− Từ lâu, người biết sử dụng nghệ để làm thuốc chữa bệnh, làm gia vị, làm phẩm màu cho chế biến thực phẩm Trong y học cổ truyền, người biết dùng nghệ để chữa bệnh − Trong y học đại, người ta phát rằng, hoạt chất curcumin củ nghệ có tác dụng kháng nấm, diệt khuẩn, diệt ký sinh trùng, chống viêm nhiễm bảo vệ da Curcumin coi chất tiêu biểu cho chất phòng chống ung thư hệ mới: − Do hoạt tính sinh học quý giá hợp chất nên việc chiết tách sử dụng curcumin nhiều nước tiếp tục nghiên cứu.Việt Nam có nguồn Nghệ vàng phong phú, phân bố nhiều tỉnh thành − Do đó, chúng em chọn đối tượng nghiên cứu củ Nghệ vàng, với đề tài “Nghiên cứu chiết xuất phân lập curcumin từ củ Nghệ vàng (Curcuma longa L )” TỔNG QUAN 2.1.Tổng quan thực vật học: 2.1.1 Giới thiệu nghệ: Nghệ (nghệ vàng) có tên khoa học Curcuma longa L.(Curcuma domestica Lour ) thuộc họ Gừng (Zingiberaceae) − − − − − − − Nghệ thân thảo Lá hình trái xoan, thon nhọn hai đầu, Cụm hoa, thành hình nón thưa Quả nang, hình cầu, ô, mở van, hạt có áo hạt Củ nghệ có vị đắng, cay, mùi thơm hắc, tính ấm Ở Việt Nam, nghệ có trữ lượng dồi trồng khắp địa phương, Nghệ ưa ẩm, ưa sáng 2.2.Tổng quan hóa học: 2.2.1 Thành phần hóa học: + Trong sách " thuốc vị thuốc Việt nam" tác giả Đỗ Tất Lợi thấy nghệ, + Chất màu curcumin 0,3%- 1%, tinh thể nâu đỏ ánh tím, không tan nước, tan rượu, ete, Công thức curcumin xác định sau: + Tinh dầu – 5% có màu vàng nhạt, thơm + Ngoài tinh bột, canxi oxalat, chất béo + 2.2.2 Thành phần hoạt chất chính − − + + + Tinh dầu 3- 5%gồm có 25% cacbua tecpenic, chủ yếu zingiberen Các chất màu vàng gọi chung curcumin Curcumin thức (còn gọi curcumin I) chiếm 60% Curcumin II chiếm 24% curcumin III chiếm 14% 2.2.3 Cấu trúc hóa học curcumin: Và năm 1913, cấu trúc hóa học curcumin Lampe xác định qua loạt phản ứng: + + + + + − Khi đun curcumin với kiềm tạo thành vanilic acid ferulic acid Curcumin nóng chảy với kiềm cho protocatechuic acid Oxy hóa permanganat tạo thành vanillin Tác dụng với hydroxylamin tạo dẫn xuất isoxozol Hydro hóa dẫn xuất diacetyl curcumin cho hỗn hợp dẫn xuất hexahydro tetrahydro Từ phản ứng trên, cấu trúc curcumin xác định diferuloylmethane Tổng quan:Curcumin tinh thể màu nâu đỏ, hoạt chất chiết từ nghệ vàng thuộc họ gừng Curcumin polyphenol sắc tố tạo nên màu vàng đặc trưng củ nghệ + Curcumin thành phần quan trọng linh động củ nghệ 2.2.4.1 Tính chất vật lý: − − − − Dạng thù hình: tinh thể hình kim dạng bột màu vàng cam Độ tan: Curcumin tan acid acetic, ethanol, methanol, tan n- hexan, không tan ether Curcumin tan nước có mặt chất hoạt động bề mặt Nhiệt độ nóng chảy: 184 – 185oC 2.2.4.2.Tính chất hóa học: 2.2.4.2.1.Một số tính chất đặc trưng: • • • − − • − Phản ứng phân hủy ( tác dụng ánh sáng) Phân hủy môi trường kiềm:Sản phẩm trình phân hủy acid ferulic feruloylmetan Phản ứng cộng với hydro sản phẩm chất kháng oxy hoá Phản ứng tạo phức với kim loại Kết phức kim loại curcumin có nhiều màu sắc khác Phản ứng amin hóa Tạo thành dẫn chất imin tương ứng, sản phẩm có hoạt tính kháng nấm chống oxy hóa tốt Tổng quan tác dụng, công dụng 2.3.1 Tác dụng Nghệ vàng − Tác dụng curcumin kháng oxy hoá, kháng khuẩn, kháng virus kháng số loại ung thư − Curcumin có giá trị hoạt tính sinh học cao công thức cấu tạo cur có nhóm hoạt tính sau: + Nhóm parahydroxyl: hoạt tính chống oxi hoá + Nhóm ceton: kháng viêm, kháng ung thư, chống đột biến tế bào + Nhóm liên kết đôi: kháng viêm, kháng ung thư, chống đột biến tế bào − Nghệ giảm đau dày bệnh da − Nghệ giúp liền sẹo, giảm cân, giúp thể chống vi khuẩn sống ký sinh ruột, đặc biệt tốt cho hệ tiêu hóa Nghệ giảm cholesterol độc hại máu & xơ vữa động mạch Chất curcumin củ nghệ nhà khoa học chứng minh chất chống oxy hóa cực mạnh có lợi cho sức khỏe, có lợi cho tim mạch, chống cholesterol ung thư 3.THỰC NGHIỆM: 3.1 Chiết xuất nhóm curcuminoid toàn phần curcumin: 3.1.1 Chiết xuất curcumionoid phương pháp đun hồi lưu – thống bình Soklet: 3.1.1.1 Xử lý nguyên liệu − Chọn nghệ già, lấy củ tốt khỏe, Lột bỏ lớp vỏ áo bên ngoài, rửa nước, để khô, cắt lát nhỏ sau đem sấy 800C đến nghệ nước hoàn toàn Dùng máy xay để xay nghệ sấy thành bột nghệ mịn 3.1.1.2 Tiến hành: Củ nghệ sau xử lý thành bột nghệ chiết với dung môi cồn tuyệt đối hệ thống bình Soklet bột nghệ ta thu curcuminoid thô Đem curcuminoid thô kết tinh lại hệ dung môi kết tinh methanol (99.9%):nước ba lần Sau đó, curcuminoid kết tinh đem lọc lấy tinh thể curcuminoid sau đem làm khô cách bỏ bình hút ẩm ta thu curcuminoid tinh curcuminoid tinh đem nhũ hóa với Polysorbate 80 Span 80 để tạo hệ nhũ curcuminoid – nước Giữ lạnh hỗn hợp tủ đông 5h Đem hỗn hợp sau kết tinh lọc chân không đem làm khô cách cho vào bình hút ẩm Lặp lại trình kết tinh hai lần để thu sản phẩm có độ tinh cao 3.1.1.3 Kết chiết xuất: Chiết curcuminoid: • Điều kiện cho mẫu chiết: - Lượng mẫu: 5g - Dung môi sử dụng: 350ml - Thời gian chiết: 8h - Số lần chiết: lần (khoảng 60 phút/ lần) - Nhiệt độ: 800C Kết tinh lại curcumin: − − − − − Hệ dung môi: methanol:nước Nhiệt độ: 600C Thời gian làm lạnh tủ đông: 5h Đem lọc lấy tinh thể Curcumin sau làm khô bình hút ẩm ta thu Curcumin tinh Lặp lại lần để có Cur tinh khiết Chiết xuất curcumionoid phương pháp siêu âm: 3.1.2.1 Quy trình thực 3.1.2.2 Tiến hành: Củ nghệ khô xay thành bột (1kg) trích ly siêu âm với hỗn hợp ethanol 960 15 phút nhiệt độ phòng Thu hồi dung môi, cao cô đặc chiết với n-hexan để loại bỏ tinh dầu Lớp nước để lạnh kết tinh thu sản phẩm curcuminoid thô 3.1.2.3 Kết : − Hình kết trích ly curcumin từ bột nghệ, ảnh hưởng thời gian tần số hiệu suất trích ly phương pháp trích ly siêu âm, có so sánh với phương pháp trích ly rắn lỏng có khuấy gia nhiệt Khảo sát sơ số liệu cho thấy thời gian trích ly thích hợp 15 phút, giảm 192 lần so với trích ly thông thường không khuấy trộn điều kiện nhiệt độ, giảm 32 lần (giảm 90%) so với trường hợp có khuấy trộn gia nhiệt Hiệu suất thu từ trích ly siêu âm cao trích ly thường có khuấy trộn gia nhiệt 3.2.2 2.1 3.2 Phân lập hợp chất thuộc nhóm curcumin: 3.2.1 Phân lập curcumin sắc ký cột: 3.2.1.1 Quy trình phân lập curcumin Kết tinh bột curcuminoid − Mục đích: loại bỏ nhựa giảm hàm lượng DMC, BDMC làm giàu hàm lượng curcumin − Hóa chất, nguyên liệu dụng cụ: + Hóa chất: MeOH, nước cất + Nguyên liệu: Bột curcuminoid + Dụng cụ: Erlen, lọc hút chân không, bếp điện, nồi, nhiệt kế 1000C, tủ đá − Phương pháp: • Kết tinh lần 1: Cho bột curcuminoid vào erlen, đổ vừa đủ lượng MeOH vào lắc 500C hỗn hợp trong, cho nước cất vào hỗn hợp (500C) đến chuyển sang đục, lắc liên tục hỗn hợp trở lại dừng Để dung dịch nguội nhiệt độ phòng, để kết tinh 50C tủ đá khoảng 24 Sau lấy ra, tiến hành lọc hút chân không Thu phần giấy lọc tiếp tục kết tinh • Kết tinh lần 3: Tiến hành tương tự lần kết tinh Sắc ký cột (SKC) − Mục đích: Phân lập thành phần hỗn hợp ban đầu + Pha động: Khảo sát trước TLC chọn hệ dung môi diclometan:eter dầu hỏa (90:10) Pha tĩnh: Silica gel 60G, 0.063-0.200mm, Merck + Cột thủy tinh Φ =30mm + Mẫu nạp vào cột theo phương pháp nạp mẫu ướt − Tiến hành • Bước 1: Chuẩn bị Sấy silicagel 1100C giờ, cân ẩm bình hút ẩm 30 phút Ngâm qua đêm với dung môi chạy cột Cột rửa sạch, sấy khô, kẹp thẳng góc giá, cho gòn vào đáy cột • Bước 2: Nhồi cột Cho từ từ lượng silica gel vào becher chứa sẵn dung môi chạy cột, lượng dung môi vừa đủ cho hỗn hợp không sệt Tiến hành cân cột 2-4 • Bước 3: Cho bột curcuminoid sau kết tinh lần lên bề mặt silica gel cột • Bước 4: Triển khai cột • Bước 5: Thu kiểm tra phân đoạn để thu curcumin tinh khiết Nhận xét: Hiệu suất tách cột : 61,08 % định tính curcumin TLC hệ diclometan- etyl acetat (96:4) vết tròn, rõ độ tinh khiết sản phẩm tách cao Tổng hợp dẫn xuất imin-curcumin Tổng hợp 3,5- Difluorophenylhydrazinocurcumin a Quy trình tổng hợp: b Phương pháp thực hiện: Điều kiện phản ứng: − Phản ứng xảy thích hợp theo tỉ lệ 1:1(mol/mol) − Khối lượng curmarin tham gia phản ứng 200mg − Khối lượng 3,5- Difluorophenylhydrazin hydrochloride 97% 100mg − Nhiệt độ phản ứng 600C c.Xử lí mẫu :Mục đích: Loại bỏ bớt tạp chất sau phản ứng khỏi hỗn hợp d Phân lập sản phẩm phương pháp sắc ký cột Phân lập sản phẩm 3,5-DFPHC cách chạy cột với nhiều hệ dung môi khác Qua khảo sát loạt hệ dung môi diclometan:hexan, diclometan:eter dầu hỏa, diclometan:etyl acetat, etyl acetat:eter dầu hỏa, hexan:etyl acetat … Kết cho thấy hệ hexan:etyl acetat có khả tách tốt 3.2.2.2 Tổng hợp 4-Fuorophenylhydrazinocurcumin a Quy trình tổng hợp: − + + + c + • • • • • • Điều kiện phản ứng: Khối lượng curcumin tham gia phản ứng 150mg Khối lượng 4- Fluorophenylhydrazin hydrochloride 95% 149mg Nhiệt độ phản ứng 600C Xử lý mẫu sau phản ứng:Mục đích: Loại bỏ bớt tạp chất khỏi hỗn hợp sau phản ứng Phân lập hợp chất curcumin : HPLC Điều kiện sắc ký: Cột RP- 18 (250 mm x 4,6 mm, 5µm) hay cột tương đương Detector: quang phổ hấp thu tử ngoại với dãy diod quang PDA bước sóng 263 nm.Pha động:acetonitril – dung dịch acid acetic 0,03% (50:50) Tốc độ dòng 1,0 ml/phút Thể tích tiêm: 10 µl Dung dịch đối chiếu xác lượng 10 mg chuẩn đối chiếu curcumin USP methanol Pha loãng ml dung dịch pha động vừa đủ 50 ml Lọc qua màng lọc 0,45µm Dung dịch thử: Hòa tan xác lượng 10 mg chất chiết curcumin methanol.Pha loãng ml dung dịch pha động vừa đủ 50 ml.Lọc qua màng lọc 0,45 µm • Khảo sát tính tương thích hệ thống sắc ký Với điều kiện sắc ký lựa chọn, khảo sát tính tương thích hệ thống sắc ký thông qua lần tiêm lặp lại mẫu chuẩn.Hệ thống sắc ký đạt yêu cầu với độ lệch chuẩn tương đối không 2%, hệ số đối xứng không 1,5, độ phân giải curcumin demethoxycurcumin lớn • Kết : định lượng curcumin có hàm lượng 96,38 % tính nguyên trạng PHẦN NHẬN ĐỊNH: 4.1 Nhận định phần chiết xuất curcumin từ Nghệ vàng: Có thể chiết xuất nhóm curcumin từ Nghệ vàng phương pháp: • Phương pháp đun hồi lưu – thống bình Soklet : − thu curcumin thô • Phương pháp siêu âm: Đã khảo sát thông số ảnh hưởng đến trình trích ly siêu âm curcumin thời gian, tần số dạng nguyên liệu đầu Nhận định chung:Bằng phương pháp siêu âm thiết bị phương pháp tương đối đơn giản, phù hợp để triển khai chuyển sang qui mô Pilot công nghiệp so với phương pháp hồi lưu 4.2 Nhận định phần phân lập curcumin từ Nghệ vàng: Có thể phân lập nhóm curcumin từ Nghệ vàng phương pháp: • Phân lập curcumin sắc ký cột: − Kết kiểm tra định tính curcumin thu TLC hệ diclometan:etyl acetat (96:4) cho vết tròn, rõ cho thấy độ tinh khiết sản phẩm tách cao.từ nhận danh dẫn xuất 4Fluorophenylhidrazinocurcumin Tuy nhiên sau 66 theo quan sát TLC cho thấy sản phẩm không đậm thêm lên mà bắt đầu thấy sản phẩm phụ sinh đầu sản phẩm phía cur Vì thời điểm 66 dừng phản ứng tiến hành SKC phân lập sản phẩm • Phân lập curcumin HPLC: - Tinh chế sắc ký cột silical gel kết hợp HPLC điều chế pha đảo RP 18 thu curcumin có độ tinh khiết cao - Định lượng curcumin HPLC cột pha đảo RP 18 cho hàm lượng so với chất chuẩn curcumin USP đạt yêu cầu chất lượng nguyên liệu đối chiếu Nhận định chung: Phân lập HPLC cho kết có độ tin cậy cao so với phân lập sắc ký cột PHẦN KẾT LUẬN: 5.1 Phần chiết xuất curcumin từ Nghệ vàng: • Phương pháp đun hồi lưu – thống bình Soklet Với 100g bột nghệ ta thu khoảng 5g curcuminoid ( hiệu suất 5%) • Phương pháp siêu âm Vậy 1kg bột nghệ ta thu 22g curcuminoid (hiệu suất 2,2%) Kết luận chung: phương pháp siêu âm thu curcuminoid có hiệu suất thấp so với phương pháp đun hồi lưu 5.2 Phần phân lập curcumin từ Nghệ vàng: • • − − − • • Phân lập curcumin sắc ký cột: Curcumin tinh: Nhận xét: Hiệu suất tách cột tương đối cao: 61,08 % Kết kiểm tra định tính cur thu TLC hệ diclometan:etyl acetat (96:4) cho vết tròn, rõ cho thấy độ tinh khiết sản phẩm tách cao Dẫn xuất 3,5-Difluorophenylhydrazinocurcumin: Nhận xét: Từ 300mg nguyên liệu ban đầu thu 125mg dẫn xuất thô với hiệu suất đạt 46,3%, 25mg khối lượng tinh với hiệu suất 20% hiệu suất toàn trình 9,65% • Tổng hợp dẫn xuất 4- Fluorophenylhidrazinocurcumin − Khối lượng Curcumin tinh tham gia phản ứng: mcurcumin = 150mg • Nhận xét: Từ 299mg nguyên liệu ban đầu thu 115mg 4-FPHC hiệu suất đạt 42,14%, SKC tinh thu 39mg tương ứng hiệu suất đạt 34%, sắc ký điều chế thu 18mg tinh khiết đạt hiệu suất 9,62% • Phân lập hợp chất thuộc curcumin HPLC: - Tinh chế sắc ký cột silical gel kết hợp HPLC điều chế pha đảo RP 18 thu curcumin có độ tinh khiết cao (> 99%), phương pháp chiết đơn giản dễ áp dụng cho hiệu suất chiết thu 2,2% - Định lượng curcumin HPLC cột pha đảo RP 18 cho hàm lượng 96,38% ± 0,136 so với chất chuẩn curcumin USP đạt yêu cầu chất lượng nguyên liệu đối chiếu ... chuyển sang qui mô Pilot công nghiệp so với phương pháp hồi l u 4.2 Nhận định phần phân l p curcumin từ Nghệ vàng: Có thể phân l p nhóm curcumin từ Nghệ vàng phương pháp: • Phân l p curcumin sắc ký... nguyên liệu đối chiếu Nhận định chung: Phân l p HPLC cho kết có độ tin cậy cao so với phân l p sắc ký cột PHẦN KẾT LUẬN: 5.1 Phần chiết xuất curcumin từ Nghệ vàng: • Phương pháp đun hồi l u –... đỏ, hoạt chất chiết từ nghệ vàng thuộc họ gừng Curcumin polyphenol sắc tố tạo nên màu vàng đặc trưng củ nghệ + Curcumin thành phần quan trọng linh động củ nghệ 2.2.4.1 Tính chất vật l : − − − −