Chiết xuất và phân lập saponin từ loài gynostemma burmanicum king ex chakrav

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ PHƯƠNG THÚY MSV: 1101517 CHIẾT XUẤT VÀ PHÂN LẬP SAPONIN TỪ LOÀI GYNOSTEMMA BURMANICUM King ex Chakrav KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI 2016 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI ********* NGUYỄN THỊ PHƯƠNG THÚY MSV: 1101517 CHIẾT XUẤT VÀ PHÂN LẬP SAPONIN TỪ LOÀI GYNOSTEMMA BURMANICUM King ex Chakrav Người hướng dẫn: ThS Thân Thị Kiều My Nơi thực hiện: Bộ môn Dược Liệu HÀ NỘI - 2016 LỜI CẢM ƠN Trong khóa trình thực khóa luận này, nhận hướng dẫn, giúp đỡ tận tình mặt từ thầy cô, bạn bè gia đình Trước tiên, xin gửi lời biết ơn chân thành tới ThS Thân Thị Kiều My, người thầy hướng dẫn, bảo, động viên hỗ trợ suốt thời gian làm khóa luận Tôi xin cảm ơn dược sĩ Nguyễn Thanh Tùng thầy cô, anh chị kĩ thuật viên môn Dược liệu hướng dẫn, tạo điều kiện giúp đỡ hoàn thành khóa luận Tôi xin cảm ơn Ban giám hiệu, phòng Đào tạo, phòng ban thầy cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội tạo điều kiện cho học tập nghiên cứu thời gian học tập trường Cuối cùng, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới cha mẹ, bạn bè chỗ dựa tinh thần vững cho để hoàn thành khóa luận Mong góp ý thầy cô, bạn bè để khóa luận hoàn thiện Trân trọng cảm ơn! Sinh viên Nguyễn Thị Phương Thúy MỤC LỤC Trang ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan chi Gynostemma Blume loài G burmanicum King ex Chakrav 1.1.1 Chi Gynostemma Blume 1.1.2 Đặc điểm thực vật Gynostemma burmanicum King ex Chakrav 1.2 Thành phần hóa học loài chi Gynostemma Blume 1.2.1 Nghiên cứu saponin 1.2.2 Nghiên cứu flavonoid 1.2.3 Một số thành phần hóa học khác 1.3 Tác dụng dược lý 10 1.4 Một số nghiên cứu thành phần hóa học chi Gynostemma Blume Việt Nam 10 1.4.1 Định tính 11 1.4.2 Định lượng 11 1.4.3 Chiết xuất, tinh chế 11 1.4.4 Phân lập 12 CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13 2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị 13 2.1.1 Nguyên liệu 13 2.1.2 Thuốc thử, dung môi, hóa chất 13 2.1.3 Dụng cụ 14 2.1.4 Phương tiện máy móc 14 2.2 Nội dung nghiên cứu 14 2.3 Phương pháp nghiên cứu 15 2.3.1 Định tính nhóm hữu 15 2.3.2 Chiết phân đoạn nhóm chất 15 2.3.3 Phân lập nhận dạng chất phân lập 15 CHƯƠNG III: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 16 3.1 Thực nghiệm kết 16 3.1.1 Định tính nhóm hữu phần mặt đất 16 G burmanicum King ex Chakrav 16 3.1.2 Chiết xuất 18 3.1.3 Định lượng cắn phân đoạn 20 3.1.4 Định tính cắn phân đoạn 20 3.1.5 Phân lập chất phân đoạn n-BuOH 22 3.1.7 Nhận dạng GB-Bu02 29 3.2 Bàn luận 35 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 36 KẾT LUẬN 36 KIẾN NGHỊ 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Giải nghĩa Ký hiệu n-BuOH n-Butanol EtOAc Ethylacetat EtOH Ethanol MeOH Methanol CH2Cl2 Dicloromethan CHCl3 Chloroform HCOOH Acid formic dc Dịch chiết G Gynostemma STT Số thứ tự TT Thuốc thử SKLM Sắc ký lớp mỏng Glu Glucose Rham Rhamnose Xyl Xylose 13 C-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon H- NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton DEPT Distortionless Enhancement by Polarization Transfer ESI-MS Electrospray Ionization – Mass spectrometry HSQC Heteronuclear Single Quantum Coherence HMBC Heteronuclear Mutiple Bond Connectivity Vaninlin/H2SO4 Dung dịch vanillin 1% acid sulfuric 10% UV254 Ánh sáng tử ngoại bước sóng 254 nm UV366 Ánh sáng tử ngoại bước sóng 366 nm DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1: Saponin thường gặp G pentaphyllum (Thunb.) Makino Bảng 1.2: Saponin số loài khác thuộc chi Gynostemma Blume Bảng 3.1 Kết định tính nhóm chất thân G burmanicum King ex Chakrav 16 Bảng 3.2: Hàm lượng cắn phân đoạn phần G burmanicum King ex Chakrav 20 Bảng 3.3: Kết định tính cắn phân đoạn 21 Bảng 3.4 Giá trị Rf GB-Bu02 kiểm tra với hệ dung môi 29 DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1.1: Cấu trúc khung dammaran Hình 1.2: Cấu trúc saponin G.pentaphyllum (Thunb.) Makino Hình 1.3: Các cấu trúc nhóm R7 Hình 1.4: Cấu trúc epoxy dammaran từ G pentaphyllum (Thunb.) Makino Hình 2.1: G Burmanicum tươi thu hái Bắc Cạn 13 Hình 3.1 Sơ đồ tóm tắt quy trình chiết nhóm chất lá, thân G burmanicum King ex Chakrav 19 Hình 3.2: Sắc kí đồ cắn phân đoạn n-BuOH khai triển với hệ dung môi CH2Cl2-MeOH-H2O (4 : : 0.1) 22 Hình 3.3: Sắc kí đồ GB-Bu02 so với cắn B khai triển với hệ 27 CH2Cl2 - MeOH - H2O (3:1:0.1) sau phun thuốc thử màu 27 Hình 3.4: Sắc ký đồ GB-Bu02 kiểm tra với hệ dung môi khác 28 Hình 3.5: Cấu trúc phần aglycon hợp chất GB- Bu02 30 Hình 3.6 Cấu trúc hợp chất GB-Bu02 34 ĐẶT VẤN ĐỀ Trong năm gần đây, xu hướng giới dùng thuốc có nguồn gốc dược liệu ngày tăng tính an toàn, tác dụng không mong muốn lại có giá phù hợp với nhiều đối tượng bệnh nhân Bằng thực nghiệm khoa học, nhiều tác dụng sinh học thuốc chứng minh, nhiều tác dụng mới, hoạt chất tìm từ nhiều quen thuộc Loài Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino với tên thường gọi Giảo cổ lam nhà nghiên cứu dược học Trung Quốc Nhật Bản chứng minh có nhiều tác dụng bật như: hạ lipid máu [44], làm hạ đường huyết [40], chống oxy hóa, bảo vệ gan [21], ức chế số dòng tế bào ung thư [32], [39], Ở Việt Nam, từ năm 1997, GS.TS Phạm Thanh Kỳ cộng bắt đầu nghiên cứu có nhiều đề tài thực hiện, thu nhiều kết quan trọng dược liệu Một số chế phẩm bào chế từ Giảo cổ lam sản xuất lưu hành thị trường trà túi lọc, viên nang cứng, viên nén, viên bao film Giảo cổ lam Miến Điện Gynostemma burmanicum King ex Chakrav chưa nghiên cứu nhiều giới Việt Nam Tháng năm 2015, nhóm nghiên cứu GS.TS Phạm Thanh Kỳ thu mẫu Giảo cổ lam Miến Điện Gynostemma burmanicum Bắc Cạn để nghiên cứu Qua nghiên cứu sơ nhận thấy saponin nhóm hoạt chất loài này, đó, thực đề tài: “Chiết xuất phân lập saponin từ loài Gynostemma burmanicum King ex Chakrav” với mục tiêu: Định tính nhóm chất hữu có mẫu nghiên cứu Chiết xuất xác định hàm lượng cắn phân đoạn Phân lập saponin xác định cấu trúc hóa học chất phân lập CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan chi Gynostemma Blume loài G burmanicum King ex Chakrav 1.1.1 Chi Gynostemma Blume  Vị trí phân loại chi Gynostemma Blume Theo tài liệu [6], [17], [23], chi Gynostemma Blume xếp vào họ Bầu bí (Cucurbitaceae), có vị trí phân loại: Giới thực vật - Plantae Ngành Ngọc Lan - Magnoliophyta Lớp Ngọc Lan - Magnoliopsida Phân lớp Sổ - Dilleniidae Liên Hoa tím - Violanae Bộ Bí - Cucurbitales Họ Bầu bí - Cucurbitaceae Chi Gynostemma Blume  Đặc điểm thực vật phân bố chi Gynostemma Blume Theo Võ Văn Chi [6] Thực vật chí Trung Quốc [23], chi Gynostemma Blume có đặc điểm sau: - Dây leo lâu năm, thân leo mảnh, nhẵn có lông - Lá mọc so le, kép hình chân vịt với 3-9 chét, đơn, phiến hình trứng - giáo Tua chẻ đôi, có tua đơn - Hoa đơn tính, khác gốc, gốc, dạng chùm dạng chùy, dài, hoa đực, mọc nách đỉnh Hoa nhỏ, màu trắng lục nhạt, bắc hình kim, cuống hoa có đốt Hoa đực: đài hoa ngắn, chia thùy hình mũi mác hẹp; tràng tỏa sao, màu xanh nhạt trắng, xẻ thùy sâu, hình mũi mác hình trứng - mũi Makino by liquid chromatography–mass spectrometry", Analytica chimica acta 626(2), p.200-211 29 Karikura M1, Miyase T,Tanizawa H, Takino Y, Hayashi T, (Oct 1990), Studies on absorption, distribution, excretion and metabolism of ginseng saponins V The decomposition products of ginsenoside Rb2 in the large intestine of rats., Chem Pharm Bull (Tokyo) 38(10):2859-61 30 Billah M & Quader MA Khatun M (2012), "Sterols and sterol glucoside from Phylanthus species", Dhaka University Journal of Science 60(1), p.5-10 31 Kawanishi F Kuwahara M, Komiya T, Oshio H, (1989), "Dammarane Saponins of Gynostemma pentaphyllum Makino and Isolation of Malonylginsenosides-Rb1, Rd, and Malonylgypenoside V", Chemical & pharmaceutical bulletin 37(1), p.135-139 32 Huong PT Ky PT, Anh PT, Van Kiem P, Van Minh C, Cuong NX, & Kim YH, (2010), "Dammarane-type saponins from Gynostemma pentaphyllum", Phytochemistry 71(8), p.994-1001 33 Purmova J & Opletal L (1995), "Phytotherapeutic aspects of diseases of the cardiovascular system Saponins and possibllities of their use in prevention and therapy.", Ceska a Slovenska farmacie: casopis Ceske farmaceuticke spolecnosti a Slovenske farmaceuticke spolecnosti 44(5), p.246-251 34 Jeong YT Lee DY, Jeong SC, Lee MK, Min JW, Lee JW, Kim GS, Lee SE, Ahn YS, Kang HC5, Kim JH, (2015), "Melanin Biosynthesis Inhibition Effects of Ginsenoside Rb2 Isolated from Panax ginseng Berry", J Microbiol Biotechnol 35 Kao TH & Chen BH Liu HL (2004), "Determination of carotenoids in the chinese medical herb Jiao-Gu-Lan (Gynostemma Pentaphyllum) by liquid chromatography", Chromatographia 60(7-8), p.411-417 36 Ye W Liu X, Mo Z, Yu B, Zhao S, Wu H & Hsiao WW, (2004), "Five New Ocotillone-Type Saponins from Gynostemma pentaphyllum", Journal of natural products 67(7), p.1147-1151 37 Ni Y & Zhao G Long Z (2010), "Herba Gynostemma on Inhibiting Formation of Mice Bone Marrow Micronuclei Induced by Cyclophosphamide", Journal of Hubei University of Chinese Medicine 3, 009 38 Zhu J Ma YC, Benkrima L, Luo M, Sun L, Sain S, & Plaut– Carcasson YY, (1996), "A comparative evaluation of ginsenosides in commercial ginseng products and tissue culture samples using HPLC", Journal of herbs, spices & medicinal plants 3(4), p.41-50 39 Wei JX Mackay MF, & Chen YG, (1991), "Structure of a new dammarane-type triterpene from Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino", Acta Crystallographica Section C: Crystal Structure Communications 47(4), p.790-793 40 Davies NM Megalli S, & Roufogalis BD, (2006), "Anti-hyperlipidemic and hypoglycemic effects of Gynostemma pentaphyllum in the Zucker fatty rat", J Pharm Pharm Sci 9(3), p.81-91 41 Min-na HOU (2012), "Extraction of Total Flavones from Gynostemma pentaphyllum", Research and Practice on Chinese Medicines 5, 020 42 Jiaqing Cao Dawei Li, Xiuli Bi, Xichun Xia, Wei Li, Yuqing Zhao, (2013), "New dammarane-type triterpenoids from the leaves of Panax notoginseng and their protein tyrosine phosphatase 1B inhibitory activity", Ginseng Research 43 Duke RK Razmovski-Naumovski V, Turner P, & Duke CC, (2005), "(20S)-2α, 3β, 12β-Trihydroxydammar-24-ene 20-O-β-d- glucopyranoside (Gynosaponin TN1) as the 2.5-methanol solvate", Acta Crystallographica Section E: Structure Reports Online 61(5), p.1239-1241 44 Huang THW Razmovski-Naumovski V, Tran VH, Li GQ, Duke CC & Roufogalis BD, (2005), "Chemistry and pharmacology of Gynostemma pentaphyllum", Phytochemistry Reviews 4(2-3), p.197-219 45 Sha Z & Yang J Sun W (1993), "Studies on saponin constituents of Gynostemma longipes", Chin J Herb 24, p.619 46 Chiang TH Tsui KC, Wang JS, Lin LJ, Chao WC, Chen BH, & Lu JF, (2014), "Flavonoids from Gynostemma pentaphyllum Exhibit Differential Induction of Cell Cycle Arrest in H460 and A549 Cancer Cells", Molecules 19(11), p.17663-17681 47 Zhao Y Yang X, Yang Y, & Ruan Y, (2008), "Isolation and characterization of immunostimulatory polysaccharide from an herb tea, Gynostemma pentaphyllum Makino", Journal of agricultural and food chemistry 56(16), p 6905-6909 48 Chen Q Yang Z, Hu L, (2007), "Dammarane-type glycosides from Gynostemma pubescens", Phytochemistry 68(13), p.1752-1761 49 Zhang Y Yin F, Yang Z, Cheng Q, & Hu L, (2006), "Triterpene saponins from Gynostemma cardiospermum", Journal of natural products 69(10), p.1394-1398 50 Zhang LJ Yu HS, Song XB, Liu YX1, Zhang J, Cao M, Kang LP, Kang TG, Ma BP, (2013), "Chemical constituents from processed rhizomes of Panax notoginseng", Article in Chinese 51 Wu GL Zhang L, Chen XY, & Qi GANG, (2002), "Protective effect of gypenosides on cerebral cortex and hippocampus in vascular dementia rat", Chinese traditional and herbal drugs 33(4), p 330-330 PHỤ LỤC I Định tính saponin - Quan sát tượng tạo bọt: Cho vào ống nghiệm 1g dược liệu ml cồn 70° đặt nồi cách thủy 10 phút, lọc nóng dịch chiết cồn Lấy ml dịch lọc cho thêm 10 ml nước cất, lắc mạnh vòng phút để yên 15 phút Quan sát thấy cột bọt bền vững  Phản ứng dương tính - Quan sát tượng phá huyết: Cho 10g bột dược liệu vào 10ml NaCl 0.9%, đun cách thủy 30 phút, lọc nóng lấy dịch lọc Nhỏ giọt máu bò 2% loại fibrin lam kính, đậy lamen Nhỏ giọt dịch lọc vào cạnh lamen Làm đồng thời với lam kính có nhỏ giọt máu bò loại fibrin không nhỏ dịch chiết Quan sát kính hiển vi thấy lam kính có nhỏ dịch chiết, hồng cầu bị phá vỡ dịch chiết ngấm vào Lam kính không nhỏ dịch chiết không thấy tượng  Phản ứng dương tính - Phânbiệt saponin steroid saponin triterpenoid: Lấy khoảng 1g bột dược liệu, chiết EtOH 90% nồi cách thủy 10 phút, lọc nóng dich chiết cồn Cho dịch chiết cồn vào ống nghiệm, ống giọt + Ống 1: thêm ml dung dịch NaOH 0.1 N + Ống 2: Thêm ml dung dịch HCl 0.1 N Lắc mạnh dồng thời ống phút Quan sát thấy cột bọt ống cao ống  Dược liệu có saponin triterpenoid - Xác định số phá huyết: + Pha dung dịch dược liệu 5%: Cân 5g bột dược liệu cho vào bình nón dung tích 100 ml.Thêm vào 50 ml dung dịch đệm phosphate Đun cách thủy 30 phút Lọc nóng qua vào cốc lọc, để nguội, chuyển dịch chiết vào bình định mức 100 ml, bổ sung đệm phosphate cho vừa đủ 100 ml, lắc + Pha dung dịch máu bò 2%: trộn 0.5 ml dung dịch Natri citrate với 4.5 ml máu bò tươi bình nón có nút mài, bảo quản 2-4°C Lấy 20 ml dung dịch đệm phosphate cho vào bình định mức 50 ml Thêm xác ml dung dịch máu bò 2% pha trên, lắc nhẹ, thêm dung dịch đệm phosphate vừa đủ 50ml + Gây tượng phá huyết: Lấy 20 ống nghiệm đánh số thứ tự từ trở đi, bố trí ống nghiệm sau: Dung dịch đệm phosphate (ml) 0,95 0,90 0,10 0,85 0,15 0,80 0,20 0,75 0,25 0,70 0,30 0,65 0,35 0,60 0,40 0,55 0,45 10 0,50 0,50 11 0,45 0,55 12 0,40 0,60 13 0,35 0,65 14 0,30 0,70 STT Dịch chiết dược liệu Dung dịch máu bò 2% 5% (ml) loại fibrin (ml) 0,05 15 0,25 0,75 16 0,20 0,80 17 0,15 0,85 18 0,10 0,90 19 0,05 0,95 20 1,00 0,00 Trộn dung dịch cách bịt đầu ống nghiệm ngón tay dốc ngược dung dịch cách nhẹ nhàng (làm tất với 20 ống nghiệm) Để yên Quan sát tượng phá huyết: Các ống từ 1-20 có màu từ hồng nhạt đến hồng Xác định ống gây phá huyết hoàn toàn (là ống có màu hồng suốt ống trước hồng cầu lắng tủa) ống số 10 Thí nghiệm làm lần kết giống Chỉ số phá huyết làm lần cho kết giống Chỉ số phá huyết tính theo công thức sau: CSPH = / (C.x) Với: C nồng độ dung dịch dược liệu x số ml dung dịch dược liệu cho vào ống nghiệm có phá huyết hoàn toàn Thay vào công thức có CSPH = 80 Kết luận: Trong Giảo cổ lam có chứa saponin triterpenoid có số phá huyết với máu bò 80 điều kiện thí nghiệm Định tính flavonoid Lấy 10g dược liệu cho vào bình nón dung tích 100 ml, chiết với dung môi thêm 50 ml ethanol 90% Đun cách thủy sôi phút Dịch chiết lọc nóng, dịch lọc thu đem đun cách thủy nhiệt độ 80°C Gạn lấy phần dịch, bỏ phần tạp tách đáy bình Phần dịch thu lắc lần với ethylacetat, cho bay dung môi tới cắn, lần ml ethylacetat Gạn lấy phần dịch ethylacetat, cô cách thủy đến cắn Hòa tan cắn ml ethanol 70%, chia vào ống nghiệm nhỏ, thực phản ứng định tính sau: - Phản ứng Cyanidin: Cho vào ống nghiệm ml dịch chiết cồn, thêm bột Mg kim loại, thêm tiếp vài giọt HCl đặc, đun cách thủy Thấy dịch chiết chuyển từ vàng sang đỏ  Phản ứng dương tính - Phản ứng với FeCl3 5%: Cho vào ống nghiệm 1ml dịch chiết cồn, thêm vài giọt dung dịch FeCl3 5% Thấy dịch chiết chuyển sang màu xanh đen  Phản ứng dương tính - Tác dụng với kiềm: Với dung dịch NaOH loãng: Cho ml dịch chiết cồn vào ống nghiệm, thêm vài giọt NaOH 10% Màu vàng dung dịch đậm lên  Phản ứng dương tính Với NH3: Nhỏ giọt dịch chiết lên miếng giấy lọc, hơ khô đặt lên miệng lọ NH3 đặc mở nút Quan sát thấy màu vàng vết dịch chiết đậm lên  Phản ứng dương tính Kết luận: Trong Giảo cổ lam có chứa flavonoid Định tính glycosid tim Cho vào bình nón 250 ml khoảng 20g bột dược liệu, ngâm 80 ml cồn 25° 24 Dịch chiết thu đem loại tạp chì acetat dư Lọc bỏ tủa, dịch lọc thu cho vào bình gạn, lắc lầm với CHCl3 Gạn lấy dịch CHCl3, chia cho ống nghiệm nhỏ, bốc nồi cách thủy đến khô Cắn đem làm phản ứng sau: - Phản ứng Liebermann: Hòa tan cắn ống nghiệm thứ 0.5 ml anhydric acetic Đặt ống nghiệm nghiêng 45°, thêm từ từ 0.5 ml acid H2SO4 đặc theo thành ống nghiệm để dịch lỏng ống nghiệm chia thành lớp Quan sát thấy mặt tiếp xúc lớp chất lỏng xuất vòng tím đỏ  Phản ứng dương tính - Phản ứng Legal: Cắn ống nghiệm thứ đem hòa tan 0.5 ml cồn 90° Thêm giọt nitroprussiat 1% giọt NaOH 10% Không thấy xuất màu hồng ống nghiệm  Phản ứng âm tính - Phản ứng Baljet: Cắn ống nghiệm thứ hòa tan 0,5 ml cồn 90°, thêm thuốc thử Baljet pha (1 phần dung dịch acid picric 1% phần dung dịch NaOH 10%) Không thấy xuất màu vàng cam  Phản ứng âm tính Kết luận: Trong Giảo cổ lam glycosid tim Định tính coumarin Lấy 10g bột dược liệu cho vào bính nón dung tích 100 ml, thêm 50 ml cồn 90°, đun cách thủy sôi phút, lọc nóng qua giấy lọc Dịch chiết thu đem làm phản ứng sau: - Phản ứng đóng mở vòng lacton: Cho dịch chiết vào ống nghiệm nhỏ, ống 1ml Ống 1: thêm 0,5ml NaOH Ống 2: để nguyên Đun ống nồi cách thủy đến sôi thấy ống có tủa vẩn đục, ống Thêm vào ống nghiệm ống ml nước cất.Quan sát thấy ống có tủa vẩn đục, ống  Phản ứng âm tính - Phản ứng Diazo: Cho ml dịch chiết vào ống nghiệm nhỏ, thêm ml dung dịch NaOH 10% Đun cách thủy đến sôi, để nguội Thêm vài giọt thuốc thử diazo, không thấy xuất tủa đỏ gạch  Phản ứng âm tính - Vi thăng hoa: Cho 1g bột dược liệu vào nắp chai nhôm Hơ đèn cồn đến bay hơ dược liệu Đặt lên miệng nắp nhôm lam kính, đẻ miếng ướt Đặt nắp nhôm trực tiếp nguồn nhiệt Sau phút lấy lam kính để nguội, soi kính hiển vi, không thấy tinh thể xuất  Phản ứng âm tính - Quan sát huỳnh quang: Nhỏ giọt dịch chiết lên giấy thấm, nhỏ tiếp lân giọt dung dịch NaOH 5%, sấy nhẹ Che ½ vết đồng xu chiếu tia tử ngoại vài phút, sau cất đồng xu đi, quan sát thấy nửa hình tròn không che nửa hình tròn bị che sáng  Phản ứng âm tính Kết luận: Trong Giảo cổ lam coumarin Định tính Tanin Cho khoảng 5g dược liệu vào bình nón dung tích 100 ml, thêm 20 ml nước Đun sôi trực tiếp phút, lọc qua giấy lọc Cho vào ống nghiệm nhỏ ống 1ml dịch lọc đem làm phản ứng định tính - Ống 1: Thêm giọt dung dịch FeCl3 5% Quan sát thấy xuất màu xanh đen  Phản ứng dương tính - Ống 2: Thêm vài giọt dung dịch đồng acetat 10% Quan sát thấy xuất tủa  Phản ứng dương tính - Ống 3: Thêm ml dung dịch gelatin 2% Không thấy xuất tủa trắng  Phản ứng âm tính Kết luận: Trong Giảo cổ lam tanin Định tính anthranoid Lấy khoảng 1g bột dược liệu cho vào ống nghiệm, thêm 10 ml nước cất, đun sôi trực tiếp 10 phút Để nguội, lọc lấy dịch lọc, thêm ml ether ethylic lắc nhẹ, gạn lấy dịch chiết ether ethylc đem làm phản ứng Borntrarger: Cho ml dịch chiết ether ethylic vào ống nghiệm thêm 10 ml NaOH 10% Không thấy xuất màu hồng  Phản ứng âm tính Kết luận: Giảo cổ lam anthranoid Định tính chất béo, caroten, sterol Ngâm 10g bột dược liệu bình nón ether dầu hỏa, để qua đêm Lọc lấy dịch, đem làm phản ứng sau: - Định tính chất béo Nhỏ giọt dịch chiết ether dầu hỏa miếng giấy lọc, để khô quan sát Không thấy vết đục mờ giấy lọc  Phản ứng âm tính - Định tính caroten: Lấy ml dịch chiết ether dầu hỏa ch vào ống nghiệm nhỏ, bốc cách thủy đến cắn Cho thêm giọt H2SO4 đặc  Phản ứng âm tính - Định tính sterol: Lấy ml dịch chiết ether dầu hỏa, bốc cách thủy tới cắn, cho thêm ml anhydric acetic lắc kỹ Đặt ống nghiệm nghiêng 45° thêm từ từ 0.5 ml H2SO4 đặc theo thành ống nghiệm Mặt tiếp xúc lớp chất lỏng có vòng tròn tím đỏ  Phản ứng dương tính Kết luận: Trong Giảo cổ lam chất béo, caroten, có sterol Định tính đường khử, acid hữu cơ, acid amin Cho 5g bột dược liệu vào ống nghiệm to, thêm 10 ml nước, đun cách thủy 10 phút Lọc lấy dịch lọc đem định tính - Định tính đường khử: Cho ml dịch chiết vào ống nghiệm, thêm giọt thuốc thử Fehling A giọt thuốc thử Fehling B Đun cách thủy phút Quan sát thấy ống xuất tủa đỏ gạch  Phản ứng dương tính - Định tính acid hữu cơ: Cho ml dịch chiết vào ống nghiệm cho thêm tinh thể Na2CO3 Không thấy bọt khí lên  Phản ứng âm tính - Định tính acid amin: Cho ml dịch chiết vào ống nghiệm, nhỏ giọt thuốc thử Ninhydrin 3% Đun cách thủy 10 phút Thấy xuất màu xanh tím  Phản ứng dương tính Kết luận: Trong Giảo cổ lam có đường khử, acid amin, acid hữu Định tính polysaccharid Cho 2g dược liệu vào ống nghiệm to, thêm 10ml nước cất, đun cách thủy sôi phút, lọc nóng Cho vào ống nghiệm: Ống 1: 4ml dịch chiết giọt thuốc thử Lugol Ống 2: 4ml nước cất giọt thuốc thử Lugol Hiện tượng: ống có màu đỏ đậm ống  Phản ứng dương tính Kết luận: Trong Giảo cổ lam có polysaccharid 10 Định tính alkaloid Cho khoảng 3g bột dược liệu vào bình nón dung tích 100ml, thấm ẩm dung dịch NH4OH 0,5N Sau 30 phút thêm 15ml CHCl3 vào, đậy kín Sau 24 giờ, gạn dịch chiết chloroform, lắc dịch chiết với dung dịch acid H2SO4 1N lần, lần 5ml Gộp dịch chiết acid lại với nhau, đem làm phản ứng Ống nghiệm 1: 1ml dịch chiết thêm 2-3 giọt thuốc thử Mayer Không xuất tủa trắng Ống nghiệm 2: ml dịch chiết thêm 2-3 giọt thuốc thử Dragendorff Không xuất tủa cam Ống nghiệm 3: ml dịch chiết thêm 2-3 giọt thuốc thử Bouchardat Không xuất tủa đỏ nâu  Các phản ứng âm tính Kết luận: Giảo cổ lam alcaloid PHỤ LỤC Kết đo phổ chất GB-Bu02 - Phổ MS - Phổ 1H- NMR - Phổ 13C- NMR - Phổ DEPT 135, DEPT 90 - Phổ HMBC - Phổ HSQC PHỤ LỤC [...]... cộng hưởng từ hạt nhân đo trên máy NMR- BRÜKER 500MHz tại phòng Cấu trúc phân tử - Viện hóa học - Viện hàn lâm khoa học và công nghệ Việt Nam 2.2 Nội dung nghiên cứu - Định tính các nhóm chất hữu cơ trong phần trên mặt đất cây G burmanicum King ex Chakrav - Chiết phân đoạn, định tính và xác định hàm lượng cắn các phân đoạn chiết phần trên mặt đất của G burmanicum King ex Chakrav - Phân lập và xác định... pentaphyllum (Thunb.) Makino, G laxum (Wall.) Cogn [5], [6], G longipes C.Y.WU [13], [19], G pedata Blume [7] và G .burmanicum King ex Chakrav [1] 1.1.2 Đặc điểm thực vật của Gynostemma burmanicum King ex Chakrav Theo khóa phân loại chi Gynostemma Blume [23], loài Gynostemma burmanicum King ex Chakrav có đặc điểm thực vật như sau: Cây thảo, mảnh, thân leo có góc - rãnh Toàn thân có nhiều lông mịn bao... với dung môi EtOH 70% theo tài liệu [9], [41] - Chiết phân đoạn: dịch chiết toàn phần lần lượt được chiết với các hệ dung môi hữu cơ có độ phân cực tăng dần: n-hexan, ethylacetat và n-butanol - Xác định hàm lượng cắn các phân đoạn bằng phương pháp cân theo tài liệu “Bài giảng Dược liệu, tập 1” [4] 2.3.3 Phân lập và nhận dạng các chất phân lập được - Phân lập các chất bằng sắc kí cột sử dụng chất hấp... tính rất rõ Nhận xét: Trong thân và lá G burmanicum King ex Chakrav có saponin triterpenoid, flavonoid, sterol, đường khử, acid amin và polysaccharid Trong đó saponin và flavonoid là 2 nhóm chính 18 3.1.2 Chiết xuất Theo tài liệu [26], [31], [32], chúng tôi lựa chọn dung môi để cho hiệu suất chiết xuất tối ưu và hạn chế được nhiều tạp nhất là EtOH 70% bằng phương pháp chiết hồi lưu Dược liệu được làm... tạp và rửa giải trong khoảng nồng độ MeOH từ 50-80% để thu saponin Phương pháp loại được hết chlorophyll và phần lớn flavonoid [16] 1.4.4 Phân lập - Flavonoid: Đã phân lập được ombuin, quercetin, ombuosid, rutin [2] rhamnazin; 5,6-dimethoxi-7,3’,4’-trahydroxyflavon; 3,3’,4’,5,7- pentahydroxyflavon [3] - Saponin: GS.TS Phạm Thanh Kỳ và cộng sự đã phân lập được 7 saponin mới có cấu trúc dammaran từ G... định được hàm lượng saponin toàn phần của 10 mẫu thuộc loài G pentaphyllum thu hái tại các vùng trồng khác nhau ở Việt Nam [18] 1.4.3 Chiết xuất, tinh chế - Chiết xuất: Theo nghiên cứu về phương pháp chiết xuất dược liệu Giảo cổ lam bằng các dung môi hữu cơ, chiết xuất bằng EtOH 70% cho khối lượng cao toàn phần lớn nhất, bước loại tạp bằng dung môi không phân cực trước khi chiết xuất gần như không ảnh... thành phân đoạn D1 - Ống 3 có nhiều vết khác với các ống còn lại, để riêng - Từ ống 4 đến ống 15 cho 2 vết tím đậm, gộp lại thành phân đoạn D2 - Từ ống 16 đến ống 36 không hiện vết gộp lại được phân đoạn D3 Vì D2 cho 2 vết tách nhau khá rõ nên chúng tôi quyết định cất thu hồi dung môi và tiếp tục cô đến cắn được cắn D2 để tiếp tục phân lập  Phân lập lần 3 Phân lập cắn D2 bằng sắc ký cột theo cơ chế phân. .. tục phân lập cắn D 24  Phân lập lần 2 Phân lập cắn D bằng sắc ký cột rây phân tử với chất rây phân tử Sephadex LH-20  Dụng cụ, hóa chất: - Cột sử dụng là ống hình trụ, bằng thủy tinh, chiều dài 80cm, đường kính 1,2 cm, đầu dưới có 1 khóa thủy tinh dùng để điều chỉnh tốc độ chảy - Chất rây phân tử Sephadex LH-20 - Dung môi: MeOH - Dụng cụ hứng: Ống nghiệm loại 5ml Các ống nghiệm được đánh số từ 1... pentaphyllum (Thunb.) Makino Các nghiên cứu về phân lập saponin từ chi Gynostemma chủ yếu tập trung vào loài G pentaphyllum Saponin trong G pentaphyllum còn được gọi là gynosaponin hay gypenosid, hàm lượng gypenosid toàn phần chiếm khoảng 2,4% khối lượng dược liệu khô và đã có hơn 100 loại gypenosid được phân lập [23] Số lượng các gypenosid đã phân lập gấp khoảng 5-6 lần các ginsenosid (thành phần có... không đổi Quy trình chiết xuất được tóm tắt bằng sơ đồ hình 3.1 19 Chuẩn bị dược liệu (100g) EtOH 70% Dịch chiết EtOH Cao đặc Nước khử khoáng Dc nước n-hexan Dc n-hexan Cắn H Dc nước Dc EtOAc EtOAc Cắn E Dc nước Dc n-BuOH n-BuOH Cắn B Dc nước Cắn N Hình 3.1 Sơ đồ tóm tắt quy trình chiết các nhóm chất trong lá, thân của cây G burmanicum King ex Chakrav 20 3.1.3 Định lượng các cắn phân đoạn Cân chính