Chiết xuất và phân lập flavonoid từ cây diếp cá houttuynia cordata thunb.saururaceae

CHIẾT XUẤT VÀ PHÂN LẬP FLAVONOID TỪ CÂY DIẾP CÁ Houttuynia cordata Thunb. Saururaceae. Nhóm 3 Tiểu nhóm 4 Giảng viên hướng dẫn: PGS.TS: VÕ THỊ BẠCH HUỆ TS: NGUYỄN VIẾT KÌNH Th.S : ĐỖ VĂN MÃI Th.S : NGUYỄN THỊ ÁNH NGUYỆT 1 1 www.trungtamtinhoc.edu.vn 4 2 3 I. TỔNG QUAN  Tổng quan về thực vât học ̣  Tổng quan về hóa học  Tổng quan về tác dụng – công dụng II.TỔNG QUAN FLAVONOID  Khái niệm  Cấu trúc và phân loại  Tác dụng III.THỰC NGHIỆM  Chiết xuất nhóm flavonoid  Phân lập nhóm flavonoid IV. KẾT LUẬN VÀ NHẬN ĐỊNH 2 2 www.trungtamtinhoc.edu.vn I. Tổng quan DIẾP CÁ Houttuynia cordata Thunb.Saururaceae Giới thực vật (Plantae) Ngành Ngọc Lan (Magnoliophy ta) Lớp Ngọc Lan (Magnoliopsid a) Phân lớp Ngọc Lan (Magnoliidae) Bộ Hồ Tiêu (Piperales) Họ Lá Giấp (Saururace ae) Chi Diếp Cá (Houttuynia Thunb) 1.1. Tổng quan về thực vật học. 3 3 www.trungtamtinhoc.edu.vn Phân bố, sinh thái và thu hái. • Loài của lục địa châu Á, phân bố từ Ấn Độ qua Trung Quốc, Nhật Bản, Thái Lan, các nước Đông Nam Á. • Ở Việt Nam, Diếp Cá mọc hoang ở chỗ ẩm ướt, thung lũng, ven suối, bờ mương, khắp các tỉnh miền núi. Thường được trồng làm rau và làm thuốc.

L/O/G/O CHIẾT XUẤT VÀ PHÂN LẬP FLAVONOID TỪ CÂY DIẾP CÁ Houttuynia cordata Thunb Saururaceae Nhóm Tiểu nhóm Giảng viên hướng dẫn: PGS.TS: VÕ THỊ BẠCH HUỆ TS: NGUYỄN VIẾT KÌNH Th.S : ĐỖ VĂN MÃI Th.S : NGUYỄN THỊ ÁNH NGUYỆT www.trungtamtinhoc.edu.vn 1  Tổng quan về thực vâ ̣t học I TỔNG QUAN  Tổng quan về hóa học  Tổng quan về tác dụng – công dụng II.TỔNG QUAN FLAVONOID III.THỰC NGHIỆM IV KẾT LUẬN VÀ NHẬN ĐỊNH www.trungtamtinhoc.edu.vn  Khái niệm  Cấu trúc phân loại  Tác dụng  Chiết xuất nhóm flavonoid  Phân lập nhóm flavonoid 2 I Tổng quan 1.1 Tổng quan thực vật học Chi Diếp Cá (Houttuynia Thunb) Họ Lá Giấp (Saururace ae) Giới thực vật (Plantae) Ngành Ngọc Lan (Magnoliophy ta) DIẾP CÁ Houttuynia cordata Thunb.Saururaceae Bộ Hồ Tiêu (Piperales) Lớp Ngọc Lan (Magnoliopsid a) Phân lớp Ngọc Lan (Magnoliidae) www.trungtamtinhoc.edu.vn Phân bố, sinh thái thu hái • Loài lục địa châu Á, phân bố từ Ấn Độ qua Trung Quốc, Nhật Bản, Thái Lan, nước Đơng Nam Á • Ở Việt Nam, Diếp Cá mọc hoang chỗ ẩm ướt, thung lũng, ven suối, bờ mương, khắp tỉnh miền núi Thường trồng làm rau làm thuốc www.trungtamtinhoc.edu.vn 1.2 Tổng quan thành phần hóa học Text in here Flavonoid Text in here Tinh dầu Text in here Acid amin Alkaloid Thành phần khác www.trungtamtinhoc.edu.vn 1.3 Tổng quan tác dụng, công dụng 1.3.1 Công dụng Rau Diếp Cá loại rau quen thuộc bữa ăn hàng ngày người Việt Nam Ngồi cơng dụng xem loại rau ngon, diếp cá có nhiều cơng dụng khác Quốc gia Bộ phận dùng Tác dụng Việt Nam, Trung Quốc Rễ, Rau Nhật Bản Toàn Nước uống, Khử mùi Hàn Quốc Tồn Kim chi, Nước tương, Siro, Nước uống có gas Thái Lan Lá non Rau www.trungtamtinhoc.edu.vn Tác dụng: Theo Đơng y, Diếp cá có vị đắng, tính ôn, tác dụng vào kinh mạch Đại tràng Phế, có tác dụng: www.trungtamtinhoc.edu.vn 1.3.2 Tác dụng dược lý nghiên cứu lâm sàng Kháng khuẩn Kháng viêm Tác dụng dược lý Trên hệ miễn dịch Lợi tiểu Chống Oxy hóa Kháng tế bào ung thư www.trungtamtinhoc.edu.vn 1.4 Các chế phẩm có chứa Diếp cá thị trường www.trungtamtinhoc.edu.vn II TỔNG QUAN VỀ FLAVONOID 2.1 Khái niệm chung Flavonoid • Flavonoid nhóm hợp chất thường gặp dược liệu thực vật loại rau • Cho đến có 4000 chất xác định cấu trúc, riêng hai nhóm flavon flavonoid với nhóm OH OCH3 • Phần lớn chất chứa flavonoid có màu vàng, có số chất màu xanh, tím đỏ khơng có màu 10 www.trungtamtinhoc.edu.vn 10  Phân đoạn (3,7 g) có vết phát quang màu tím đèn UV 365 nm cho màu xanh đen với TT FeCl3, có vết chiếm lượng lớn, tiến hành kết tinh phân đoạn nhiều lần methanol cách hòa tan hoàn toàn phân đoạn này lượng vừa đủ methanol, lọc qua phễu thủy tinh xốp Dịch lọc để vào tủ lạnh, cho bay dung môi từ từ, lọc và rửa tinh thể bằng methanol lạnh Tinh thể được kiểm tra sắc ký lớp mỏng qua ̣ dung môi khác EtOAc-H2O-HCOOH-CH3COOH (100:10:5:5), EtOAc-aceton-H2O (4:5,5:0,5), CHCl3-HCOOH-CH3COOH (6:2:0,5), BuOAc-H2O-HCOOH (15:5:5), phát TT vanilin-sulfuric, TT FeCl3, soi UV 365 nm, UV 254 nm, tinh thể thu màu vàng tươi đặt tên DC2(450mg)  Phân đoạn (2,3 g) phân đoạn (11,6 g) giống nên gộp chung, tiến hành kết tinh phân đoạn methanol không thu tinh thể, cô thu hồi dung môi phân đoạn, kiểm tra sắc ký lớp mỏng nhận thấy vết G bị phân huỷ thành vết G G’ (có thể có mặt acid formic) Do để phân lập chất G cần phải khảo sát lại hệ dung môi 30 khai triển mà khơng có mặt acid 30 www.trungtamtinhoc.edu.vn  Phân đoạn (2,3 g) phân đoạn (11,6 g) giống nên gộp chung, tiến hành kết tinh phân đoạn methanol không thu tinh thể, cô thu hồi dung môi phân đoạn, kiểm tra sắc ký lớp mỏng nhận thấy vết G bị phân huỷ thành vết G G’ (có thể có mặt acid formic) Do để phân lập chất G cần phải khảo sát lại hệ dung mơi khai triển mà khơng có mặt acid  Các phân đoạn cịn lại khối lượng có nhiều vết nên không tiếp tục nghiên cứu  Chất chiết xuất thu từ phân đoạn cột Phân đoạn Chất tinh khiết Đặc điểm Khối lượng (mg) DC1 Vàng chanh 34 DC2 Vàng tươi 450 31 www.trungtamtinhoc.edu.vn 31 c) Phân lập flavonoid sắc ký cột chân khơng (Cột 2) • Mục đích: để tiếp tục phân lập chất G hay flavonoid lại cao A2, tiến hành khảo sát lại số hệ dung môi khai triển Kết hệ ethyl acetat-aceton-nước (8:1,9:0,1) chọn làm dung mơi khai triển có khả tách tốt Rf thích hợp 32 www.trungtamtinhoc.edu.vn 32 Điều kiện sắc ký:  Cột thủy tinh xốp x 30 cm, xử lí sulfocromic, rửa sạch, sấy khô  Pha tĩnh: Silica gel 60, cỡ hạt 0,015-0,04 mm, khối lượng 150 g  Pha đô ̣ng: Ethyl acetat – aceton – H2O (8:1,9:0,1)  Khối lượng mẫu: 25 g cao A2  Nạp mẫu: Nạp mẫu khơ  Thể tích hứng phân đoạn là: 150 ml  Kiểm tra các phân đoạn bảng sắc ký lớp mỏng tráng sẵn với ̣ dung môi butyl acetat – nước – acid formic (15:5:5), phát hiê ̣n dưới ánh sáng thường, UV 254 nm,  UV 365 nm, thuốc thử FeCl3 5% 33 www.trungtamtinhoc.edu.vn 33 Kết quả: thu công đoạn ghi nhận Phân đoạn Dung môi V (ml) P (g) Thành phần (1-5) Ethyl acetat 100% 750 1,3 Tạp phân cực 300 2,2 600 4,7 1200 5,2 3600 4,3 500 6,2 (6-7) (8-11) (12-19) Ethyl acetat-aceton-nước (8:1,9:0,1) (20-43) MeOH 100% E E F F G G G H Tạp phân cực 34 www.trungtamtinhoc.edu.vn 34 Kết phân lập: A           B           C           D           E         F         G     H         I           J           TP     35 www.trungtamtinhoc.edu.vn 35 Nhận xét:  Phân đoạn (2,2 g) kết tinh nhiều lần methanol thu tinh thể tinh khiết màu vàng tươi DC2 (220 mg) Tinh thể được kiểm tra sắc ký lớp mỏng qua ̣ dung môi khác EtOAc-H2O-HCOOH-CH3COOH (100:10:5:5), EtOAc-aceton-H2O (4:5,5:0,5), CHCl3-HCOOH-CH3COOH (6:2:0,5), butyl acetat-H2O-acid formic (15:5:5), phát TT vanilinsulfuric, TT FeCl3, soi UV 365 nm, UV 254 nm  Phân đoạn (5,2 g) có vết phát quang màu tím đèn UV 365 nm cho màu xanh với TT FeCl3, tiến hành kết tinh phân đoạn nhiều lần methanol cách hòa tan hoàn toàn phân đoạn này lượng vừa đủ methanol, lọc qua phễu thủy tinh xốp Dịch lọc để vào tủ lạnh, cho bay dung môi từ từ, lọc và rửa tinh thể bằng methanol lạnh Tinh thể được kiểm tra sắc ký lớp mỏng qua ̣ dung môi khác EtOAc-H2O-HCOOHCH3COOH (100:10:5:5), EtOAc-aceton-H2O (4:5,5:0,5), CHCl3-HCOOHCH3COOH (6:2:0,5), butyl acetat-H2O-acid formic (15:5:5), phát TT vanilin-sulfuric, TT FeCl3, soi UV 365 nm, UV 254 nm, tinh thể thu vơ định hình màu vàng tươi đặt tên DC3 (800 mg) 36 36 www.trungtamtinhoc.edu.vn  Các phân đoạn cịn lại có nhiều vết nên khơng tiếp tục nghiên cứu • Chất chiết xuất thu từ phân đoạn cột Phân đoạn Chất tinh khiết Đặc điểm Khối lượng (mg) DC2 Vàng tươi 220 DC3 Vàng tươi 800 d) Tóm tắt q trình phân lập chất • Từ 50 g cao A2 tiến hành phân lập flavonoid sắc ký cột chân không (cột cột 2) thu hợp chất tinh khiết DC1, DC2, DC3 với khối lượng tương ứng 34 mg, 670 mg, 800 mg Tiến hành xác định cấu trúc cho kết DC1 quercetin, DC2 quercetin-3-O-α-L-rhamnopyranosid với tên thường gọi quercitrin, DC3 quercetin-3-O-β-D-galactopyranosid 37 www.trungtamtinhoc.edu.vn 37 3.3 Phương pháp HPLC điều chế a) Lựa chọn pha tĩnh • Kỹ thuật sắc ký pha đảo với cột C8 hay C18 lựa chọn • Việc lựa chọn loại cột phù hợp với hợp chất quan tâm phụ thuộc nhiều vào điều kiện thí nghiệm • Do đó, thật khó khăn thiếu hiểu biết nhóm hợp chất cần quan tâm • Việc chạy thử với hay điều kiện cột pha đảo khác mang lại nhiều lợi ích cho ta b) Sự lựa chọn dung mơi • Đối với sắc ký pha đảo, nước sử dụng dung môi yếu dung môi hữu MeOH, MeCN hay THF dung môi mạnh 38 www.trungtamtinhoc.edu.vn 38 c) Điều kiê ̣n HPLC điều chế quercetin • Cô ̣t sắc ký: Chromegabond C8 • Pha đô ̣ng: CH3CN-H2O (30:70) • Thêm giọt H3PO4 1% 250 ml dung mơi pha ̣ng • Bước sóng phát hiê ̣n: 370 nm • Tớc ̣ dòng: 2ml/phút • Thể tích bơm: 20ml • Nhiê ̣t ̣ ̣t: nhiệt độ phịng • Thu gom phân đoạn theo hình dạng peak 39 www.trungtamtinhoc.edu.vn 39 IV Phần kết luận nhận định 4.1 Kết luận • Chiết xuất: từ kg dược liệu chiết ngấm kiệt với cồn 96% thu 54 g cao A2, cao A2 chứa hàm lượng lớn flavonoid • Phân lập: Từ 50 g cao A2 tiến hành phân lập flavonoid sắc ký cột chân không (Cột cột 2) thu hợp chất tinh khiết DC1, DC2, DC3 với khối lượng tương ứng 34 mg, 670 mg, 800 mg • Cấu trúc chất xác định là: quercetin (DC1), quercitrin (DC2), quercetin-3-O-β-D-galactopyranosid (DC3) 4.2 Nhận định • Có thể chiết xuất nhóm Flavonoid tồn phần từ Diếp cá phương pháp ngấm kiệt với cồn 96% phương pháp siêu âm • Có thể phân lập quercetin, quercitrin, quercetin-3-O-β-Dgalactopyranosid sắc ký cột chân không HPLC điều chế 40 www.trungtamtinhoc.edu.vn 40 • Các chất phân lập được xem chất đối chiếu cho mục đích nghiên cứu Diếp cá • Phân lập HPLC có nhiều ưu điểm so với phương pháp sắc ký cột chân không, nhiên cần phải có máy móc đại, điều khơng phải sở sản xuất Dược phẩm đáp ứng được, nên khó áp dụng rộng rãi so với phương pháp sắc ký cột chân không 41 www.trungtamtinhoc.edu.vn 41 Tài liệu tham khảo • • • • • • • • • Bộ môn Dược liệu Đại học Y Dược TPHCM- Bộ môn Dược liệu Đại học Dược Hà Nội (1998), Bài giảng Dược liệu-tập 1, Bộ Y tế Bộ Giáo dục đào tạo, tr.259-289 Bộ môn Thực vật Đại học Y Dược TPHCM (2005), Giáo trình Phân loại thực vật, tr.51 Bộ Y tế (2002), Dược Điển Việt Nam III, Nhà xuất Y Học, tr.350 Đỗ Tất Lợi (2000), Những thuốc vị thuốc Việt Nam, Nhà xuất Y Học, tr.40-41 Hoàng Thanh Hương, Trần Quỳnh Hoa, Hà Việt Bảo, Nguyễn Danh Thục (2002), ‘‘Góp phần nghiên cứu thành phần flavonoid chiết xuất từ Diếp cá Houttuynia cordata Thunb Việt Nam’’, Tạp chí Dược học, Nhà xuất Bộ y tế, Hà Nội, 9, tr.13-15 Phạm Hoàng Hộ (1999), Cây cỏ Việt Nam-quyển 1, Nhà xuất Trẻ, tr.288 Phạm Xuân Sinh, Cao Văn Thu, Đinh Thị Thanh Thủy (1997), ‘‘Nghiên cứu thành phần hóa học Diếp cá’’, Tạp chí Dược học, Nhà xuất Bộ y tế, Hà Nội, 7, tr.7-9 Trần Việt Hưng (1998), Thuốc nam đất Mỹ-tập 1, Nhà xuất HK publishing Co Võ Văn Chi (2004), Tự điển thực vật thông dụng-tập 2, Nhà xuất Khoa học kỹ thuật, tr 1386-1387 42 www.trungtamtinhoc.edu.vn 42 CẢM ƠN THẦY CÔ VÀ CÁC BẠN ĐÃ LẮNG NGHE ! 43 www.trungtamtinhoc.edu.vn 43 DANH SÁCH THÀNH VIÊN • • • • • • • VÕ HUỲNH NHƯ MSSV :12D720401050 CHÂU HẰNG MƠ MSSV :12D720401040 TRƯƠNG KHÁNH LINH MSSV :12D720401033 NGUYỄN THỊ NGỌC MỸ MSSV :12D720401044 NGUYỄN THẢO TRANG MSSV :12D720401079 PHẠM VĂN MINH TÙNG MSSV :12D720401074 VÕ THẾ ÂN MSSV :12D720401002 44 www.trungtamtinhoc.edu.vn 44 ... Chất chiết xuất thu từ phân đoạn cột Phân đoạn Chất tinh khiết Đặc điểm Khối lượng (mg) DC2 Vàng tươi 220 DC3 Vàng tươi 800 d) Tóm tắt q trình phân lập chất • Từ 50 g cao A2 tiến hành phân lập flavonoid. .. thành phần flavonoid chiết xuất từ Diếp cá Houttuynia cordata Thunb Việt Nam’’, Tạp chí Dược học, Nhà xuất Bộ y tế, Hà Nội, 9, tr.13 -15 Phạm Hoàng Hộ (1999), Cây cỏ Việt Nam-quyển 1, Nhà xuất Trẻ,... phân lập flavonoid sắc ký cột 3.3.1.2 .Phân lập flavonoid từ cao A2 SKC chân khơng a) Thăm dị hệ dung mơi sắc ký lớp mỏng b) Phân lập flavonoid sắc ký cột chân không (Cột 1) c) Phân lập flavonoid