Chiết xuất, phân lập epigallocatechin gallat từ lá trà xanh (camellia sinensis l ) làm chất đối chiếu

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA  HÙYNH THỊ NGỌC DUNG CHIẾT XUẤT, PHÂN LẬP EPIGALLOCATECHIN GALLATE TỪ TRÀ XANH (Camellia sinensis L.) LÀM CHẤT ĐỐI CHIẾU Chun ngành: CƠNG NGHỆ HĨA HỌC Mã số: 605275 LUẬN VĂN THẠC SĨ TP HỒ CHÍ MINH, tháng 08 năm 2014 Cơng trình hồn thành tại: Viện Kiểm Nghiệm Thuốc TP.HCM Cán hướng dẫn khoa học : TS DS Hà Diệu Ly………………………………… Cán hướng dẫn khoa học: PGS.TS Phạm Thành Quân…………………… Cán chấm nhận xét : TS Nguyễn Thị Lan Phi…………………………… Cán chấm nhận xét : TS Bạch Long Giang……………………………… Luận văn thạc sĩ bảo vệ Trường Đại học Bách Khoa, ĐHQG Tp HCM ngày 20 tháng 08 năm 2014 Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm: PGS TS Phạm Thành Quân TS Nguyễn Thị Lan Phi TS Bạch Long Giang TS Lê Thành Dũng TS Lê Xuân Tiến Xác nhận Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV Trưởng Khoa quản lý chuyên ngành sau luận văn sửa chữa (nếu có) CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG TS Lê Thành Dũng TRƯỞNG KHOA TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA TP.HCM CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM PHÒNG ĐÀO TẠO SAU ĐẠI HỌC Độc Lập – Tự Do – Hạnh Phúc Tp.HCM, ngày tháng 08 năm 2014 NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ Họ tên học viên: HÙYNH THỊ NGỌC DUNG Ngày tháng năm sinh: 17/11/1986 Chuyên ngành : CÔNG NGHỆ HỮU CƠ MSHV : 12050144 TÊN ĐỀ TÀI Chiết xuất, phân lập Epigallocatechin gallat từ trà xanh (Camellia sinensis L.) làm chất đối chiếu NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG Lựa chọn phương pháp chiết xuất epigallocatechin gallat có độ tinh khiết cao phù hợp điều kiện phịng thí nghiệm Phân lập EGCG (+/-) catechin sắc ký cột silica gel Sephadex LH-20 kết hợp với sắc ký lỏng điều chế Thiết lập chất cô lập thành chất đối chiếu theo hướng dẫn ASEAN – WHO theo ISO13528 Khảo sát nhóm hợp chất catechin số sản phẩm thị trường có thành phần chiết xuất từ trà xanh NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: 06/2013 NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 06/2014 HỌ VÀ TÊN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: TS.DS.Hà Diệu Ly, PGS.TS Phạm Thành Quân Tp.HCM, ngày CÁN BỘ HƯỚNG DẪN tháng năm 2014 CHỦ NHIỆM BỘ MƠN ĐÀO TẠO TRƯỞNG KHOA Lời cảm ơn Tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến TS Hà Diệu Ly, cô hướng dẫn cho ý tưởng, động lực giúp đỡ tận tình nghiên cứu, xin cảm ơn PGS.TS Phạm Thành Quân, thầy giúp giải đáp vấn đề phát sinh nghiên cứu, thầy cô hội đồng bảo vệ có nhận xét quý báu cho kết Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến anh chị khoa Thiết Lập Chất Chuẩn & Chất Đối Chiếu – Viện Kiểm Nghiệm Thuốc TP.HCM tạo điều kiện, hết lịng ủng hộ giúp đỡ tơi suốt thời gian làm luận văn Cảm ơn gia đình, bạn bè động viên hỗ trợ tơi hồn thành luận văn TÓM TẮT Trong luận văn này, trà thuộc giống LD 97 dùng làm nguyên liệu cho trình chiết xuất, phân lập acid gallic, EGCG, catechin Quá trình chiết xuất, phân lập thực theo phương pháp trích ly có hỗ trợ siêu âm Kết đạt sau: Phân lập acid gallic, EGCG, (+/-) catechin từ trà xanh điều kiện phịng thí nghiệm Xác định cấu trúc EGCG, acid gallic (+/-) catechin phổ hồng ngoại, phổ tử ngoại phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H, 13C Độ tinh khiết chất xác định phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao, kết sau phân tích phần trăm độ tinh khiết > 95 % Thiết lập, đánh giá chất EGCG, (+/-) catechin thành chất đối chiếu theo ISO 13528 Khảo sát số sản phẩm có chiết xuất từ trà xanh dùng thực phẩm thực phẩm chức lưu hành thị trường ABSTRACT In the thesis, the leaves of LD 97 tea collected from Lam Dong Provin wre extractd isolated EGCG, catechins, gallic acid Experiments were carried out procedure of ultrasonic-assisted extraction method for extracting polyphenols from fresh tea leaves The results were shown: Isolated EGCG, catechins, gallic acid from green tea extraction method by supports ultrasonic Define the structure of EGCG, gallic acid, catechins by infrared, ultraviolet and nuclear magnetic resonance spectroscopic The purity of three substances were determined more than 95 % by high performance liquid chromatography The EGCG, catechins were evaluated their purity foe establishment reference standard according ISO 13528 guide Identification and quantification EGCG, catechins from the finish product containing green tea extracts in market diertary supplements LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực chưa công bố cơng trình khác Huỳnh Thị Ngọc Dung DANH SÁCH TỪ VIẾT TẮT EC: (-) – epicatechin EGC: (-) – epicatechin gallt EGCG: (-) – epigallocatechin gallt GC: (+) – gallocatechin HPLC: High Performance Liquid Chromatography – sắc ký lỏng hiệu cao ODS: Octadecylsilan – cột C18 TPCN: Thực phẩm chức NMR: Nuclear Magnetic Resonance – cộng hưởng từ hạt nhân IR: Infrared – hồng ngoại WHO: World Health Organization ISO/IEC: International Organization for Standardization/ International Electrotechnical Commission DĐVN: Dược Điển Việt Nam SKLM: Sắc ký lớp mỏng DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Cấu tạo acid gallic Hình 1.2: Cấu tạo khung hợp chất catechin Hình 1.3: Cấu tạo chất catechin Hình 3.1: Phổ UV (X2.1) - EGCG Hình 3.2: Cơng thức cấu tạo EGCG Hình 3.3: Phổ UV (X1.1) – catechin Hình 3.4: Cơng thức cấu tạo catechin Hình 3.5: Phổ UV (X1.2) – acid gallic Hình 3.6: Cơng thức cấu tạo acid gallic Hình 3.7: Sắc ký đồ (X2.1) – EGCG Hình 3.8: Sắc ký đồ (X1.2) – acid gallic Hình 3.9: Sắc ký đồ (X1.1) – catechin Hình 3.10: Đồ thị biểu diễn uyến tính EGCG Hình 3.11: Đồ thị biểu diễn uyến tínhcủa catechin Hình 3.12: Chiết xuất từ trà xanh thực phẩm chức Hình 3.13: Sắc ký đồ hỗn hợp chuẩn Hình 3.14: Sắc ký đồ mẫu thử (a) Hình 3.15: Sắc ký đồ mẫu thử (b) Hình 3.16: Sắc ký đồ mẫu thử (c) DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Thành phần hóa học có trà Bảng 2.1: Các tiêu chuẩn phương pháp đánh giá chất đối chiếu EGCG (+/-) catechin Bảng 3.1: Hiệu trích ly phương pháp Bảng 3.2: Dữ liệu phổ 1H – NMR (500 MHz) 13 C – NMR (125 MHz) EGCG aceton d-6 (trị số ngoặc J tính Hz) Bảng 3.3: Số liệu phổ 1H(500 MHz) 13 C – NMR (125 MHz) catechin aceton –d6 Bảng 3.4: Số liệu phổ 1H(500 MHz) C – NMR (125 MHz) acid gallic 13 aceton –d6 Bảng 3.5: Độ tinh khiết chất phân lập Bảng 3.6: Kết kiểm tra tính tương thích hệ thống EGCG (n =6) Bảng 3.7: Kết kiểm tra tính tương thích hệ thống catechin (n =6) Bảng 3.8: Kết kiểm tra tính tương thích hệ thống acid gallic (n =6) Bảng 3.9: Kết khảo sát tuyến tính EGCG (+/-) catechin Bảng 3.10: Kết khảo sát độ EGCG Bảng 3.11: Kết khảo sát độ catechin Bảng 3.12: Kết khảo sát độ thô Bảng 3.13: Kết đánh giá chế phẩm Bảng 3.14: Kết xác định % độ tinh khiết liên phòng Bảng 3.15: Kết đánh giá liên phịng thí nghiệm EGCG theo Anova Hình 5.4: Phổ 13C – NMR (X1.1) – (±) catechin Trang | 17 Hình 5.5: Phổ 13C – NMR (X1.1) - catechin Trang | 18 PHỤ LỤC 6: SẮC KÝ ĐỒ CÁC CHẾ PHẨM Hình 6.1: Sắc ký đồ mẫu trắng Trang | 19 Hình 6.2: sắc ký đồ chế phẩm (X1.1) – (±) catechin Trang | 20 Hình 6.3: Sắc ký đồ chế phẩm (X1.2) - acid gallic Trang | 21 Hình 6.4: Phổ UV độ tinh khiết (X1.2) - acid gallic Trang | 22 Hình 6.5: Phổ UV độ tinh khiết (X1.1) – (±) catechin Trang | 23 Hình 6.6: Phổ UV độ tinh khiết (X2.1) – EGCG Trang | 24 PHỤ LỤC 7: CÁC SỐ LIỆU THAM KHẢO Bảng 7.1: Hàm lượng catechin riêng biệt phận búp trà catechin Lá Lá Lá Lá già Cọng EGC 122,10 152,27 206,42 232,36 222,08 GC 0 0 68,79 EC 45,53 47,84 45,16 45,16 65,65 EGCG 580,54 577,93 431,14 431,14 292,93 ECG 138,52 132,27 103,09 103,09 87,98 Tổng catechin 886,69 910,31 786,11 701,82 737,40 Đơn vị: mg/g chế phẩm chiết EtOAc Bảng 7.2: Hàm lượng số kim lọai có trà ( phương pháp AS) STT Mẫu Al Ca Cu Fe PH1 163±10 3802±152 12.6±1.1 57.2±5.1 LDP1 251±15 4881±222 11.4±1.2 156.8±11.3 Trang | 25 LD97 262±12 4272±258 13.1±1.2 72.3±4.1 HAT 302±18 5598±265 13.6±1.2 59.9±5.4 TB14 129±11 3662±189 12.0±0.9 58.4±5.6 STT Mẫu Mg Mn Pb Zn PH1 658±32 152±11 1.1±0.1 15.8±1.2 LDP1 675±32 212±18 1.2±0.1 14.1±1.1 LĐ7 670±41 144±12 3.5±0.2 12.6±1.2 HAT 703±51 206±14 4.4±0.2 17.0±1.4 TB14 648±36 188±15 0.9±0.1 13.1±1.3 Trang | 26 Phụ lục 8: Tiêu chuẩn chất lượng đánh giá chất đối chiếu (+/-) catechin hydrat C15H14O6 , M = 290,27 Tính chất: Bột màu trắng Định tính:  Phổ IR: phổ mẫu thử KBr phải giống với mẫu chuẩn phù hợp với phổ đối chiếu liệu chuẩn  UV: có bước sóng hấp thu cực đại 280 nm  H, 13C – NMR: phải giống mẫu chuẩn phù hợp với phổ đối chiếu liệu chuẩn Điểm chảy: 2010C Góc quay cực: + 1,20 Độ tinh khiết (HPLC): Khơng 95,0 % tính chế phẩm nguyên trạng  Dung dịch thử: chuẩn bị dung dịch có nồng độ 0,1 mg/ml methanol 70 %, lọc qua màng lọc 0,45 µm  Điều kiện sắc ký Cột Agilent C18 (250 x 4,6 mm µm) Detector PDA bước sóng 280 nm Tốc độ dòng 1,0 ml/phút Trang | 27 Thể tích tiêm 10 µl Pha động: A - dung dịch H3PO4 0,1 %; B – Acetonitril Thời gian A B  10 90  85 10  15 10  20 85  75 15  25 15  30 75  90 25  10 Cách tiến hành:  Kiểm tra tính tương thích hệ thống: cân cột pha động 30 phút Tiêm dung dịch vào hệ thống, hệ số kéo đuôi pic catechin không 1,5, số đĩa lý thuyết không nhỏ 5000  Tiêm riêng biệt lần dung dịch, độ lệch chuẩn tương đối (RSD) diện tích pic lần tiêm khơng lớn 2,0 % Bỏ qua pic sắc ký sắc ký đồ mẫu trắng  Cơng thức tính: Độ tinh khiết (%) = 100 Với: ST: diện tích pic catechin; S: diện tích pic cịn lại trừ pic catechin pic sắc ký đồ mẫu trắng Trang | 28 Phụ lục 9: Tiêu chuẩn chất lượng đánh giá chất đối chiếu EGCG C22H18O11 , M = 458,37 Tính chất: Bột màu trắng ngà Định tính  Phổ IR: phổ mẫu thử KBr phải giống với mẫu chuẩn phù hợp với phổ đối chiếu liệu chuẩn  UV: có bước sóng hấp thu cực đại 280 nm  H, 13C – NMR: phải giống mẫu chuẩn phù hợp với phổ đối chiếu liệu chuẩn Điểm chảy: 2160C Góc quay cực: - 175,50 Độ tinh khiết (HPLC): Khơng 95,0 % tính chế phẩm nguyên trạng Trang | 29  Dung dịch thử: chuẩn bị dung dịch có nồng độ 0,1 mg/ml methanol 70 %, lọc qua màng lọc 0,45 µm  Điều kiện sắc ký Cột Agilent C18 (250 x 4,6 mm µm) Detector PDA bước sóng 280 nm Tốc độ dịng 1,0 ml/phút Thể tích tiêm 10 µl Pha động: A - dung dịch H3PO4 0,1 %; B – Acetonitril Thời gian A B  10 90  85 10  15 10  20 85  75 15  25 15  30 75  90 25  10 Cách tiến hành:  Kiểm tra tính tương thích hệ thống: cân cột pha động 30 phút Tiêm dung dịch vào hệ thống, hệ số kéo đuôi pic EGCG không 1,5, số đĩa lý thuyết không nhỏ 5000  Tiêm riêng biệt lần dung dịch, độ lệch chuẩn tương đối (RSD) diện tích pic lần tiêm không lớn 2,0 % Bỏ qua pic sắc ký sắc ký đồ mẫu trắng  Cơng thức tính: Trang | 30 Độ tinh khiết (%) = × 100 Với: ST: diện tích pic EGCG S: diện tích pic cịn lại trừ pic EGCG pic sắc ký đồ mẫu trắng Trang | 31 ... 30 ( -) -Epigallocatechin gallat – 12 ( -)- Epicatechin gallat 3–6 ( -)- Epigallo catechin 3–6 ( -)- Epicatechin 1–3 ( +)- Catechin 1–2 ( +)- Gallo catechin 3-4 Flavonol flavonol glucoside 3-4 Polyphenolic... Epigallocatechin? ??3 – gallat bốn loại polyphenol tìm thấy nhiều trà xanh, bao gồm epicatechin (EC), epigallocatechin (EGC), epicatechin –3 – gallat (ECG) epigallocatechin? ??3 – gallat (EGCG) EGCG... từ trà xanh (Camellia sinensis L. ) l? ?m chất đối chiếu NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG L? ??a chọn phương pháp chiết xuất epigallocatechin gallat có độ tinh khiết cao phù hợp điều kiện phịng thí nghiệm Phân l? ??p