Chiết xuất, phân lập một số hợp chất stilbenoid và thăm dò tác dụng ức chế cox 2 in vitro của cây nho rừng (vitis heyneana roem schult )

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI PHẠM THỊ THÚY CHIẾT XUẤT, PHÂN LẬP MỘT SỐ HỢP CHẤT STILBENOID VÀ THĂM DÒ TÁC DỤNG ỨC CHẾ COX-2 IN VITRO CỦA CÂY NHO RỪNG (Vitis heyneana Roem & Schult.) LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC HÀ NỘI 2018 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI PHẠM THỊ THÚY CHIẾT XUẤT, PHÂN LẬP MỘT SỐ HỢP CHẤT STILBENOID VÀ THĂM DÒ TÁC DỤNG ỨC CHẾ COX-2 IN VITRO CỦA CÂY NHO RỪNG (Vitis heyneana Roem & Schult.) LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH: DƢỢC LIỆU - DƢỢC HỌC CỔ TRUYỀN MÃ SỐ: 8720206 Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS TS Đỗ Thị Hà TS Hà Vân Oanh HÀ NỘI 2018 LỜI CẢM ƠN Trong thời gian thực luận văn này, nhận đƣợc nhiều quan tâm giúp đỡ thầy cô, nghiên cứu viên Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội Viện Dƣợc liệu, đồng nghiệp, gia đình bạn bè Lời đầu tiên, tơi xin đƣợc bày tỏ lòng kính trọng biết ơn sâu sắc tới PGS TS Đỗ Thị Hà, ngƣời thầy dành thời gian, tâm huyết bảo tơi q trình học tập nghiên cứu khoa học Tôi xin chân thành cảm ơn TS Hà Vân Oanh nhiệt tình hƣớng dẫn, giúp đỡ động viên để tơi hồn thành luận văn Tôi xin cảm ơn giúp đỡ tận tình NCS Phùng Thanh Long nhiệt tình hƣớng dẫn, giúp đỡ để tơi hồn thành luận văn Tơi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới tồn thể bạn đồng nghiệp Khoa Hóa Thực vật-Viện Dƣợc liệu, thầy cô anh chị kỹ thuật viên Bộ môn Dƣợc liệu, Dƣợc học cổ truyền, Thực vật - Trƣờng Đại Học Dƣợc Hà Nội tạo điều kiện giúp đỡ thời gian qua Nhân dịp này, xin chân thành cảm ơn Ban Giám đốc - Viện Dƣợc liệu, Ban Giám hiệu, Phòng Sau Đại học, Thƣ viện Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội tạo điều kiện thuận lợi để tơi hồn thành luận văn Luận văn phần kết thuộc đề tài “Nghiên cứu chế tác dụng chống viêm số hợp chất oligostilbenoid phân lập từ loài Nho dại (Vitis sp.) thu hái miền bắc Việt Nam”, mã số 106-YS.05-2014.26 đƣợc Quỹ Phát triển Khoa học Công nghệ Quốc gia tài trợ Cuối cùng, muốn gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình, bạn bè – ngƣời ủng hộ trong suốt trình học tập vừa qua Tơi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, tháng năm 2018 Học viên Phạm Thị Thúy MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ PHẦN 1: TỔNG QUAN 1.1 Về thực vật 1.1.1 Vị trí, phân loại phân bố chi Vitis 1.1.2 Đặc điểm thực vật loài nho rừng 1.2 Thành phần hóa học 1.2.1 Thành phần hóa học chi Vitis 1.2.2 Thành phần hóa học loài nho rừng 10 1.3 Tác dụng sinh học 11 1.3.1 Tác dụng chống viêm 11 1.3.2 Tác dụng chống oxy hóa 12 1.3.3 Tác dụng kháng khuẩn 13 1.3.4 Tác dụng kháng nấm 13 1.3.5 Tác dụng chống dị ứng 14 1.3.6 Tác dụng giảm đau, hạ sốt 14 1.3.7 Tác dụng chống loét dày 14 1.3.8 Tác dụng chống ung thƣ 15 1.3.9 Tác dụng khác 15 1.4 Một số công dụng nho rừng 16 Tổng quan viêm chế chống viêm liên quan đến ức chế enzym COX-2 16 2.1 Khái niệm 16 2.2 Nguyên nhân 17 2.3 Cơ chế chống viêm 17 PHẦN 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị 20 2.1.1 Ngun liệu 20 2.1.2 Hóa chất, dung mơi 20 2.1.3 Máy móc, thiết bị dụng cụ 21 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 22 2.2.1 Chuẩn bị cao chiết cồn 96% cao chiết phân đoạn từ phần mặt đất nho rừng 23 2.2.2 Thăm dò tác dụng ức chế COX-2 in vitro cao chiết toàn phần cao chiết phân đoạn từ phần mặt đất nho rừng 23 2.2.3 Phân lập hợp chất stilbenoid từ phân đoạn có hoạt tính phần mặt đất nho rừng 25 2.3.4 Thăm dò tác dụng ức chế COX-2 in vitro số hợp chất phân lập đƣợc 25 2.3.5 Xử lý kết thực nghiệm 25 PHẦN 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 26 3.1 Chuẩn bị cao chiết cồn 96% cao chiết phân đoạn từ phần mặt đất nho rừng 26 3.2 Thăm dò tác dụng ức chế COX-2 in vitro cao chiết cồn 96% cao chiết phân đoạn từ phần mặt đất nho rừng 27 3.3 Phân lập hợp chất stilbenoid từ phân đoạn có hoạt tính phần mặt đất nho rừng 28 3.4 Xác định cấu trúc hợp chất phân lập đƣợc 30 3.4.1 Hợp chất VH7 30 3.4.2 Hợp chất VH8 33 3.4.3 Hợp chất VH13 36 3.4.4 Hợp chất VH16 38 3.5 Thăm dò tác dụng ức chế COX-2 in vitro số hợp chất phân lập đƣợc 42 PHẦN 4: BÀN U N 45 4.1 Sàng lọc tác dụng ức chế COX-2 in vitro lựa chọn cao phân đoạn có hoạt tính định hƣớng phân lập hợp chất có tác dụng chống viêm 45 4.2 Nghiên cứu thành phần hóa học 46 4.3 Thăm dò tác dụng ức chế COX-2 in vitro hợp chất tinh khiết phân lập từ phân đoạn ethyl acetat nho rừng 47 ẾT U N 51 IẾN NGHỊ 52 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT bFgF Tác nhân tăng trƣởng (Basic fibroblast growth factor) CE Catechin COX-2 Cyclo oxygenase-2 CTCT Công thức cấu tạo DPPH 1,1-Diphenyl-2-picryl hydrazyl He La Tế bào ung thƣ cổ tử cung (Henrietta Lacks) HepG2 Tế bào ung thƣ gan ngƣời (Human hepatocellular liver carcinoma cell line) HMBC Phổ tƣơng tác dị hạt nhân qua nhiều liên kết (Heteronuclear Multiple Bond Connectivity) HPLC Sắc ký lỏng hiệu cao (High-performance liquid chromatography) HPLC-MS Sắc ký lỏng khối phổ (High-performance liquid chromatography-mass spectrometry) IC50 Nồng độ ức chế 50% (Inhibitory Concentration of 50%) IgE Immunoglobulin E IL-1β Interleukin 1β LDL Lipoprotein trọng lƣợng phân tử thấp (Low density lipoprotein) LPS Lipopolysaccharid MAPK Mitogen-activated protein kinase MIC Nồng độ ức chế tối thiểu (Minimal Inhibitory Concentration) mEq Milliequivalent MS Phổ khối lƣợng phân tử (Mass Spectrometry) NFκB Nuclear factor-kappa B NMR Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance) NSAIDS Thuốc chống viêm không steroid (Nonsteroidal antiinflammatory drugs) SKLM/TLC Sắc ký lớp mỏng (Thin Layer Chromatography) PĐ Phân đoạn PGE Prostaglandin E VH Cao chiết cồn 96% VHH Cao chiết phân đoạn n-hexan VHE Cao chiết phân đoạn ethyl acetat VHW Cao chiết phân đoạn nƣớc TLTK Tài liệu tham khảo TT Thuốc thử DANH MỤC CÁC BẢNG STT Tên bảng Trang Bảng 1.1 Danh sách loài thuộc chi Vitis Việt Nam Bảng 1.2 Một số hợp chất stilbenoid phân lập từ loài thuộc chi Vitis Bảng 1.3 Một số hợp chất flavonoid đƣợc tìm thấy lồi V labrusca V.vinifera Bảng 1.4 Các acid béo hàm lƣợng chúng dầu hạt nho Bảng 1.5 Một số tác dụng sinh học loài thuộc chi Vitis 15 Bảng 3.1 Kết thử tác dụng ức chế COX-2 in vitro cao cồn 96% cao phân đoạn từ phần mặt đất nho rừng 27 Bảng 3.2 Bảng so sánh liệu phổ 1H, 13C-NMR VH7 (-)trans-ε-viniferin 31 Bảng 3.3 Bảng so sánh liệu phổ 1H, 13C-NMR VH8 (+)- 33 α-viniferin Bảng 3.4 Bảng so sánh liệu phổ 1H, 13C-NMR VH13 cisvitisin B 36 Bảng 3.5 Bảng so sánh liệu phổ 1H, 13C-NMR VH16 cisvitisin B 39 Bảng 3.6 Kết thử tác dụng ức chế COX-2 in vitro stilbenoid từ phần mặt đất nho rừng 42 Bảng 4.1 Một số tác dụng sinh học hợp chất phân lập đƣợc 49 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ STT Tên hình Hình 1.1 Cấu trúc hóa học số stilbenoid phân lập từ V Trang 10 heyneana Hình 1.2 Cơ chế tác dụng thuốc chống viêm NSAIDS 18 corticoid Hình 2.1 Ảnh chụp mẫu nghiên cứu 20 Hình 2.2 Sơ đồ thiết kế nghiên cứu 22 Hình 2.3 Sơ đồ chiết cao cồn 96% cao phân đoạn phần mặt đất nho rừng Vitis heyneana Roem & Schult 26 Hình 3.1 Kết sàng lọc tác dụng ức chế COX-2 cao cồn 96% cao phân đoạn từ phần mặt đất nho rừng dòng tế bào đại thực bào RAW 264.7 28 Hình 3.2 Sắc ký đồ dấu vân tay hóa học phần mặt đất nho rừng 29 Hình 3.3 Sơ đồ phân lập hợp chất từ phân đoạn ethyl acetat phần mặt đất nho rừng 30 Hình 3.4 Cấu trúc hóa học hợp chất VH7 33 Hình 3.5 Cấu trúc hóa học hợp chất VH8 35 Hình 3.6 Cấu trúc hóa học hợp chất VH13 38 Hình 3.7 Cấu trúc hóa học hợp chất VH16 42 Hình 3.8 Kết sàng lọc tác dụng ức chế COX-2 stilbenoid từ phần mặt đất nho rừng đại thực bào RAW 264.7 43 Phổ MS VH08 PHỤ LỤC 5: KẾT QUẢ PHỔ 1D, 2D CỦA HỢP CHẤT VH13 Phổ MS VH13 PHỤ LỤC 6: KẾT QUẢ PHỔ 1D, 2D CỦA HỢP CHẤT VH16 Phổ MS VH16 ... mặt đất nho rừng 23 2. 2.3 Phân lập hợp chất stilbenoid từ phân đoạn có hoạt tính phần mặt đất nho rừng 25 2. 3.4 Thăm dò tác dụng ức chế COX- 2 in vitro số hợp chất phân lập đƣợc 25 2. 3.5 Xử lý kết... VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI PHẠM THỊ THÚY CHIẾT XUẤT, PHÂN LẬP MỘT SỐ HỢP CHẤT STILBENOID VÀ THĂM DÒ TÁC DỤNG ỨC CHẾ COX- 2 IN VITRO CỦA CÂY NHO RỪNG (Vitis heyneana Roem & Schult. ). .. 3.4.3 Hợp chất VH13 36 3.4.4 Hợp chất VH16 38 3.5 Thăm dò tác dụng ức chế COX- 2 in vitro số hợp chất phân lập đƣợc 42 PHẦN 4: BÀN U N 45 4.1 Sàng lọc tác dụng ức chế COX- 2 in vitro lựa chọn cao phân