Chiết xuất glycosid tim từ lá cây trúc đào và từ hạt của cây thông thiên

Chiết xuất glycosid tim từ lá cây trúc đào và từ hạt của cây thông thiên

Phần một MỞ ĐẦU

1. Lý do chọn đề tài.

Hợp chất thiên nhiên (hay hợp chất tự nhiên) là các chất hóa học có nguồngốc từ thiên nhiên hoặc được con người tách ra từ các loại động vật, thựcvật trong tự nhiên có hoạt tính sinh học hoặc có tác dụng dược học dùng đểlàm thuốc Ngành hóa học chuyên nghiên cứu để chiết tách và chuyển hóacác hợp chất tự nhiên gọi là ngành hóa học các hợp chất thiênnhiên (hay hóa học các hợp chất tự nhiên)

Đây là môn khoa học có ý nghĩa quan trọng không chỉ trong ngành hóa học

mà còn trong y học.Một trong số hợp chất thiên nhiên được biết đến rộng rãitrong y học là nhóm Glycosid tim là một chất có tác dụng đặc hiệu đối vớibệnh tim

Ngày nay với trình độ khoa học kỹ thuật tiên tiến ,việc chiếc xuất thành phầnGlycosid tim ở một số bộ phận của cây (ví dụ ở lá cây trúc đào ,hànhbiển…) và đã thực hiện đại trà trong phòng thí nghiệm ,hay các trung tâmnghiên cứu dược liệu nhằm đáp ứng nhu cầu sản xuất thuốc chữa bệnh timcho con người

Nhằm hiện thực hóa giữa lý thuyết và thực hành ,em chọn đề tài “ chiết xuấtGlycosid tim từ lá cây trúc đào và từ hạt của cây thông thiên ‘’ để nghiêncứu ,tìm hiểu quy trình chiết tách ,định tính và định lượng Glycosid tim cótrong mỗi loại cây

2. Cách thức tiến hành đề tài,phương pháp nghiên cứu

Việc tiến hành đề tài được tiến hành trong quá trình tìm hiểu kĩ các tài liệuHợp chất thiên nhiên ,cơ sở lý thuyết của quá trình chiết tách ,dựa trênphương pháp luận sau :

• Đầu tiên là tìm hiểu vế Hợp chất thiên nhiên nói chung ,các Glycosidtim nói riêng

• Một số tính chất cơ bản của Glycosid tim

• Tìm hiểu một số cây có chứa Glycosid tim và hàm lượng Glycosid timchứa trong đó

• Tìm hiểu các phương pháp chiết tách từ đó đưa ra phương pháp chiếttách glycoside tim cho phù hợp

3.Tầm quan trọng của việc tiến hành đề tài

Đây là một đề tài hay và khó nhưng có ý nghĩa quan trọng ,giúp cho sinhviên có một cái nhìn tổng quan về các Hợp chất thiên nhiên ,cách chiết xuấtcác thành phần có trong Hợp chất thiên nhiên mà cụ thể ở đây là Glycosidtim trong lá trúc đào ,cây thông thiên Từ chiết xuất ,sau đó định tính và địnhlượng nhằm tổng hợp ra thuốc trợ tim phục vụ trong y học ,dược liệu chữabệnh tim cho con người

Phần hai HỢP CHẤT THIÊN NHIÊN CHỨA

GLYCOSID TIM & PHƯƠNG PHÁP CHIẾT XUẤT GLYCOSID TIM TỪ LÁ CÂY TRÚC ĐÀO VÀ CÂY

THÔNG THIÊN Chương 1 TỔNG QUAN VỀ GLYCOSID TIM

1.Định nghĩa Glycosid tim

1.1.Ðịnh nghĩa:

Glycosid tim là những glycosid steroid có tác dụng đặc biệt lên tim ở liềuđiều trị thì có tác dụng cường tim, làm chậm và điều hoà nhịp tim Nếu quáliều thì gây nôn làm chảy nước bọt, mờ mắt, ỉa chảy, yếu các cơ, loạn nhịptim, giảm sức co bóp của tim và cuối cùng làm ngừng tim ở thời kỳ tâm thutrên tim ếch và tâm trương trên động vật máu nóng.Glycosid tim còn đượcgọi là glycosid digitalic vì glycosid của lá cây digitan (Digitalis) được dùngđầu tiên trên lâm sàng để chữa bệnh tim

1.2.Nguồn gốc:

Glycosid tim có trong hơn 45 loài thực vật chủ yếu thuộc các họ:Apocynaceae, Asclepiadaceae, Celastraceae (Dây gối) , Cruciferae,Euphorbiaceae, Fabaceae, Liliaceae, Meliaceae, Moraceae, Ranulculaceae,Scrophulariaceae, Sterculiaceae, Tiliaceae (Ðay), và trong một số côntrùng, ở trong cây glycosid tim có ở các bộ phận: lá, hoa, vỏ thân, rễ, thân rễ,

dò, nhựa mủ

1.3.Cấu trúc hoá học, phân loại

Glycosid tim cũng như các glycosid khác cấu trúc hoá học gồm hai phần:phần đường và phần không đường (aglycon).

có chứa oxy

Vòng lacton : Phần aglycon của glycosid tim ngoài khung hydrocacbon nóitrên thì đặc biệt còn có một vòng lacton nối vào vị trí C-17 của khung Vònglacton này coi là mạch nhánh Hầu hết các chất có tác dụng dược lý đều cóvòng lacton hướng b Dựa vào vòng lacton nối vào vị trí C-17 người ta chiaglycosid tim thành hai nhóm:

- Nếu vòng lacton có 4 cacbon có một nối đôi ở vị trí a-b Những aglyconnào có vòng lacton này có 23 cacbon thì glycosid tim thuộc nhóm cardenolid

- Nếu vòng lacton có 5 cacbon , có hai nối đôi -> aglycon có 24 cacbon->glycosid tim thuộc nhóm bufa dienolid

1.3.2.Phần đường: Phần đường nối vào OH ở C-3 của aglycon Chođến nayngười ta biết khoảng 40 loại đường khác nhau Ngoài những đường thôngthường như D-glucose, L-ramnose, D-fucose, D-xylose có gặp trong nhữngnhóm glycosid khác, còn lại là những đường gặp trong glycosid tim Trongcác đường này đáng chú ý là những đường 2,6-desoxy Dưới đây là một số

Những đường này có các đặc tính sau: dễ bị thuỷ phân, cho phản ứng màuvới thuốc thử Kele-Kiliani, thuốc thử Xanthydrol.

Mạch đường có thể là monosacarit hoặc oligosacarit Gitoxin-xelobiozit cótrong digitan tía có mạch đường với 5 đơn vị đường đơn:

Gitoxin-xelobiozit = Gitoxygenin + (digitoxoza)3 + (glucose)2

Ví dụ, một số genin Glycozit trợ tim thường gặp :

1.4 Tính chất:

- Các glycosid tim là những chất kết tinh, không màu, vị đắng, có năng suấtquay cực, tan trong nước, cồn, không tan trong benzen,ete, - Các glycosidtim rất nhạy cảm với thay đổi pH môi trường., những glycosid tim có đường2-desoxy thì rất dễ thuỷ phân khi đun với acid vô cơ 0,05 N trong metonol

30 phút trong khi những glycosid khác trong điều kiện đó không thuỷ phânđược

Trong môi trường kiềm các cacdenolid chuyển thành các dẫn chất iso và cácdây nối este bị cắt ( nếu có) không hoạt tính Glycosid dễ bị thuỷ phân bởicác enzim.Thường thì các enzim này có sẵn trong cây, có khả năng cắt bớtphần glucose để chuyển thành các glycosid thứ cấp Ví dụ: digilanidazatrong lá digitan lông, digipuapidaza trong lá digitan tía, strophantobiazatrong hạt Strophanthus courmonti, xilarenaza trong Scilla maritima.

1.5.Phân bố : Glycosid tim phân bố hầu hết trong thực vật

Một số dược liệu chứa glycosid tim: Dương địa hoàng, Hành biển, Thôngthiên, Trúc đào, Strophanthus, đay …

Glycosod tim có trong thân ,lá ,quả ,rể ,củ,cành ,vỏ hoặc toàn cây

2.Định tính & Định lượng

2.1.Các thuốc thử định tính và định lượng:

Các thuốc thử để định tính cũng như định lượng chủ yếu dựa trên các thuốcthử tạo màu ở ánh sáng thường hoặc tạo huỳnh quang dưới ánh sáng cựctím

Trước khi tiến hành các phản ứng,

Chiết:

- Loại tạp bằng ete dầu hoả hoặc benzen

- Chiết bằng cồn

- Pha loãng cồn và loại tạp bằng dung dịch chì acetat 15%, lọc

- Chiết glycosid trong dịch lọc bằng cloroform hoặc hỗn hợp

cloroform Bốc hơi dịch chiết rồi hoà glycosid trong dung môi thích hợp để tiến hànhcác phản ứng.

Các thuốc thử có thể chia thành hai loại: loại thuốc thử phản ứng với phầnđường 2-desoxy và loại thuốc thử phản ứng với aglycon

2.2 Các thuốc thử tác dụng lên phần đường:

2.2.1 Thuốc thử Xanthydrol Thuốc thử này dương tính với các đường desoxy và glycosid có đường này Phản ứng cho màu đỏ mận rõ và ổnđịnh.Phản ứng kém nhạy với đường 2-desoxy đã acetyl hoá và âm tính vớiđường 2-desoxy đã nối với glucose ở vị trí 4.Các đường 6-desoxy âm tínhvới thuốc thử này.Phản ứng có thể dùng để định tính và định lượng

2-Thuốc thử gồm 10mg xanthydrol hoà tan trong 99 ml acid acetic đặc vàthêm 1 ml HCl đặc, trộn đều

Tiến hành phản ứng: Lấy khoảng 20-200 mg glycosid cho vào ống nghiệmkhô, thêm 5 ml thuốc thử trộn đều, đậy nút bông, đặt trên nồi cách thuỷ sôi 3phút sau đó làm lạnh bằng cách ngâm 5 phút vào nước đá và để ở nhiệt độphòng 10 phút Ðọc trên quang phổ kế ở bước sóng 550 nm.Ðể định tínhkhông cần làm lạnh

phản ứng có thể tiến hành như sau: Hoà một it glycosid vào metanol, chothêm vài giọt xanthydrol, đun trên nồi cách thuỷ cho khô cạn, hoà cặn vàoacid acetic Sau đó cho thêm acid chlohydric vào và đun sôi trên nồi cáchthuỷ thì có màu đỏ thẫm

2.2.2 Thuốc thử acid photphoric đặc Thuốc thử này dương tính với cácđường 2-desoxy và glycosid có đường này Phản ứng có thể dùng để địnhtính và định lượng

2.2.3 Thuốc thử Kele-Kiliani thuốc thử pha thành hai dung dịch, dung dịch

1 gồm 100 ml acid acetic kết tinh được trộn với 1 ml dung dịch FeCl3 5%.Dung dịch 2 gồm 100 ml H2SO4 đậm đặc trộn với 1 ml dung dịch FeCl35% Hoà tan 5 mg glycosid vào dung dịch 1 và chồng thêm dung dịch 2 Mặtngăn cách có màu đỏ hoặc màu nâu đen và dần dần thì lớp trên có màu xanh

từ dưới khuyếch tán lên.Ðộ nhạy của phản ứng kém thuốc thửxanthydrol.Màu không ổn định

2.3 Các thuốc thử tác dụng lên phần aglycon: các thuốc thử này chia thànhhai nhóm, nhóm phản ứng lên nhân steroid và nhóm phản ứng lên vònglaclon

2.3.1.Xác định phần steroid

2.3.1.1 Phản ứng Libermanm: Hoà một ít glycosid vào vài ml anhydridacetic, rót cẩn thận dung dịch này lên thành mặt kính đồng hồ trong có chứamột ít H2SO4 đậm đặc Lớp anhydrid acetic sẽ có màu xanh vàng sau thànhxanh sáng

Phản ứng Libermanm- Burchard: Phản ứng này không chỉ lên màu vớiglycosid tim mà còn lên màu với nhiều dẫn chất có nhân steroid khác Hoàmột ít glycosid vào vài giọt acid acetic, kết tinh được rồi trộn với hỗn hợpanhydrid acetic và acid sulfuric đặc Sẽ có màu hồng chuyển sang xanh lácây Cơ chế của phản ứng là do sự khử nước của acid mạnh

2.3.1.2 Thuốc thử acid photphoric Acid photphoric ngoài phản ứng với phầnđường 2- desoxy (nt) còn tác dụng lên phần aglycon cho huỳnh quang

2.3.1.3 Thuốc thử Tatgie gồm Acid photphoric, H2SO4 FeCl3

2.3.1.4 Phản ứng Rozenhem: Hoà một ít glycosid vào chloroform, thêmdung dịch acid trichloacetic 90% sẽ xuất hiện màu hồng tím, rồi xanh biển.Xác định phần lacton 5 cạnh chưa no.

Các glycosid và aglycon thuộc nhóm cacdenolid khi cho phản ứng vớinhững dẫn chất nitro thơm ở môi trường kiềm thì tạo nên những sản phẩmmàu đỏ đến tím Phản ứng phụ thuộc vào nhóm metylen hoạt động của vòngbutenolit Một số hợp chất tự nhiên khác có phần cấu trúc tương tự ( b-thuyon, piperitenon, benzalaceton) cũng dương tính với thuốc thử này 2.3.1.5 Phản ứng Baljiet Cho glycosid tác dụng với dung dịch acid picrictrong môi trường kiềm cho màu đỏ da cam do tạo phức Meisenhemer, màutương đối bền nên được dùng để định tính và định lượng Cơ chế của phảnứng do sự tạo thành phức:

2.3.1.6 Phản ứng Kedde: Thuốc thử là dung dịch 3,5-dinitrobenzoic acid 2%trong etanol Chất thử được hoà tan trong etanol, thêm thuốc thử rồi thêmdung dịch xút, phản ứng có màu đỏ tía Màu ổn định, có thể dùng để địnhlượng ( đọc ở bước sóng 540 nm.)

2.3.1.7.Phản ứng Raymond- Mactu: Thuốc thử là m.dinitrobenzen 1% trongcồn tuyệt đối, cũng thực hiện trong môi trường kiềm Phản ứng có màu tím,

có khi xanh, màu không bền

Ngoài những thuốc thử nitro thơm nói trên người ta còn thấyd một số thuốcthử khác như 2,4 - dinitrophenylsunfon, 3,5 - dinitroanizol cũng cho màu vớinhóm cacdenolid

2.3.1.8 Phản ứng Legal: Cho glycosid tác dụng với dung dịch natrinitroprussiat trong môi trường kiềm sẽ xuất hiện màu đỏ, màu mất nhanh

Tiến hành phản ứng: Các chất thuộc nhóm cacdenolit khi hoà vào pyridin rồithêm dung dịch natri nitroprussiat 0,3 - 0,5% sau đó thêm xút 10 -15% đểđảm bảo kiềm thừa sẽ xuất hiện màu đỏ.

Các thuốc thử tác dụng lên vòng butenolid nói trên thì âm tính với các dẫnchất thuộc nhóm bufadienolid.Muốn phát hiên nhóm này có thể dùng thuốcthử SbCl3 trong chloroform, sẽ có màu tím sau khi đun nóng.Tốt nhất là dựavào quang phổ tử ngoại

2.2 Sắc ký:

Ðể xác định , đối chiếu hoặc tách từng chất để nghiên cứu ta có thể tiến hànhsắc ký giấy hoặc sắc ký lớp mỏng Ðể hiện màu có thể dùng các thuốc thử đãnói ở phần trên thường dùng nhất là thuốc thử Keđe ( màu đỏ), thuốc thửRaymon-Mactu ( màu tím) Các dẫn chất có đường 2-desoxy thì dùng thuốcthử xanthydrol

Phổ tử ngoại Nhóm cacdenolid có đỉnh hấp thu cực đại trong vùng 215-218

nm và log e khoảng 4,1; nếu trong phân tử có thêm nhóm cacbonyl thì cóđỉnh hoặc vai ở 272 - 305 nm, còn các chất bufadienolid thì có đỉnh hấp thucực đại ở khoảng 300 nm, loge khoảng 3,7

3.Ứng dụng Glycosid Tim trong dược liệu

3.1.Thuốc loại glycosid (glycosid trợ tim)

Hiện chỉ còn digoxin và digitoxin được dùng ở lâm sàng Digitoxin khácdigoxin là không có OH ở C12 vì thế ít tan trong nước hơn.Các thuốc loạinày đều có 3 đặc điểm chung:

Tất cả đều có nguồn gốc từ thực vật: các loài Digitalis, Strophantus

Cấu trúc hoá học gần giống nhau: đều có nhân steroid nối với vòng lactonkhông bão hòa ở C17, gọi là aglycon hoặc genin, có tác dụng chống suy tim.

Vị trí C3 nối với một hoặc nhiều phân tử đường(ose), không có tác dụngdược lý nhưng ảnh hưởng đến dược động học của thuốc

3.2.Tác dụng của digitalis: Tác dụng trên tim

Đây là tác dụng chủ yếu: digitalis làm tâm thu ngắn và mạnh, tâm trương dài

ra, nhịp tim chậm lại Nhờ đó, tim được nghỉ nhiều hơn, máu từ nhĩ vào thất

ở thời kỳ tâm trương được nhiều hơn, cung lượng tim tăng và nhu cầu oxygiảm Do đó bệnh nhân đỡ khó thở và nhịp hô hấp trở lại bình thường.Digitalis còn làm giảm dẫn truyền nội tại và tăng tính trợ của cơ tim nên nếutim bị loạn nhịp, thuốc có thể làm đều nhịp trở lại

3.3.Các tác dụng khác

Trên thận: digitalis làm tăng thải nước và muối nên làm giảm phù do suytim.Cơ chế của tác dụng này là: một mặt, digitalis làm tăng cung lượng tim,nên nước qua cầu thận cũng tăng; mặt khác, thuốc ức chế ATPase ở màng tếbào ống thận làm giảm tái hấp thu natri và nước

-Trên cơ trơn: với liều độc, ATPase của “bơm” Na + - K+ bị ức chế, nồng

độ Ca++ trong tế bào thành ruột tăng làm tăng co bóp cơ trơn dạ dày, ruột(nôn, đi lỏng), co thắt khí quản và tử cung (có thể gây xảy thai)

- Trên mô thần kinh: digitalis kích thích trực tiếp trung tâm nôn ở sàn nãothất 4 và do phản xạ từ xoang cảnh, quai động mạch chủ

3.4.Chế phẩm và liều lượng

Nồng độ điều trị trong huyết tương là 10 - 25 ng/ mL, nồng độ độc là > 35ng/ mL Liều điều trị: 0,05- 0,2 mg/ ngày.Chế phẩm: viên nén 0,05 và 0,1mg

3.4.2.Digoxin

Nồng độ điều trị trong huyết tương là 0,5 - 1,5 ng/ mL, nồng độ độc là0,2ng/ mL Liều điều trị: 0,125- 0,5 mg/ ngày.Chế phẩm: viên nén 0,125-0,25-0,5mg ống tiêm 0,1- 0,25 mg/ mL

Chương 2 CÁC PHƯƠNG PHÁP CHIẾT XUẤT

2.1 Phân loại các phương pháp chiết xuất

Có nhiều cách phân loại,dựa vào những yếu tố khác nhau

• Dựa vào nhiệt độ có các phương pháp chiết sau :

-Chiết nóng bằng soxhlet hoặc chiết hồi lưu

• Dựa vào áp suất làm việc có các phương pháp sau :

-Áp suất thường (áp suất khí quyển)

-Áp suất giảm (Áp suất chân không)

-Áp suất cao (làm việc có áp lực)

• Dựa vào chiều chuyển động tương hổ giữa hai pha

• Dựa vào những biện pháp kỹ thuật đặc biệt

Có thể rút ngắn thời gian chiết bằng các Phương pháp sau :

-Phương pháp siêu âm

- Phương pháp tạo dòng xoáy

- Phương pháp mạch nhịp

2.2.Một số phương pháp chiết xuất

2.2.1 Phương pháp chiết xuất gián đoạn

2.2.1.1 Phương pháp ngâm

Phương pháp ngâm là phương pháp đơn giản và đã có từ thời xưaTiến hành: sau khi chuẩn bị nguyên liệu ,người ta đổ dung môi ngậpdược liệu trong bình chiết xuất,sau một thời gian rút lấy dịchchiết(lọc hoặc gạn),có thể khuấy trộn để tăng cường hiệu quả chiếtxuất

Có nhiều cách ngâm: ngâm tĩnh hoặc ngâm động,ngâm nóng hoặcngâm lạnh,ngâm một lần hay nhiều lần

• Ưu điểm : là phương pháp đơn giản,thiết bị rẻ tiền

• Nhược điểm :năng suất thấp ,thao tác thủ công,khó chiết hếtdược liệu nếu chỉ chiết một lần

2.2.1.2 Phương pháp ngấm kiệt

Sau khi chuẩn bị nguyên liệu ,người ta đổ dung môi ngập dược liệutrong bình chiết xuất,sau một thời gian rút lấy dịch chiết(lọc hoặcgạn),rút nhỏ giọt dịch chiết ở phía dưới,đồng thời bổ sung dungmôi,cho dung môi chảy chậm.Lớp dung môi ngập dược liệu khoảng 3-

4 cm

• Ưu điểm : dược liệu được chiết kiệt

-Tiết kiệm được dung môi (tái ngấm kiệt)

• Nhược điểm: