Chiết xuất và phân lập isoflavone từ cây đậu nành glycine max

Chiết xuất và phân lập isoflavone từ cây đậu nành glycine max

Chiết xuất phân lập isoflavone từ đậu nành Glycine max ĐẶT VẤN ĐỀ Nước ta có điều kiện thuận lợi vị trí địa lý khí hậu nên nguồn dược liệu phong phú lợi để ngành Dược nước ta phát triển theo hướng đại hóa thuốc y học cổ truyền , thuốc có nguồn gốc dược liệu Mặt khác, chế phẩm dược liệu có tính an toàn đạt hiệu điều trị không so với chế phẩm tân dược Đậu tương hay đỗ tương, đậu nành (Glycine max) loại họ Đậu (Fabaceae) giàu hàm lượng chất đạm protein Cây đậu tương thực phẩm có hiệu kinh tế lại dễ trồng Từ trước đến nay, sản phẩm từ đậu tương sử dụng đa dạng dùng trực tiếp hạt thô chế biến thành đậu phụ, ép thành dầu đậu nành, nước tương, làm bánh kẹo, sữa đậu nành, okara đáp ứng nhu cầu đạm phần ăn hàng ngày người Trong nhiều năm qua, nhà khoa học giới tìm flavonoid, chất chống oxy hóa, có nhiều loại thực phẩm khác trái cây, rau củ, thảo mộc, ngũ cốc chocolate, tốt cho sức khỏe người Trong cỏ, flavonoids giúp điều hoà sống tăng trưởng, chống tác dụng nguy hại ánh sáng cực tím Tiến sĩ Catherine Rice Evans thuộc International Antioxidant ResearchCentre, Luân Ðôn báo cáo rằng: genistein daidzein thuộc nhóm isoflavones có khả chống oxi hóa hữu hiệu Năm 1989, Viện Nghiên Cứu Ung Thư Quốc Gia Hoa Kỳ (National CancerInstitute, NCI) trợ cấp cho chương trình năm nghiên cứu thực phẩm ngăn chận ung thư Qua đó, giới khoa học gia khám phá đậu nành thực phẩm đặc biệt, vừa bổ dưỡng vừa ngăn ngừa bệnh ung thư Người Á Ðông nhờ ăn nhiều đậu nành, nên có tỷ lệ bệnh ung thư thấp người dân Mĩ gấp lần Theo nghiên cứu bệnh viện, thực đơn với đậu nành làm hạ thấp cholesterol mức mục tiêu Phytoestrogen thành phần gặp với hàm lượng tương đối cao nhiều thực phẩm quen thuộc dân cư châu Á, đặc biệt đậu nành thực phẩm chế biến từ đậu nành Phytoestrogen đậu nành, isoflavones có cấu trúc hóa học gần với estrogen, nội tiết tố nữ, có vai trò quan trọng việc bảo vệ xương, cách làm giảm tỷ lệ tiêu hao xương kích hoạt hình thành tế bào tạo xương Đậu nành nghiên cứu có khả bảo vệ thể trước nguy bệnh Alzheimer, tiểu đường type 2, giảm nguy mắc bệnh tim mạch, giảm triệu chứng mệt mỏi phụ nữ tuổi mản kinh Vì thế, phụ nữ Châu Á bị bệnh tim mạch phụ nữ Mỹ châu Âu Bên cạnh đó, flavonoid từ thực phẩm đậu nành hoạt động chất chống viêm phổi giúp phòng chống tác nhân gây ung thư thuốc Ðậu nành tạo ích lợi cho nam giới Ðậu nành bảo vệ nam giới tránh bệnh ung thư tuyến tiền liệt (prostate gland) Do genistein ngăn cản tăng trưởng bướu Theo tiến sĩ Wing-Ming Keung đại học Harvard hoạt chất isoflavones ngăn cản không cho kích thích tố nam bị phá hoại Ngoài ra, đậu nành cung cấp vitamin B, amino axit chất béo có lợi cho tim Mặc dù giới có nhiều công trình nghiên cứu đậu nành, Việt Nam chưa có nhiều công trình nghiên cứu thành phần hóa học đậu nành, đặc Chiết xuất phân lập isoflavone từ đậu nành Glycine max biệt isoflavonoid Hơn nữa, nguồn nguyên liệu đậu nành Việt Nam đa dạng có giá trị sinh học cao Từ lí trên, đề tài “chiết xuất phân lập isoflavonoid từ đậu nành (Glycine max)” xây dựng Chiết xuất phân lập isoflavone từ đậu nành Glycine max Phần I : TỔNG QUAN VÀI NÉT VỀ CÂY ĐẬU NÀNH 1.1 Tìm hiểu chung đậu nành Đậu nành có tên khoa học Glycine max L, thuộc họ đậu (Fabaceae), gọi đậu tương hay đại đậu [1]trên thới giới có 1000 loại đậu tương với nhiều đặc điểm khác nhau, hạt đậu nành có giá trị dinh dưỡng kinh tế cao.[2,3] Đậu nành loại thân thảo, năm Thân mảnh, cao từ 0.8-0.9m, có lông, cành hướng lên phía Lá mọc cách có ba chét hình trái xoan, mũi gần nhọn, không điều gốc hoa có màu trắng hay tím sếp thành chùm nách cành Quả thõng, hình lưởi liềm, gân bị ép, có nhiều lông mềm màu vàng, thắt lại hạt hạt thứ 2, 3, gần hình cầu, hạt lại hình thận dài, có màu vàng gơm nhạt, [1] nước ta phân biệt rỏ ràng đậu nành (hạt màu vàng nhạt) với đậu đen, đậu đỏ tài liệu thực vật nước người ta miêu tả hạt đậu nành màu vàng, đỏ, lục hay đen với nhiều đặc điểm khác nhau, hạt đậu có kích thước nhỏ hạt đậu Hà Lan lớn trái anh đào [1,3] Theo từ điển thực phẩm, đậu nành có nguồn gốc từ Trung Quốc, sau truyền bà sang Nhật Bản vào khoảng kỷ thứ VIII, vào nhiều kỷ sau có mặt nước Á Châu Thái Lan, Malaixia, Hàn Quốc, Việt Nam… Từ cổ xưa đậu nành sử dụng nước làm thực phẩm Cây đậu nành có mặt Châu Âu vào đầu kỷ 17 Hoa Kỳ vào kỷ 18, việc trồng trọt bắt đầu phát triển lớn Liên Xô củ phát triển nhanh chóng nước Châu Mỹ: nước thuộc miền trung đồng sông Mitsixipi.[1,2,3] Theo tài liệu [4]đậu nành có nguồn gốc phía Bắc Đông Châu Á, thực phẩm quan trọng Đậu nành dể trồng suốt mùa hè mùa thu, trồng xen cánh đồng lúa Ngày nay, Hoa Kì quốc gia đứng đầu sản xuất đậu nành chiếm 50% sản lượng toàn giới, đến Trung Quốc, Ấn Độ Cây đậu nành năm thực phẩm quan trọng Hoa Kì, theo số liệu thống kê nông nghiệp Hoa Kì năm 2008 diện tích trồng đậu nành chuyển gen chiếm 92% tổng diện tích trồng đậu nành nước.[2] Chiết xuất phân lập isoflavone từ đậu nành Glycine max 1.2 Một số ứng dụng từ đậu nành Xưa nay, đậu nành vẩn nhà dinh dưỡng học đánh giá cao giàu protit lipit Trong 100g đậu nành có từ 34-40g protit khoảng gần 20g lipit, nhiều loại thịt động vật Chất protein đậu nành đưới dạng casein thực vật không khác với casein động vật có sữa, có đầy đủ axic amin cần thiết cho phát triển trì thể người ra, đậu nành giàu vitamin khoáng chất Từ đậu nành, nhân dân ta chế biến nhiều thức ăn ngon : Bột đậu nành, sữa đậu nành, đậu phụ, tào phớ, tương…[5] Hạt đậu nành có giá trị kinh tế cao Cùng mẫu đất, số thu hoạch chât đạm đậu nành nhiều 33% với thứ nông sản khác Hàm lượng protein đậu nành cao thịt, cá gần gấp đôi loại đậu khác.[2] Đậu nành chứa hàm lượng dầu béo cao loại đậu khác nên coi loại cung cấp dầu thảo mộc Chất béo lipit đậu nành có chứa tỷ lệ cao chất fatty axid không bão hòa, có mùi vị thơm ngon, dùng dầu đậu nành thay cho mở động vật.[2] Dầu đậu nành sử dụng để nghiên cứu tổng hợp biodiezen xúc tác NaOH/MgO Biodiezen nhiên liệu sinh học nhằm thay cho nhiên liệu diezen khoáng ngày cạn kiệt.[6] Ở Trung Hoa, Nhật Bản Hàn Quốc người ta chế biến 600 sản phẩm khác nhau, có nửa loại thực phẩm chế biến theo phương pháp cổ truyền dạng tươi, khô lên men sản phẩm đại kỉ thực như: cà phê, thịt chay nhân tạo, socola…[2] Ngày nay, nước Á Châu, đậu hũ xem thức ăn ngày coi văn hóa Á Đông giống văn hóa Humburger Hoa Kì vậy.[2] Đậu nành sau ép lấ dầu, người ta dùng bã Đậu chế biến thành thức ăn nuôi gia súc Ở quốc gia phát triển, họ dùng đậu nành vào kỹ nghệ khác như: chế biến cao su nhân tạo, mực in, sơn, xà phòng, chất tơ nhân tạo, chất nhiên lỏng, dầu làm trơn kỹ nghệ hàng không ….[2] Bột đậu nành sau loại dầu hay nước đậu nành sau tinh chế dùng chế men ureaza, thuốc thử đặc hiệu Ure hóa sinh.[1] Cây đậu nành có khả tồn trữ chất đạm khí trời làm giàu chất đạm cho đất Do kỹ nghệ trồng đậu nành không làm hư đất mà làm cho đất thêm màu mỡ.[2] Ngoài giá trị dinh dưỡng, đậu nành ăn chế biến từ đậu nành có giá trị phòng chữa bệnh.[5] Đậu nành có tác dụng làm cho thể người trẻ lâu sung sức, tăng thêm trí nhớ tái tạo mô, làm cứng xương tăng sức đề kháng cho thể[2] Chiết xuất phân lập isoflavone từ đậu nành Glycine max Trong Y dược, bột đậu nành (đã làm mùi nước) trộn với bột ngũ cốc, ca cao dùng làm thức ăn cho trẻ sơ sinh, người bệnh tiểu đường, người bị thấp khớp, bệnh gút, người ốm dậy, người lao động sức.[1] Lexitin casein dùng riêng hay phối hợp làm thuốc bổ dưỡng làm ta dược Stigmasteron dùng tổng hợp progesterone[1] Trong công nghiệp dược phẩm, bột đậu nành dùng chế môi trường nuôi cấy nấm mốc kháng sinh chế biến số axit amin acginin, axit glutamic thủy phân acid bột đậu nành.[1] Các nhà khoa học khám phá hóa thảo mộc đậu nành có đặc tính chống lại mầm ung thư như: ung thư vú, ung thư kết tràng, ung thư phổi, ung thư dày, ung thư nhiếp hộ tuyến.[2,3,7] Hơn nữa, đậu nành có khả làm hạ cholesterol máu người bị xơ vữa động mạch, phòng ngừa chứng bệnh tim mạch, bệnh tiểu đường, bệnh xốp xương, bệnh thận…[5,2] THÀNH PHẦN HÓA HỌC TRONG ĐẬU NÀNH Theo GS Ðỗ Tất Lợi [1], toàn chứa 12% nước, 16% gluxit, 14-15% protein, 6% muối khoáng chất khác nito Hạt thành phần có giá trị sử dụng chứa đầy đủ chất dinh dưỡng cần thiết mà tồn hoá thảo mộc có tác dụng phòng ngừa trị bệnh đặc biệt bệnh thời đại như: bệnh ung thư, bệnh liên quan đến tim mạch 2.1 Các thành phần có giá trị dinh dưỡng đậu nành 2.1.1 Protein: Nhiều nghiên cứu rằng, hạt Đậu nành có giá trị dinh dưỡng cao Người ta xác định thành phần protein hạt Đậu nành chứa đầy đủ loại amino axit thiết yếu : tryptophan, threonine, isoleuxin, valin, lysin, methionin, phenylalanin leucin Hàm lượng chất amino axit tương đương với hàm lượng chất amino axit trứng gà đặc biệt tryptophan gần gấp rưỡi trứng [2,7] Protein hạt Đậu nành chứa khoảng 38% tuỳ loại, nhiều giống Đậu nành có hàm lượng protein đặc biệt cao tới 40-50% Có chế phẩm Đậu nành mang tới 9095% protein, dây nguồn protein thực vật có giá trị cao cung cấp cho người [3] Protein Đậu nành dễ tiêu hoá, cholesterol chất béo bão hoà thường có nơi thịt động vật Hàm lượng protein Đậu nành cao hon thịt cá gần gấp đôi lọai Đậu khác [2] 2.1.2 Chất sinh tố chất khoáng Không giàu protein bất cú loại thực phẩm nào, kể thịt động vật Ðậu nành giàu chất sinh tố chất khoáng như: sắt, canxi, photpho, kẽm, vitamin nhóm B: B1, B2, Chiết xuất phân lập isoflavone từ đậu nành Glycine max B3, B6 có vitamin E Trong Ðậu nành chứa nhiều chất xơ tốt cho tiêu hoá [2,3] Theo GS Ðỗ Tất Lợi [1], hạt Ðậu nành chứa trung bình 8% nước, 4-5% chất vô cơ, nhiều Kali 2%, Natri 0,38%, Canxi 0,23%, photpho 0,65%, Magiê 0,24%, lưu huỳnh 0,45% Ðậu nành chứa vitamin tan nước như: vitamin B1, B2, B3, B6; vitamin PP chứa vitamin tan dầu như: vitamin A, vitamin D, vitamin E (trong Ðậu nành châu Á châu Mỹ), vitamin K, vitamin F vitamin C Các vitamin A D xuất hạt chín, sau bị men oxy hoá phá hủy Trong nhóm vitamin B, Ðậu nành chứa lượng vitamin B1 gấp lượng vitamin B1 sữa bột bột loại hạt Ðậu khác chứa tinh bột, lượng vitamin B2 chứa sữa bột khoảng 1/3 lại gấp lần so với số loài Ðậu khác 2.1.3 Chất béo chất cholesteron Ðậu nành thực phẩm nhiều protein lại calorit, chất béo bão hoà hoàn toàn cholesteron [2] Chất béo chiếm khoảng 15-20% có đạt tới 23% Tỷ lệ phần trăm glyxerit axit béo: linolein 49,3%, olein 32%, linolenin 2%, panmitin 6,5%, stearin 4,2%, aracgidin 0,7%, lignoxerin 0,1% 0,5% axit panmitoleic [1] So sánh với loài Ðậu khác Ðậu nành có chứa axit béo thiết yếu cao hơn, tổng số chất béo chứa khoảng 18%, thành phần cacbonhydrat chiếm 31%.[8] 2.1.4 Dầu đậu nành Dầu đậu nành thuộc loại dầu khô dầu hạt lanh, chứa khoảng 14% chất béo bão hoà, 59% chất béo không bão hoà đa tính, 23% chất béo không bão hoà đơn tính Trong số lượng chất béo không bão hoà đa tính lại chứa 8% linoleic axit (omega – 3- fatty acid), có thực phẩm nguồn gốc thực vật [1,2] Trong dầu béo Ðậu nành có photpholipit chủ yếu lexitin 1-5% Lexitin nằm dầu béo (tách lạnh), nằm phần bã (tách dung môi bay hơi) Ngoài dầu béo có chất steron nhu: stigmasteron, sitosteron số sapogenon khác [1] 2.2 Thành phần hoá thảo mộc Ðậu nành Ðiều làm nhà khoa học thích thú năm nghiên cứu gần khám phá hoá thảo mộc có Ðậu nành ứng dụng chúng linh vực y khoa trị liệu Viện ung thư quốc gia Hoa Kì, viện đại học Havard, viện đại học Alabama, Minnesota, Helsinki Finland thực nhiều công trình khảo cứu khoa học xác định lợi ích hoá thảo Đậu nành Họ thấy tiêu thụ chất có khả ngăn ngừa mà có khả trị liệu số bệnh như: bệnh đau tim, bệnh tai biến mạch máu não, ung thư vú, ung thư nhiếp hộ tuyến ung thư kết tràng…[7] Chiết xuất phân lập isoflavone từ đậu nành Glycine max 2.2.1 Protease inhibitor Năm 1980, Dr Walter troll thuộc trường đạii học y khoa New York university Medical Center khám phá Đậu nành nguyên sơ có khả ngăn cản không cho bệnh ung thư phát triển loài động vật, tác động chất protease inhibitors Tiếp sau đó, nhiều nhà khoa học khảo sát thử nghiệm chất protease inhibitors Đậu nành phòng thí nghiệm thấy có tác động chống lại phát triển mầm ung thư kết tràng, ung thu phổi, ung thu miệng… Protease inhibitor ngăn ngừa tác động số gen di truyền gây nên chứng ung thư Nó cung bảo vệ tế bào thể không cho hư hại, gây nên tác động môi trường xung quanh nhu tia nắng phóng xạ chất công ADN [2,7] 2.2.2 Phytate[2,7] Phytate hợp thể chất khoáng phosphorus inositon Các nhà khoa học chứng minh phytate có tác động ngăn ngừa mầm ung thư mà có khả ngăn ngừa bệnh tim mạch Hai nhà nghiên cứu Drs.E.Graf J W.Eator cho biết phytate bảo vệ khỏi bệnh ung thư kết tràng, kết phòng thí nghiệm cho thấy phytate liên tiếp ngăn cản không cho bệnh ung thư kết tràng phát triển không cho phát sinh mầm ung thư vú Mặt khác phytate có tác động ngăn cản hấp thụ sắt ruột bảo vệ khỏi chứng có nhiều chất sắt chất sắt thặng dư yếu tố nguy hại đến chứng nhồi máu tim Phytates hành xử giống nhu chất antioxydant, vitamin C, Beta – carotin 2.2.3 Phytosteron [2,7] Phytosteron có liên hệ với cholesteron, nhiên cholesteron có nơi thực phẩm có nguồn gốc từ thịt động vật phytosteron có thực phẩm rau đậu Không giống cholesteron, phytosteron có tác động ngăn ngừa bệnh tim mạch qua việc dành chổ thẩm thấu qua ruột cholesteron để vào máu.Do cholesteron không vào máu mà phải tiết ngoài, lượng cholesteron máu giảm, mức độ giảm tuỳ cá thể Phytosteron cung có khả làm giảm phát triển bướu ung thư kết tràng chống lại ung thư da 2.2.4 Saponin Năm 2007 nhà khoa học Hàn Quốc Nhật Bản dùng bột Đậu nành khử dầu đem chiết xuất metanol, butanol 80% Dịch chiết sau làm khô chân không đem định tính sắc kí lớp mỏng, sỏc kí lỏng hiệu cao HPLC xác định cấu trúc cách ghi phổ Sau xác định thành phần saponin Đậu nành, khoa học gia tiến hành thí nghiệm thử hoạt tính saponin chuột đực tuần tuổi cách tiêm qua Chiết xuất phân lập isoflavone từ đậu nành Glycine max tĩnh mạch đuôi Kết cho thấy saponin Đậu nành có tác động ngăn cản di tế bào ung thu [9] Nhiều công trình nghiên cứu khác ra, saponin loại hoá thảo có đặc tính giống antioxydant Saponin có khả trực tiếp ngăn cản phát triển ung thư kết tràng đồng thời làm giảm lượng cholesteron máu 2.2.5 Phenolic axit [2,7] Phenolic axit hoá thảo chống oxy hoá anti – oxidant phòng ngừa nhiễm sắc thể AND khỏi bị công tế bào ung thư 2.2.6 Lecithin [2,7] Khi nghiên cứu thành phần hoạt chất Đậu nành nhà khoa học nhận thấy, đạm chất Đậu nành có chứa 3% lecithin với lượng lecithin có lòng đỏ trứng gà Lecithin hoá chất thực vật quan trọng, đóng vai trò định việc kích thích biến dưỡng khắp tế bào co thể lecithin có khả làm gia tăng trí nhớ cách nuôi dưỡng tốt tế bào não hệ thần kinh, làm vững tuyến tái tạo mô tế bào thể Ngoài ra, lecithin có tác động cải thiện hệ thống tuần hoàn, xương tăng cường sức đề kháng Khi hệ thần kinh thiếu lượng, chất lecithin Đậu nành phục hồi lượng 2.2.7 Browman– Birk Inhibitor (BBI) [2] BBI hoá thảo tìm thấy Đậu nành, có khả ngăn cản tiến trình phát triển mầm ung thư Trong nhiều năm qua, nhà khoa học thí nghiệm thành công mẫu tế bào ống thí nghiệm thú vật qua hai dạng tinh chế PBBI cô đặc BBIC Theo báo cáo kết tường trình hội nghị khoa học giới vai trò Đậu nành việc phòng trị bệnh (1996) PBBI BBIC kiểm soát phát triển tiến trình ung thư miệng, vú, ruột già, gan, phổi, thực quản tế bào ống thí nghiệm lẫn chuột bạch chuột đồng Hiện BBI dùng người vài trung tâm nghiên cứu kết sơ khả quan BBIC thẩm định loại thuốc quan F.D.A(the U.S.Food and Drug Administration) 2.2.8 Omega – fatty axit [2] Omega – fatty axit loại chất béo không bão hoà có khả làm giảm luợng cholesterol xáu LDL đồng thời làm gia tăng lượng cholesterol tốt HDL máu Nhiều nghiên cứu khoa học xác nhận tiêu thụ nhiều Omega – fatty axit giúp ngăn chặn phát triển bệnh tim mạch 2.2.9 Isoflavone Chiết xuất phân lập isoflavone từ đậu nành Glycine max Do tính kì diệu việc phòng điều trị bệnh, đặc biệt bệnh thời đại, isoflavone hoá thảo thu hút quan tâm nhà khoa học THÀNH PHẦN VÀ HOẠT TÍNH ISOFLAVONE TRONG ĐẬU NÀNH 3.1 Thành phần isoflavone Đậu nành Năm 2005, nhà khoa học Brazil dã tiến hành phân tích 18 mẫu Đậu nành Mục đích thí nghiệm xác định thành phần hợp chất isoflavon từ so sánh tỷ lệ chất 18 mẫu Qua phân tích, cho thấy isoflavon Đậu nành hợp chất phenolic gồm có: aglucone (daidzein, genistein glyxitein), ß – glucozit (genistin, daidzin, glyxitin), ß – glucozit kết hợp với nhóm malonyl ( ” - O – malonyldaidzin, ” – O – malonylgenistin ” – O – malonylglycitin), ß - glucozit kết hợp với nhóm axetyl ( ” – O – axetyldaidzin, ” – O - axetylgenistin ” – O – axetylglycitin) [10] Bằng phương pháp sắc kí HPLC/DAD phổ UV nhà khoa học Bồ Ðào Nha xác định thành phần isoflavone 40 mẫu hạt Đậu nành Sau so sánh với kết nghiên cứu thực trước với kết phân tích thí nghiệm, khoa học gia khẳng định hạt Đậu nành aglucone chiếm lượng nhỏ, hợp chất hạt Đậu nành dẫn xuất malonyl dẫn xuất axetyl ß – glucozit Báo cáo hạt Đậu nành chứa aglucone : sissotrin, ononin; dẫn xuất axetyl ß – glucozit : ” – axetylsissotrin, ” – axetylononin; dẫn xuất malonyl ß – glucozit : ” - malonylsissotrin, ” – malonylononin [11] Năm 2006 nhà khoa học Hàn Quốc thực nghiên cứu so sánh thành phần isoflavone phôi, mầm, hạt vỏ hạt Đậu nành Kết nhận được, tổng tỷ lệ trung bình isoflavone 2887µg/g phôi, 575µg/g hạt, 325µg/g mầm, 33µg/g vỏ hạt Các khoa học gia phân tách 12 đồng phân isoflavone 90 phút/mẫu thí nghiệm phương pháp HPLC – PDA [4] Cấu trúc isoflavon gồm vòng bezen: A B nối với dị vòng pyron [12] Hình Cấu trúc hóa học Aglucon Chiết xuất phân lập isoflavone từ đậu nành Glycine max R1 R2 R3 Daidzein -H -H -OH Genistein -H -OH -OH Glyxitein -OCH3 -H -OH Formononetin -H -H -OCH3 Biochanin A -H -OH -OCH3 Daidzin Genistin Glycitin Hình cấu trúc hóa học β Glucozit 3.2 Hoạt tính isoflavon Đậu nành [4] Các hoạt chất có tác dụng “phytoestrogen” hạt Đậu nành gồm chủ yếu daidzin, genistin Genistin daidzin phân tử tương đối lớn, tan tốt nước, tính phân cực cao, nên khó hấp thu qua ống tiêu hoá Muốn cho dễ hấp thu trở nên có giá trị sinh học, phải thuỷ phân chúng thành aglycon, tức làm thành phần glycozit phân tử Muốn vậy, cần có xúc tác enzym đặc hiệu glycosidase ống tiêu hoá người không tạo glycosidase, nên thể thuỷ phân isoflavon isoflavon chưa có giá trị sinh học Ngược lại, số tạp khuẩn định cư ruột tạo glycosidase cần cho trình thuỷ 10 Chiết xuất phân lập isoflavone từ đậu nành Glycine max Pha động HPLC gồm dung môi A B Dung môi A bao gồm 65% methanol 35% nước Dung môi B gồm 15% methanol 85% nước Chạy gradient sau: 0-21 phút, gradient tuyến tính từ 80- 30% B; 21-70 phút, chạy đẳng dòng 30% B; 70-70.5 phút, gradient tuyến tính từ 30-80% B; 80 phút, chu kỳ lặp lại Tốc độ dòng 1.0ml/ phút Bảng Thời gian lưu Daidzein, Genistein, Coumestrol Hợp chất Thời gian bắt đầu thu chất (phút) Thời gian kết thúc thu chất (phút) Daidzein 29.2 32.3 Genistein 38.2 42.0 Coumestrol 55.3 58.8 Để tăng lượng chất rửa giải, gom chất rửa giải từ 12 mẫu dịch chiết rễ đậu nành Chất rửa giải sấy đông khô để loại dung môi methanol nước Các tinh thể thu hòa tan trở lại methanol dùng cho quang phổ Chuẩn bị mẫu cho GC – MS: bốc tới khô phần dung dịch methanol khí N2 Phân tích trực tiếp tinh thể thu dẫn chất trimethylsilyl (TMS) tinh thể Dẫn chất TMS tạo từ việc hòa tan phần tinh thể 0.2ml chất silylation BSTFA, sau đun nóng nhẹ dung dịch 60oC 15 phút 1.3 Kết bàn luận Phổ đồ HPLC điển hình dịch chiết rễ đậu nành biểu diễn hình Trên 80 phút phân tích, phương pháp 16h Việc sử dụng cột lớn nên giảm đáng kể thời gian phân tích, phải bảo đảm phân tích đầy đủ hợp chất quan tâm từ dịch chiết DMSO Phổ UV dịch methanol tương ứng peak thể bước sóng hấp thu cực đại 238, 249, 259 303nm Những giá trị tương tự chất thu từ daidzein chuẩn chất báo cáo thư viên phổ Phổ khối peak thể phân tử ion M/Z = 254 phân mảnh ion 137 118 Phổ khối dẫn chất TMS peak có phân tử ion M/Z = 398 phân mảnh ion 353 184 Những phổ cần thiết cho việc xác định phổ thu daidzein chuẩn Peak có bước sóng cực đại 264 340nm Phổ đồ 250nm giống phổ genistein chuẩn phổ báo cáo thư viện phổ Sự hấp thu 250nm xác định không tinh khiết Phổ khối peak thể hiên phân tử ion M/Z =270 phân mảnh ion 153 118 Phổ khối dẫn chất TMS peak không hiển thị phân mảnh ion mong muốn 471, 414 399 Những phổ peak cần thiết cho việc xác 18 Chiết xuất phân lập isoflavone từ đậu nành Glycine max định phổ thu genistein chuẩn Phổ dẫn chất TMS genistein chuẩn thể peak ion phân tử nhỏ M/Z = 486 Bước sóng hấp thu cực đại peak 212, 242, 307 347 nm Phổ UV peak giống với coumestrol chuẩn Phổ khối có ion phân tử M/Z= 268 phân mảnh ion 240 Những giá trị thu với coumestrol chuẩn tương ứng với phổ báo cáo thư viện phổ Dẫn chất TMS peak có ion phân tử M/Z = 412 phân mảnh ion 397 369 Chất rửa giải tương ứng với peak thu thập từ 62 -66 phút phân tích Phổ UV dung dịch methanol tương ứng với peak thể bước sóng hấp thu cực đại 227, 291, 313 325 nm Ion phân tử phổ khối peak M/Z = 338, với phân mảnh ion 323 305 Dẫn chất TMS có ion phân tử M/Z = 482 phân mảnh ion 467, 393 377 Dữ liệu đề nghị peak hỗn hợp glyceolin I, II, III, tất chúng biết phytoalexins phần mặt đất đậu nành Kĩ thuật mô tả cung cấp phương pháp nhanh đơn giản cho việc chiết xuất phân lập loại hợp chất Sự phân tích định lượng sử dụng kĩ thuật Hình Phổ đồ HPLC Chiết xuất isoflavone (daidzin, genistin, daidzein genistein) từ trụ mầm đậu nành n – hexan.[17] 2.1 Nguyên tắc Loại chất béo khỏi đậu nành lên men vi sinh dung môi không phân cực Chiết với dung môi phân cực cô đến cắn 19 Chiết xuất phân lập isoflavone từ đậu nành Glycine max Hòa tan cắn với dung môi phân cực thứ hai, pha loãng với nước tạo tủa Các aglycone isoflavone phân cực glycosid isoflavone kết tủa Tách rửa kết tủa với dung môi phân cực thứ hai bay loại dung môi Chất rắn thu chứa nhiều aglycone isoflavone đậu nành 2.1.1 Ví dụ Chuẩn bị nguyên liệu cách lên men trụ mầm đậu nành với koji – kin, loại nấm thuộc chi Aspergillus oryzae Xay thành bột thô với cỡ hạt khoảng 100 meshes Trộn bột với lượng n-hexane gấp khoảng lần, đun hồi lưu nhiệt độ sôi n-hexane (690C) (dao động – tùy thuộc vào lượng mẫu ban đầu) Dùng máy sấy hơ nóng loại dung môi Lặp lại quy trình chiết vài lần để loại hoàn toàn chất béo Chấm sắc kí cho thấy dịch n – hexan không chiết isoflavone (đó lí dùng dung môi để chiết xuất) Nguyên liệu loại chất béo thu có khối lượng khoảng 89% so với nguyên liệu ban đầu Cho thêm lượng ethyl acetate gấp khoảng lần, đun hồi lưu nhiệt độ xấp xỉ nhiệt độ sôi ethyl acetate (77.1 0C) trong (dao động – tùy thuộc lượng nguyên liệu) Dịch ethyl acetate cô áp suất giảm Lượng cắn thu – 5% khối lượng nguyên liệu ban đầu Có thể lặp lại qui trình vài lần để tăng tỉ lệ phục hồi Cắn hòa tan với lượng nhỏ ethanol 99% pha loãng với nước tới độ cồn khoảng 20% để tạo tủa Để yên thời gian Lọc qua giấy lọc tách lấy kết tủa sấy áp suất giảm Sản phẩm rắn thu chứa phần lớn aglycone isoflavone Phân lập isoflavone sắc kí cột Diaion HP-20, thu daidzin, genistin, daidzein có độ tinh khiết cao.Như vậy, với qui trình chiết xuất phân lập sản phẩm thu có hàm lượng glycosid isoflavone tăng 10 – 13 lần aglycone isoflavone tăng 57 – 64 lần so với nguyên liệu ban đầu Tỉ lệ phục hồi từ 40 – 70% Bảng So sánh hàm lượng isoflavone nguyên liệu ban đầu sản phẩm rắn Isoflavone Nguyên liệu ban đầu Sản phẩm rắn Daidzin 0.095% 1.2% Genistin 0.043% 0.5% Daidzein 0.68% 43.0% Genistein 0.12% 7.0% 20 Chiết xuất phân lập isoflavone từ đậu nành Glycine max Chiết xuất aglycones isoflavone (daidzein genistein) trụ mầm đậu nành sau thủy phân glycosid isoflavone enzyme ß-glucosidase nội sinh theo hai phương pháp chiết rắn – lỏng SC – CO2 Phân lập định lượng HPLC.[18] 2.1.2 Thực nghiệm 2.1.2.1 Hóa chất, dung môi thiết bị Carbon dioxide SFE (độ tinh khiết 99.99%) (White Martins, Brazil) Chuẩn genistin, genistein, daidzin, daidzein, flavone p-nitrophenyl-ß-D-glucoside (pNPG) (Sigma Chemical Co, USA) Acetronitrile, methanol, dimethyl sulfoxide (DMSO), trifluoroacetic (TFA) dành cho phân tích (Vetec Quimica-Brazil) Các dung môi lọc qua màng lọc Millipore 0.45 μm Spectrophotometer model 634-S UV/VIS (Varian, USA) Máy li tâm (Beckman, USA) Hệ thống chiết siêu tới hạn (Hewlett–Packard 7680A) Hệ thống HPLC (Hewlette–Packard 1050), bơm tiêm Reodyne 7125, loop 50 đầu dò UV – Vis Cột Hypersil-ODS C18 (20 cm x 4.6 mm x μm; Hewlett & Packard, USA) 2.1.2.2 Chuẩn bị mẫu Mẫu thử: hạt đậu nành ngâm với nước (đã acid hóa với HCl 0.1 N tới pH 5) 50 0C 6, 12 18 để thúc đẩy thủy phân enzyme ß-glucosidase nội sinh Sau để rửa với nước lạnh Thu lấy trụ mầm phương pháp thủ công, xay tới cỡ hạt đường kính 0.297 tới 0.35 mm Bảo quản lọ nhỏ chứa nitrogen -200C Mẫu trắng: hạt đậu nành sấy trước 900C để bất hoạt enzyme xử lý tiếp 2.1.2.3 Định lượng hoạt tính enzyme 100 g trụ mầm đậu nành trộn với 1.5 ml natri phosphate 0.1 M (pH 5) 30 phút Hỗn hợp quay li tâm 8000 vòng phút Tách lấy phần mặt, thu dịch chiết chứa enzyme Đánh giá hoạt tính ß-glucosidase dựa vào chất p-nitrophenyl-ß-D-glucoside (p-NPG) Trộn 500 μl p-NPG mM đệm phosphate–citrate 0.1 M (pH 5.0) 300 μl nước với 200 μl dịch chiết enzyme, ủ 40 phút 450C Ngừng phản ứng cách thêm natri carbonat 0.25 M 21 Chiết xuất phân lập isoflavone từ đậu nành Glycine max Sản phẩm có màu vàng đo quang bước sóng 420 nm Định lượng p-NPG bị thủy phân dựa vào phương trình đường chuẩn xây dựng với hàm lượng 0.02–0.16 μM p-NPG Một đơn vị hoạt tính enzyme lượng enzyme cần thiết để giải phóng μM p-NPG phút Các phương pháp chiết xuất 3.1 Phương pháp chiết rắn – lỏng cổ điển Trộn 500 mg trụ mầm đậu nành với 10 ml methanol 80% nước (v/v) máy trộn từ Dịch chiết thô quay li tâm 800 vòng 20 phút lọc qua màng lọc Millipore 0.45 μm, chuẩn bị cho HPLC 3.2 Phương pháp chiết dùng SC – CO2 Nguyên liệu 80 mg bột rây qua rây 40 mesh Chiết riêng mẫu thời gian tĩnh động 15 phút, nhiệt độ 50, 60 700C, áp suất 176, 218, 261, 370 380 bar Dung môi phụ trợ methanol, ethanol acetonitril thêm trực tiếp vào mẫu hàm lượng 0, 10 mol % so với lượng CO2 qua hệ thống thời gian chiết động (20.7g) Tốc độ dòng CO2 giữ định 1.5 ml/phút Với mẫu, chiết lần (tổng thời gian x 30 = 90 phút, tổng lượng CO2 62.1 g, tổng thể tích dung môi phụ trợ 0, 0.8, 1.2 ml (tương ứng 0, 10 mol %)) 3.3 Định lượng sắc kí lỏng hiệu cao (HPLC) Pha động: dung môi (1) TFA 0.1 % nước, dung môi (2) acetonitril Pha động ban đầu dung môi (1) 100 %, thêm dần dung môi (2) từ đến 54.6 % 20.6 phút Giữ tình trạng 10 phút quay lại tình trạng ban đầu phút Tiêm 50 μl mẫu syringe 100 μl Tốc độ dòng 1.0 ml/phút Phát bước sóng 262 nm Định lượng dựa vào diện tích peak theo phương pháp chuẩn nội Chuẩn ngoại: dung dịch gốc daidzin, genistin, daidzein genistein DMSO pha loãng với pha động ( 54.6 % dung môi (2) dung môi (1)) đến nồng độ 0.2 – 20 μg/ml Chuẩn nội có hàm lượng μg/ml 22 Chiết xuất phân lập isoflavone từ đậu nành Glycine max Hàm lượng isoflavone mẫu tính dựa vào phương trình định lượng chuẩn daidzin, genistin, daidzein genistein, là: y = 0.05089x + 0.06683 (r = 0.9906) y = 0.07375x - 0.04091 (r = 0.9987) y = 0.09058x + 0.04099 (r = 0.9994) y = 0.0379x + 0.0161 (r = 0.996) Tính tuyến tính tương ứng miền giá trị 0.2 – 12 μg/ml, độ tin cậy 95 % Mỗi dịch chiết phân tích đến độ lại 95% Sử dụng kiểm định Turkey để kết luận có khác biệt có ý nghĩa thống kê hay không hàm lượng isoflavone trụ mầm đậu nành thu từ phương pháp chiết - Kết - Thủy phân isoflavone trụ mầm đậu nành enzyme ß-glucosidase nội sinh Phương trình hàm lượng daidzein genistein (mg/100g) theo thời gian ủ (giờ) (miền giá trị từ – 18 ủ) Daidzein = 24.62 + 1.8566 (thời gian) - 0.0804 (thời gian)2 (R2 = 0.8312) Genistein = 17.17 + 3.4429 (thời gian) - 0.1439 (thời gian)2 (R2 = 0.8786) Như vậy, hàm lượng daidzein genistein tăng dần từ đến 12 ủ giảm dần từ 12 đến 18 ủ Trong 12 ủ, tỉ lệ bị thủy phân daidzein 60 % genistein 56 % chứng tỏ daidzin dễ bị thủy phân ß-glucosidase genistin Bảng Hàm lượng isoflavone trụ mầm đậu nành thu theo phương pháp chiết rắn – lỏng sau thủy phân nhiệt độ cao bảng ANOVA cho thử nhiệm thời gian ngâm ủ Isoflavone Thủy phân 500C, pH (giá trị trung bình lần thí nghiệm) Mẫu trắng 12 18 Daidzin 919.54 551.72 597.72 643.68 Genistin 170.92 95.72 99.17 102.55 Daidzein (D) 24.10 ± 0.78 34.46 ± 1.81 33.74 ± 1.10 32.52 ± 1.06 23 Chiết xuất phân lập isoflavone từ đậu nành Glycine max Genistein (G) 16.19 ± 0.53 35.61 ± 1.16 34.80 ± 1.14 34.49 ± 1.81 D+G 40.29 70.07 68.54 66.01 Bảng ANOVA Tổng bình Bậc tự phương Trung bình F %* bình phương Daidzein Thời gian ủ 138.55 46.18 Biểu mẫu bình phương 127.32 63.66 Sai số 6.22 1.55 514.99 171.66 Biểu mẫu bình phương 475.9875 237.99 Sai số 1.55 0.341 Genistein Thời gian ủ 6.20 0.026 * Giá trị tới hạn F(2, 4) 6.94 với độ tin cậy 95% Bảng cho thấy với độ tin cậy 95 %, có khác biệt có ý nghĩa thống kê thời gian ngâm ủ đến hàm lượng chiết daidzein genistein Định lượng Nhiệt độ áp suất chất lưu, tỉ lệ dung môi phụ trợ thời gian chiết yếu tố ảnh hưởng chủ yếu tới hiệu suất chiết Điều kiện chiết ban đầu áp suất 176 – 380 bar, nhiệt độ 50 – 700C, sử dụng 13.8 g CO2 chiết động với 10 mol % dung môi phụ trợ (0.4 0.8 ml methanol 80%) cho 80 mg mẫu Hiệu suất chiết CO2 tinh khiết không cao cho dù thay đổi nhiệt độ áp suất Do đó, tăng độ phân cực dung môi chiết Có 17 dung môi phụ trợ nghiên cứu chiết siêu tới hạn hợp chất thiên nhiên Trong đó, methanol sử dụng phổ biến cải thiện hiệu tính phân cực hỗn hòa với CO2 tới 20 % Qui trình chiết xuất sử dụng methanol 80 % (v/v) tỏ dung môi phụ trợ hiệu trường hợp Bảng Giá trị trung bình hàm lượng isoflavone trụ mầm đậu nành theo 24 Chiết xuất phân lập isoflavone từ đậu nành Glycine max phương pháp SC – CO2 với 10 mol % methanol 80 %, lượng SC – CO2 chiết động 20.7 g Mẫu Nhiệt độ Áp suất Giá trị trung bình ± SD (mg/100g) (0C) (bar) Daidzin Genistin Daidzein 50 60 Genistein 176 Nd Nd 0.43 ± 0.04 1.30 ± 0.05 370 Nd Nd 0.81 ± 0.01 2.51 ± 0.04 218 Nd Nd 1.09 ± 0.04 2.78 ± 0.04 380 Nd Nd 1.72 ± 0.01 5.02 ± 0.02 261 Nd Nd 0.83 ± 0.01 1.98 ± 0.01 370 Nd Nd 1.21 ± 0.01 3.68 ± 0.03 70 Nd: not detected (không phát hiện) Bảng cho thấy áp suất đó, với dung môi phụ trợ methanol 80 %, hàm lượng aglycon isoflavone chiết tăng theo nhiệt độ từ 50 – 60 0C giảm tăng từ 60 – 70 0C Điều chứng tỏ 60 0C nhiệt độ chiết tối ưu Ở nhiệt độ thử nghiệm, áp suất tăng hiệu suất chiết tăng Việc tăng lượng SC – CO2 chiết động (từ 13.8 lên 20.7 g) với dung môi phụ trợ methanol 80 % cải thiện đáng kể hiệu suất chiết, chứng minh hiệu suất chiết phụ thuộc nhiều vào tỉ lệ chuyển khối Như vậy, với dung môi phụ trợ methanol 80 %, điều kiện chiết tối ưu nhiệt độ 60 0C áp suất 380 bar Từ điều kiện tối ưu này, tiến hành thử với dung môi phụ trợ khác ethanol acetonitril 80 % (v/v) 25 Chiết xuất phân lập isoflavone từ đậu nành Glycine max Bảng Giá trị trung bình hàm lượng isoflavone trụ mầm đậu nành theo phương pháp chiết sau 12 ngâm ủe Isoflavone (mg/100g) Chiết lỏnga Daidzin rắn – SFEb SFEc SFEd 551.72 Nd Nd Nd Genistin 95.72 Nd Nd Nd Daidzein (D) 34.46 ± 1.81 1.72 ± 0.01 1.98 ± 0.01 4.78 ± 0.03 Genistein (G) 35.61 ± 2.91 5.02 ± 0.02 5.92 ± 0.03 13.19 ± 0.37 D+G 70.07 6.74 7.90 17.97 Tổng 717.51 6.74 7.90 17.97 a Methanol 80% v/v1; n = b 600C/380 bar; methanol 80% v/v; n = c 600C/380 bar; ethanol 80% v/v; n = d 600C/380 bar; acetonitrile 80% v/v; n = e Các giá trị chứng minh khác có ý nghĩa thống kê (p < 0.05) kiểm định Tukey Từ bảng thấy rằng, hiệu suất chiết isoflavone đậu nành theo phương pháp truyền thống (chiết rắn – lỏng) cao nhiều so với phương pháp đại SFE Hàm lượng isoflavone dạng glycoside cao dạng aglycone Ngoài ra, sử dụng dung môi phụ trợ acetonitril 80 % SFE cho hiệu suất chiết cao tronng dung môi phụ trợ thử nghiệm 26 Chiết xuất phân lập isoflavone từ đậu nành Glycine max Hình Kết HPLC của: – Mẫu chuẩn; – Mẫu trắng phương pháp chiết rắn – lỏng; – Mẫu thử phương pháp chiết rắn – lỏng với ngâm ủ; – Mẫu thử phương pháp chiết SFE (dung môi phụ trợ acetonitrile) 27 Chiết xuất phân lập isoflavone từ đậu nành Glycine max Phân lập genistin từ hỗn hợp genistin, daidzin glycitin.[19] Theo phương pháp truyền thống, việc phân lập genistin từ daidzin glycitin phải siêu lọc phức tạp qua hệ thống sắc kí sơ resin trao đổi ion Qui trình tiêu tốn lượng lớn resin để hấp thu isoflavon từ dịch chiết nước làm nóng nhiệt độ khác để lợi dụng tính tan phụ thuộc nhiệt độ Qui trình lợi dụng tính tan phức genistin – calci so với phức daidzin – calci glycitin – calci hỗn hợp dung môi hữu phân cực (ví dụ: aceton, mothanol, ethanol) nước Dung môi thông dụng acetone nước tỉ lệ thay đổi từ 3:1 đến 5:1 (thường sử dụng tỉ lệ 4:1) Hỗn hợp dung môi dùng trình chiết xuất tinh chế Isoflavones đậu nành trộn với hỗn hợp dung môi cho phản ứng với lượng dư Ca(OH)2 CaO (thường dư – lần) Phức genistin – calci sau tách riêng lọc li tâm cho phản ứng với acid vô để thu hồi lại genistin Acid thường dùng HCl tạo muối CaCl2 tan dễ thu hồi genistin Genistin thu có hàm lượng tăng lên khoảng 70-90% Genistin tinh chế cách kết tinh từ hỗn hợp aceton – nước ethanol – nước Qui trình dùng cho aglycone genistein cách chuyển genistin thành genistein (thủy phân liên kết 1, – glucosid acid enzyme) Phương pháp chiết xuất isoflavone cổ điển thực nhiệt độ cao Với hỗn hợp dung môi acetone – nước, nhiệt độ sử dụng nhiệt độ hồi lưu aceton (khoảng 560C áp suất khí cao áp suất cao hơn) Ca(OH)2 CaO thêm vào dịch chiết nhiệt độ khoảng 500C trì 40-500C để hình thành phân tách phức isoflavone – calci lọc li tâm Lọc lấy phần kết tủa (bao gồm vôi dư phức genistin – calci, phức daidzin glycitin tan tốt lại dung dịch) hòa vào dung dịch HCl nóng Glycoside isoflavone tự không tan thu lấy cách lọc li tâm Tinh chế glycoside isoflavone tự cách kết tinh nhiều lần hỗn hợp dung môi hữu – nước (aceton – nước ethanol – nước) Cụ thể hòa tan genistin thô hỗn hợp dung môi ethanol – nước (4:1), đun hồi lưu 79 0C 90 phút lọc nóng Làm lạnh dung dịch để kết tinh genistin Genistin thu chứa hàm lượng daidzin thấp ([...]... isoflavon đậu nành chủ yếu kích thích β ER 3.3.5 Tác dụng phụ có thể gặp với isoflavon của đậu nành Đậu nành và isoflavon của đậu nành dung nạp tốt, loại trừ một vài trường hợp hiếm gây rối loạn nhẹ đường tiêu hóa Đậu nành thuộc họ đậu (Fabaceae) Người dị ứng với rau đậu có thể 13 Chiết xuất và phân lập isoflavone từ cây đậu nành Glycine max dị ứng với thức ăn chế từ đậu nành ( sữa đậu nành, đậu phụ, bột đậu. .. hàm lượng daidzin rất thấp (