả; Dây đau xương, thổ phục linh (củ khúc khắc) vị 30g Sắc uống ngày thang - Chữa bệnh chàm (eczema): ớt tươi nắm, mẻ chua thìa Hai thứ giã nhỏ, lấy vải gói lại, đắp lên nơi bị chàm rửa nước muối - Chữa tai biến mạch máu não: ớt (loại ớt thiên nhỏ) đem giã nhỏ, thêm nước muối, chắt nước cho người bệnh uống, bã đắp vào tỉnh - Chữa rắn rết cắn: ớt giã nhỏ, đắp vào nơi bị thương, băng lại Ngày làm 1-2 lần hết đau, 2-3 khỏi - Chữa bệnh vẩy nến: Lá ớt cay nắm to (1 nắm chặt tay đem chín không cháy), tinh tre đằng ngà cạo lấy bát, sống đời (lá thuốc bỏng) 7-9 lá, thiên niên kiện khoảng 300g Tất cho vào nồi với lít nước, đun sôi kỹ, uống dần thay nước chè, uống chừng ấm khỏi - Đau bụng kinh niên: Rễ ớt, rễ chanh, rễ hoàng lực, thứ khoảng 10g Sao vàng, sắc uống ngày thang - Chữa đau lưng, đau khớp: Ớt chín 15 quả, đu đủ cái, rễ thiên 80g Tất đem giã nhỏ ngâm cồn với tỷ lệ 1/2, dùng để xoa bóp mau khỏi Trang Báo cáo dược liệu - Chữa mụn nhọt: Lá ớt giã nát với muối, dùng đắp vào nhọt mưng mủ bớt đau nhức, dễ vỡ mủ, mau lành - Chữa khản cổ: Dùng ớt làm thuốc súc miệng (dưới dạng cồn thuốc) - Chữa rắn rết cắn: Lá ớt giã nhỏ, đắp vào vết thương hết đau nhức bỏ Ngày đắp 1-2 lần hết đau Thường 15-30 phút hết đau 1.5.2 Y học đại: Nghiên cứu y học đại thống với y học cổ truyền tác dụng chữa bệnh ớt Kết nghiên cứu nhà khoa học Trung Quốc cho thấy ớt có nhiều ích lợi cho sức khỏe Trong ớt có chứa số hoạt chất sau: Capsicain Alkaloid chiếm tỷ lệ khoảng 0,05-2%, hoạt chất gây đỏ, nóng, xuất ớt chín Một điều lý thú Capsaicin có tác dụng kích thích não sản xuất chất Endorphin, chất Morphin nội sinh, có đặc tính thuốc giảm đau, đặc biệt có ích cho bệnh nhân bị viêm khớp mạn tính bệnh ung thư Ngoài ra, ớt giúp ngăn ngừa bệnh tim chứa số hoạt chất giúp máu lưu thông tốt, tránh tình trạng đông vón tiểu cầu dễ gây tai biến tim mạch Ớt có tác dụng ngăn ngừa tình trạng huyết áp tăng cao Một số nghiên cứu cho thấy, loại ớt vỏ xanh, trái nhỏ có hàm lượng capsaicin nhiều Ngoài ra, ớt chứa nhiều loại vitamin vitamin C, B1, B2, acid citric, acid malic, beta caroten Trang Báo cáo dược liệu PHẦN THỰC NGHIỆM Chiết xuất capsaicinoid toàn phần, sau phân lập tinh khiết hóa capsacin 2.1 Phương pháp 1: 2.1.1 Chiết xuất capsacinoid toàn phần: Chuẩn bị: Trái ớt mua từ chợ dạng ớt khô Dược liệu đóng gói túi nhựa tẩy với nitơ, lưu trữ 40C trước sử dụng 2.1.1.1 Ngâm: 25g bột dược liệu ngấm kiệt với 200ml ethanol 95% (v/v) bình chứa dung tích 250ml Tiến hành 450C 15h 2.1.1.2 Chiết Soxhlet: Chuẩn bị dụng cụ chiết: Soxhlet dung tích 250ml: làm túi giấy lọc hình trụ có kích thước vừa với thân Soxhlet, đầu túi không thấp đầu ống dẫn dung môi (ống nhỏ) không cao lỗ thông ống dẫn dung môi (ống lớn) Cân khoảng 25g dược liệu Nghiền nhỏ dược liệu cối sứ, thêm cát trung tính để tăng độ xốp, dược liệu có độ ẩm cao nên nghiền với Na2SO4 khan Cho dược liệu nghiền nhỏ vào túi giấy, dùng gòn tẩm dung môi lau cối cho lên phía lớp dược liệu Phủ lên mặt dược liệu lớp giấy lọc ngăn không cho dược liệu lên rơi xuống bình chiết (có thể thêm vài viên bi thủy tinh dằn lên miếng giấy lọc) Lắp dụng cụ bếp cách thủy, dùng phễu rót ethanol 95% vào bình đựng dung dịch chiết (khoảng 200ml), lắp vào hệ thống sinh hàn Kiểm tra lần cuối toàn dụng cụ, nước sinh hàn Khống chế nhiệt độ 78.10C Đun bếp cách thủy 5h Thu dịch chiết 2.1.1.3 Chiết với hỗ trợ sóng siêu âm: Thử nghiệm tiến hành lần bồn siêu âm với tần số 35kHz với mức lượng 600W (Bandelin Sonorex Super RK 1050), nhiệt độ 45 0C 3h Bình chứa hình chữ nhật (50cm: 60cm: 20cm) phối hợp với bồn điều nhiệt (Polyscience 9610, USA) Erlen 250ml gồm 25g dược liệu với kích cỡ 3mm với dung môi (ethanol 95%) nhúng chìm vào bồn siêu âm kiểm soát theo mức nước khoảng 10mm từ đáy bồn Lưu ý, kích cỡ dược liệu đóng vai trò quan trọng trình chiết xuất 2.1.1.4i Kết bàn luận: Trang Báo cáo dược liệu • Hiệu thời gian chiết siêu âm Hiệu siêu âm thời gian chiết xuất việc thu hồi capsaicinoid thể hình Tốc độ chiết capsaicinoid cao thời gian phút Sau đó, việc thu hồi capsaicinoid tăng dần với thời gian chiết xuất Phương pháp Thời gian Nhiệt độ (0C) Dược liệu:dung môi Tỷ lệ phục hồi (%) Ngâm 15h 45.0 1:8 79.4 Soxhlet 5h 78.1 1:8 92.0 UAE 3h 45.0 1:8 87.4 UAE 3h 45.0 1:6 84.5 UAE 3h 45.0 1:5 84.3 Thu hồi Capsaicinoid UAE so với ngâm (15 h) Soxhlet (5 h) Phần trăm thu hồi capsaicinoid tương ứng ngâm, Soxhlet UAE 79,4, 92,0 87,4 UAE thu hồi 10% so với capsaicinoid so với phương pháp ngâm thấp khoảng 5% so với dùng Soxlet Chiết xuất Soxhlet cho việc thu hồi tỷ lệ capsaicinoid cao nhất, trình chiết xuất thực nhiệt độ sôi (78.10C) dung môi làm UAE cải thiện đáng kể sản lượng chiết xuất UAE đẩy nhanh trương nở hydrat hóa, gây mở rộng lỗ rỗng bên tế bào thực vật Sự phá vỡ tế bào thực vật siêu âm sau bọt hốc bị phá vỡ tăng tỷ lệ dung môi thâm nhập vào tế bào thực vật Tỷ lệ phóng thích capsaicinoid cao bắt đầu hiệu ứng gradient nồng độ capsaicinoid dung môi dược liệu dễ dàng để chiết xuất từ phần bên hạt giai đoạn sớm Sau tỷ lệ phóng thích capsaicinoid giảm đáng kể gradient nồng độ thấp capsaicinoid lại nằm phần bên • Hiệu nhiệt độ chiết xuất Trang Báo cáo dược liệu Hiệu nhiệt độ phóng thích capsaicinoid chiết xuất 95% ethanol acetone làm dung môi hiển thị tương ứng Fig Khi dung môi, 300C đến thu hồi dùng ethanol 95% làm gia tăng nhiệt độ từ 450C tăng cường việc capsaicinoid Nhiệt độ ảnh hưởng tính vật lý độ nhớt, nhiều đặc độ khuếch tán, hòa tan, áp suất sức căng bề mặt Tác dụng siêu âm làm dung môi hốc dược liệu bị sủi bọt phá vỡ bọt, giúp đẩy chất cần chiết khỏi dược liệu Thực tế hiệu cao 45 C thay 60 0C Tại 450C, số lượng bọt hốc tăng bị phá vỡ, đủ mạnh để thực chiết xuất Tại 60 C, số lượng bọt cao hơn, phá vỡ chúng hiệu Do đó, hiệu ứng hốc 450C thể cường độ mạnh 60 0C Dùng aceton làm dung môi, không nâng cao đáng kể hiệu nhiệt độ nâng lên từ 30 0C đến 45 C (hình 3) Ethanol thường hiệu so với aceton độ nhớt khuếch tán thấp coi dung môi cao độ Trang 10 Báo cáo dược liệu Tuy nhiên, siêu âm, aceton hiệu so với ethanol Trong nghiên cứu này, suất UAE tương đối tăng (v/v) ethanol 75-95% sử dụng dung môi so với aceton Áp suất aceton cao nhiều so với ethanol nước, nhiều bọt hiệu phá vỡ không cao, đặc biệt nhiệt độ chiết xuất Do đó, việc tăng cường hiệu chiết xuất hiệu ứng khoang sử dụng aceton thấp so với ethanol nước • Hiệu lực tỷ lệ nước ethanol Tỷ lệ nước dung môi ethanol có ảnh hưởng quan trọng chiết xuất capsaicinoid (hình 4) Đối với tất nhiệt độ kiểm soát, thấy ethanol 50% không hiệu cho chiết xuất capsaicinoid Điều khác biệt phân cực dung môi hợp chất chiết xuất Sự phân cực capsaicinoid thấp nhiều so với nước, điều không tốt hòa tan ethanol 50% (v/v) Tại 450C, thu hồi capsaicinoid yếu nhiều sử dụng ethanol 95% so với ethanol 75% Trong đó, 60 C, ethanol 75% dung môi có hiệu Nước có vai trò quan trọng chiết xuất Sự trương nở dược liệu nước nâng cao hiệu chiết xuất Cường độ siêu âm khoang hỗn hợp ethanol với diện nước tăng lên kết việc tăng sức căng bề mặt giảm độ nhớt Tuy nhiên, từ quan điểm kinh tế, chi phí để sử dụng ethanol 75% (v / v) việc loại bỏ dung môi bước cuối cần lượng tiêu thụ cao Do đó, ethanol 95% (v/v) dùng làm dung môi cho việc nghiên cứu tương lai • Hiệu lực tỉ lệ dung môi - vật liệu Hiệu chiết xuất tỷ lệ khác ớt bột (g) với 95% ethanol (ml) hiển thị bảng Phương pháp Thời gian Nhiệt độ (0C) Dược liệu:dung môi Tỷ lệ phục hồi (%) Ngâm Soxhlet UAE UAE UAE 15h 5h 3h 3h 3h 45 78.1 45 45 45 1:8 1:8 1:8 1:6 1:5 79.4 92 87.4 84.5 84.3 Tỉ lệ tìm thấy nâng lên từ 01:05 đến 01:08, việc thu hồi tăng nhẹ lên Tuy nhiên, kết khác số lượng lớn dung môi dùng Mặt khác, cách sử dụng số lượng lớn dung môi không coi hiệu chi phí vận hành cao dung môi lượng tiêu thụ Do đó, tỷ lệ trọng lượng khô bột ớt với ethanol 95% (v / v) chọn 01:05  Kết luận: Phương pháp ngâm thời gian tiến hành lâu (15h) tỷ lệ phục hồi capsaicinoid thấp (79.4%) trình ngâm để tự nhiên cho trình thẩm thấu, hòa tan khuếch tan diễn hoàn toàn mà Trang 11 Báo cáo dược liệu trợ giúp thiết bị khác Mặt khác trình ngâm đạt hiệu suất cao phải dùng lượng dung môi lớn gấp nhiều lần dó ta không dùng Quá trình chiết Soxhlet thu tỷ lệ capsaicinoid cao (92%) trình chiết xuất tiến hành 78.10C dung môi làm trình chiết xuất Thời gian chiết xuất với hỗ trợ siêu âm ngắn trình lượng sóng siêu âm chuyển thành (làm rung) làm vỡ bọt khí chỗ, đẩy chất cần chiết khỏi dược liệu nhanh 2.1.2 Phân lập capsaicin từ capsaicinoid: • Nhồi cột với 300g silicagel, nạp mẫu tiến hành rửa giải với dung môi có độ phân cực tăng dần: hexane, EtOH MeOH Dung môi rửa giải thu lại xác định sơ sắc kí lớp mỏng gồm 11 phân đoạn Phân đoạn tiếp tục chạy sắc kí cột với 60g 56g silicagel, tiến hành rửa giải với hỗn hợp dung môi EtOH/CH2Cl2 (5:95) ta thu hỗn hợp capsaicin dihydrocapsaicin (1) • Phân lập epoxide-capsaicin: Hòa tan hỗn hợp (1) EtOAc (2ml) thêm mCPBA (metacloroperoxybenzoic acid (17.2mg, 0.1mmol) 0C, dung dịch khuấy trộn 6h sau làm ấm nhiệt độ phòng Sau thêm nước vào chiết với EtOAc (3 x 20ml) Lớp hữu rửa lại với nước nước muối Lớp hữu tinh chế Quá trình tinh khiết hóa capsaicin thực sắc kí cột với dung môi rửa giải EtOH/hexane:1/1 2.2 Phương pháp 2: Dùng sắc kí ngược dòng tốc độ cao để phân lập tinh khiết hóa chất capsaicinoid 2.2.1 Dụng cụ HSCCC điều chế sử dụng Model GS10A-2 với cột xoắn đa lớp 1.6mm I.D chiều dài 110m với tổng dung tích 230ml Khoảng giá trị β cột chế từ 0.47 lớp đến 0.73 lớp (β =r/R, với r khoảng cách từ vòng xoắn (coil) đến cần đỡ, R bán kính vòng quay khoảng cách trục đỡ tâm trục máy ly tâm Dung môi bơm vào cột với bơm đẳng dòng Model NS-1007 Ghi kết thiết bị Model 8823A-UV bước sóng 254nm Mẫu tiêm vào cột với loop 10 µl Kết ghi lại dạng sắc kí đồ Hệ thống HPLC bao gồm: bơm Waters 600, điều chỉnh Waters 600, dụng cụ bơm mẫu với loop 10 µl, detector quang Waters 996 Trang 12 Báo cáo dược liệu Trang 13 Báo cáo dược liệu 2.2.2 Chuẩn bị cho trình chiết thô (1)Làm cách cho cột nhựa HPDresin (400g, polystyrene resin) với nước, ethanol 25% ethanol 60% giàu mẫu qua 100A 2.2.3 Lựa chọn hệ thống dung môi Trong HSCCC, việc lựa chọn pha dung môi việc làm then chốt Một hệ dung môi tốt phải đưa hệ số phân bố K chất mục tiêu Chìa khóa việc tối ưu hóa mẫu phải tan tốt, phải đảm bảo hệ số phân bố K chất mục tiêu gần với Trang 14 Báo cáo dược liệu Một vài hệ dung môi pha kiểm tra Hệ dung môi Chloroform-methanol-nước,4:3:2 Tetrachlorometan-chloroform-methanolnước,3:1:3:2 Tetrachlorometan-chloroform-methanolnước,3:1:3.5:2 Tetrachlorometan-chloroform-methanol-nước,4:3:2 Ether dầu hỏa-ethyl acetat-methanol-nước,1:2:2:1 Nordihydrocapsaicin 0.04 Capsaicin Dihydro-capsaicin 0.05 0.02 0.39 0.30 0.24 0.49 0.46 0.38 1.24 0.54 0.94 0.57 0.62 0.70 Kết luận: Hệ dung môi Tetrachlorometan-chloroform-methanol-nước (4:3:2, v/v/v) tối ưu hệ số K phù hợp nên chất mục tiêu tách tốt capsaicinoid tan tốt hệ dung môi 2.2.4 Chuẩn bị dung môi mẫu Hệ dung môi sau đạt trạng thái cân hoàn toàn lắc mạnh lần nhiệt độ phòng Khi pha tách dùng để chạy sắc kí Nước pha động, dung môi hữu pha tĩnh Dung dịch mẫu chuẩn bị cách hòa tan mẫu thô có chứa hoạt chất hỗn hợp nước dung môi hữu (1:1, v/v) hệ thống dung môi dùng cho HSCCC 2.2.5 Quá trình tách Trong trình tách phân lập mẫu thô, cột xoắn trước hêt phải lấp đầy với pha nằm hệ dung môi Cài đặt thiết bị quay với vận tốc 800 vòng/phút, lúc pha thấp bơm vào cột với tốc độ dòng 2ml/phút , với kiểu rửa giải đầu – cuối Sau pha động phía trước trạng thái cân động học thiết lập cột, khoảng 6ml dung dịch mẫu chứa 150mg mẫu thô tiêm vào Kết ghi lại detector UV bước sóng 254nm Mỗi phân đoạn peak thu lại dựa theo sắc kí đồ xác định HPLC Sự giữ lại pha tĩnh tùy thuộc vào tổng dung tích cột tính từ tích pha tĩnh thu sau trình tách hoàn thành Sau thu chất cần thiết sau trình rửa giải , ta bơm pha tĩnh thay phải tiếp tục rửa giải với pha động Sau lần chạy cột rửa với methanol 2.2.6 Phân tích HPLC xác định cấu trúc phân đoạn HSCCC Từng phân đoạn sau tách HSCCC phân tích HPLC với cột Shim-pack VP-ODS (250mm x 4.6mm, I.D.) bước sóng 254nm , nhiệt độ cột 25 0C Pha động, dung dịch methanol acid phosphoric (70:30,v/v), rửa giải với tốc độ dòng 0.8ml/phút Kết ghi lại dectector quang kế Quá trình xác định phân đoạn từ HSCCC tiến hành EI-MS, sắc kí lỏng hiệu cao phổ NMR với dung môi chloroform chất chuẩn nội tetramethylsilane 2.2.7 Kết Từ 150mg mẫu thô hòa tan 6ml gồm pha Dung dịch mẫu tách tinh khiết hóa HSCCC Pha phía pha tĩnh, pha nằm pha động Độ lưu giữ pha tĩnh 65% tổng Trang 15 Báo cáo dược liệu thời gian cho trình tách 4.5h Từng phân đoạn HSCCC phân tích HPLC, đo bước sóng 254nm Sắc kí đồ HPLC trình chiết thô từ Capsicum frutescens Các peak 1, 2, dihydrocapsaicin, capsaicin, nordihydrocapsaicin xác định 1H NMR, 13C NMR DEPT-NMR, ESI-MS, EI-MS Chỉ bước HSCCC, ta thu 33mg dihydrocapsaicin, 68mg capsaicin, 4mg nordihydrocapsaicin với độ tinh khiết 97.4%, 99% 94.5% Trang 16 Báo cáo dược liệu Sắc kí đồ trình chiết HSCCC Trang 17 Báo cáo dược liệu Điều kiện thử nghiệm: cột Shim-pack VP-ODS (250mm x 4.6mm,I.D), nhiệt độ cột: 25 0C; pha động: methanol-acid phosphoric 0.1% (70:30, v/v); tốc độ dòng 0.8ml/phút; phát hiện: 254nm; thể tích tiêm: 10µl KẾT LUẬN CHUNG Từ ớt Capsicum frutescens (L) Bail: • Bằng thực nghiệm capsaicinoid chiết xuất phương pháp ngâm, Soxhlet, UAE Kết thu sau: Phương pháp Ngâm Soxhlet UAE UAE UAE Thời gian 15h 5h 3h 3h 3h Nhiệt độ (0C) 45 78.1 45 45 45 Dược liệu:dung môi 1:8 1:8 1:8 1:6 1:5 Tỷ lệ phục hồi (%) 79.4 92 87.4 84.5 84.3 Bằng sắc ký cột cổ điển, phân lập capsaicin • Bằng HSCCC: từ 150g mẫu bột ớt thô phân lập 33mg dihydrocapsaicin, 68mg capsaicin, 4mg nordihydrocapsaicin với mức độ tinh khiết tương ứng 97.4%, 99% 94.5% Trang 18 Báo cáo dược liệu Các chế phẩm có chứa capsaicin Trang 19 Báo cáo dược liệu Tài liệu tham khảo Sumate Boonkird, Chada Phisalaphong, Muenduen Phisalaphong (2008),“Ultrasound-assisted extraction of capsaicinoids from Capsicum frutescens on a lab- and pilot-plantscale”, Ultrasonics Sonochemistry 15, p.1075–1079 Santamarıa et al (2000), “Selective Enzyme-Mediated Extraction of Capsaicinoids and Carotenoids from Chili Guajillo Puya (Capsicum annuum L.) Using Ethanol as Solvent”, J.Agric.FoodChem., vol 48, p 3063−3067 Pakit Kumboonma et al., “Isolation and structural modification of Capsaicin and Dihydrocapsaicin from Capsicum annuum sp.” F.Lietal (2009), “Preparative isolation and purification of capsaicinoids from Capsicum frutescens Using high-speed counter-current chromatography”, Separation and Purification Technology, Vol 64, p 304– 308 F Nazari et al (2007), “Multivariate Optimisation of Microwave-assisted Extraction of Capsaicin from Capsicum frutescens L and Quantitative Analysis by H-NMR”, Phytochemical Analysis, vol 18, p 333– 340 “Bài giảng dược liệu”, Bộ môn Dược Liệu, Trường Đại Học Y Dược Thành Phố Hồ Chí Minh Đỗ Tất Lợi (1995), “Cây thuốc vị thuốc Việt Nam”, NXB KHKT, Hà Nội Võ Văn Chi (1997), “Từ điển thuốc Việt Nam”, NXB Y học Trang 20 [...]... chiết bằng Soxhlet thu được tỷ lệ capsaicinoid cao nhất (92%) vì quá trình chiết xuất được tiến hành ở 78.10C và dung môi luôn được làm mới trong quá trình chiết xuất Thời gian chiết xuất với sự hỗ trợ của siêu âm ngắn hơn do trong quá trình này năng lượng của sóng siêu âm chuyển thành cơ năng (làm rung) làm vỡ các bọt khí tại chỗ, đẩy các chất cần chiết ra khỏi dược liệu nhanh hơn 2.1.2 Phân lập capsaicin. .. capsaicin từ capsaicinoid: • Nhồi cột với 300g silicagel, nạp mẫu và tiến hành rửa giải với 3 dung môi có độ phân cực tăng dần: hexane, EtOH và MeOH Dung môi rửa giải được thu lại và xác định sơ bộ bằng sắc kí lớp mỏng gồm 11 phân đoạn Phân đoạn 5 và 6 tiếp tục chạy sắc kí cột lần lượt với 60g và 56g silicagel, tiến hành rửa giải với hỗn hợp dung môi EtOH/CH2Cl2 (5:95) ta thu được hỗn hợp capsaicin và dihydrocapsaicin... quá trình chiết thô từ Capsicum frutescens Các peak 1, 2, 3 là dihydrocapsaicin, capsaicin, nordihydrocapsaicin đã lần lượt được xác định bằng 1H NMR, 13C NMR và DEPT-NMR, ESI-MS, EI-MS Chỉ duy nhất một bước HSCCC, ta thu được 33mg dihydrocapsaicin, 68mg capsaicin, 4mg nordihydrocapsaicin với độ tinh khiết lần lượt là 97.4%, 99% và 94.5% Trang 16 Báo cáo dược liệu 3 Sắc kí đồ của quá trình chiết bằng... capsaicin và dihydrocapsaicin (1) • Phân lập epoxide -capsaicin: Hòa tan hỗn hợp (1) trong EtOAc (2ml) đã được thêm mCPBA (metacloroperoxybenzoic acid (17.2mg, 0.1mmol) ở 0 0C, dung dịch được khuấy trộn trong 6h và sau đó làm ấm ở nhiệt độ phòng Sau đó thêm nước vào và chiết với EtOAc (3 x 20ml) Lớp hữu cơ được rửa lại với nước và nước muối Lớp hữu cơ này được tinh chế Quá trình tinh khiết hóa capsaicin được... 4) Đối với tất cả nhiệt độ kiểm soát, thấy rằng ethanol 50% không hiệu quả cho chiết xuất capsaicinoid Điều này do sự khác biệt trong phân cực giữa các dung môi và các hợp chất chiết xuất Sự phân cực của capsaicinoid là thấp hơn nhiều so với nước, điều đó không tốt khi hòa tan trong ethanol 50% (v/v) Tại 450C, sự thu hồi capsaicinoid yếu hơn nhiều khi sử dụng ethanol 95% so với ethanol 75% Trong khi... 10µl 3 KẾT LUẬN CHUNG Từ cây ớt Capsicum frutescens (L) Bail: • Bằng thực nghiệm capsaicinoid đã được chiết xuất bằng các phương pháp ngâm, Soxhlet, UAE Kết quả thu được như sau: Phương pháp Ngâm Soxhlet UAE UAE UAE Thời gian 15h 5h 3h 3h 3h Nhiệt độ (0C) 45 78.1 45 45 45 Dược liệu:dung môi 1:8 1:8 1:8 1:6 1:5 Tỷ lệ phục hồi (%) 79.4 92 87.4 84.5 84.3 Bằng sắc ký cột cổ điển, đã phân lập được capsaicin. .. capsaicin • Bằng HSCCC: từ 150g mẫu bột ớt thô đã phân lập được 33mg dihydrocapsaicin, 68mg capsaicin, 4mg nordihydrocapsaicin với mức độ tinh khiết tương ứng là 97.4%, 99% và 94.5% Trang 18 Báo cáo dược liệu 3 4 Các chế phẩm có chứa capsaicin Trang 19 Báo cáo dược liệu 3 Tài liệu tham khảo 1 Sumate Boonkird, Chada Phisalaphong, Muenduen Phisalaphong (2008),“Ultrasound-assisted extraction of capsaicinoids from... 2.2.6 Phân tích HPLC và xác định cấu trúc các phân đoạn của HSCCC Từng phân đoạn sau khi tách bằng HSCCC được phân tích bằng HPLC với cột Shim-pack VP-ODS (250mm x 4.6mm, I.D.) ở bước sóng 254nm , nhiệt độ trong cột 25 0C Pha động, dung dịch methanol và acid phosphoric (70:30,v/v), được rửa giải với tốc độ dòng 0.8ml/phút Kết quả được ghi lại bằng dectector quang kế Quá trình xác định các phân đoạn từ. .. tốc độ cao để phân lập và tinh khiết hóa các chất trong capsaicinoid 2.2.1 Dụng cụ HSCCC điều chế sử dụng Model GS10A-2 với cột xoắn đa lớp 1.6mm I.D và chiều dài 110m với tổng dung tích 230ml Khoảng giá trị β của cột đều chế từ 0.47 của lớp trong đến 0.73 ở lớp ngoài (β =r/R, với r là khoảng cách từ vòng xoắn (coil) đến cần đỡ, và R là bán kính vòng quay hoặc là khoảng cách giữa trục đỡ và tâm trục... năng cao và phổ NMR với dung môi là chloroform và chất chuẩn nội là tetramethylsilane 2.2.7 Kết quả Từ 150mg mẫu thô được hòa tan trong 6ml gồm 2 pha Dung dịch mẫu đã được tách và tinh khiết hóa bằng HSCCC Pha phía trên là pha tĩnh, còn pha nằm dưới là pha động Độ lưu giữ của pha tĩnh là 65% và tổng Trang 15 Báo cáo dược liệu 3 thời gian cho quá trình tách là 4.5h Từng phân đoạn của HSCCC được phân tích