Điện di mao quản và ứng dụng của điện di mao quản trong chiết xuất và phân lập dược liệu

1 PHẦN I TỔNG QUAN PHƯƠNG PHÁP ĐIỆN DI MAO QUẢN ( Capillary Electrophoresis Chromatography ) PHƯƠNG PHÁP ĐIỆN DI MAU QUẢN 1.1.1 Giới thiệu chung phương pháp điện di mao quản - Điện di tượng di chuyển tiểu phân tích điện hòa tan hay phân tán 1.1 chất điện giải có dòng điện qua Cation di chuyển phía cực âm (cathod), anion di chuyển phía cực dương (anod) Các phần tử khơng tích - điện khơng bị hút phía hai điện cực Trong phương pháp điện di mao quản (CE) việc sử dụng mao quản để làm kênh di chuyển cho phép thực trình tách điện di thiết bị so sánh với thiết bị sắc ký lỏng hiệu cao Tuy nhiên, khác biệt rõ rệt cách vận hành, điểm thuận lợi không thuận lợi so với sắc ký lỏng hiệu cao Quá trình vận hành CE điển hình với mao quản mà mặt thành mao quản khơng có lớp bao mao quản chứa dung dịch ″đệm làm việc″, nhóm silanol diện thành phía mao quản thủy tinh giải phóng ion hydrogen vào dung dịch đệm bề mặt thành mao quản tích điện âm pH thấp Cation hay chất hòa tan tích điện dương phần mơi trường bị hút tĩnh điện vào thành mao quản tích điện âm tạo nên lớp điện tích kép Q trình điện di bắt đầu cách đặt chiều dài cột mao quản làm cho phần dung dịch lớp điện tích kép di chuyển phía đầu cathod mao quản kéo theo khối dung dịch Sự chuyển động khối dung dịch tác dụng lực điện trường gọi dòng điện thẩm (electroosmotic flow - EOF) Mức độ ion hóa nhóm silanol thành mao quản phụ thuộc chủ yếu vào pH dung dịch đệm làm việc chất điều chỉnh thêm vào chất điện giải Ở pH thấp, nhóm silanol nói chung có độ ion hóa thấp dòng EOF nhỏ Ở pH cao hơn, nhóm silanol bị ion hóa nhiều dòng EOF tăng Trong số trường hợp, dung môi hữu methanol hay acetonitril cho thêm vào dung dịch đệm để làm tăng độ tan chất hòa tan chất phụ gia hay để ảnh hưởng đến mức độ ion hóa mẫu Nói chung, việc thêm chất điều chỉnh hữu làm giảm dòng EOF Detector đặt phía đầu cathod mao quản D òng EOF thường lớn linh độ điện di Do vậy, anion bị đẩy phía cathod detector Khi sử dụng đệm phosphat pH 7,0 mao quản khơng có lớp bao, thơng thường trình tự xuất chất tan điện di đồ cation, chất trung tính anionNguyên tắc cấu tạo hệ điện di mao quản Phương pháp điện di mao quản đại sử dụng điện trường sinh nguồn cao (hàng chục kV) áp vào mao quản (có đường kính 10 - 150 µm) đầu bơm mẫu, làm cho chất tích điện (trong dung dịch điện ly, có đệm pH thích hợp) di chuyển với tốc độ khác tách khỏi Hình 1.1.2 Sơ đồ thiết bị điện di mao quản 1.1.2 Phân loại điện di mao quản: Điện di mao quản vùng (capillary zone electrophoresis - CZE) gọi điện di dung dịch tự hay điện di mao quản dòng tự Sắc ký mixen điện động, gọi sắc ký điện động mixen (micellar electrokinetic chromatography - MEKC) Điện di mao quản gel (capillary gel electrophoresis - CGE) Điện di mao quản hội tụ đẳng điện (capillary isoelectric focusing - CIEF) Điện di mao quản đẳng tốc (capillary isotachophoresis - CITP) Trong điện di mao quản vùng, q trình tách kiểm sốt khác linh độ tương đối thành phần mẫu thử dung dịch thử Linh độ hàm số điện tích chất phân tích kích thước điều kiện định phương pháp Chúng tối ưu hóa cách kiểm sốt thành phần đệm, pH lực ion Trong sắc ký mixen điện động, chất hoạt động bề mặt thêm vào dung dịch đệm làm việc nồng độ lớn nồng độ mixen tới hạn Các chất phân tích phân bố pha tĩnh giả mixen tạo thành Kỹ thuật thường ứng dụng để tách chất trung tính ion Điện di mao quản gel, tương tự lọc gel, sử dụng mao quản chứa gel để tách phân tử, dựa sở khác tương đối khối lượng phân tử hay kích thước phân tử Nó dùng chủ yếu để tách protein, peptid oligomer Các gel có ưu điểm làm giảm dòng EOF đồng thời làm giảm cách đáng kể hấp phụ protein thành phía mao quản, làm giảm đáng kể hiệu ứng bất đối pic Trong điện di mao quản hội tụ đẳng điện, chất tách sở khác tương đối điểm đẳng điện Nó thực cách biến đổi pH đệm để thu vùng mẫu thử trạng thái bền (pH thấp anod pH cao cathod) Quá trình biến đổi xác lập cách đặt vào mao quản chứa hỗn hợp thành phần chất mang bao gồm chất lưỡng cực có giá trị pI khác Điện di mao quản đẳng tốc sử dụng hai đệm bao quanh vùng chất phân tích Cả anion cation tách thành vùng rõ rệt Ngoài ra, nồng độ chất phân tích vùng Như vậy, chiều dài vùng tỷ lệ thuận với lượng chất phân tích Hai kỹ thuật điện di mao quản thường sử dụng nhiều điện di mao quản vùng sắc ký mixen điện động Chúng đề cập cách tóm tắt phần sau 1.1.3 Cơ sở lý thuyết điện di mao quản Độ điện di (µ) số đặc trưng cho hạt tích điện điều kiện điện di xác định: µ = q/(6.π.η.r.) (1.4) Từ cơng thức (1.4) thấy, độ điện di tỷ lệ thuận với điện tích hạt mang điện (q) tỷ lệ nghịch với độ nhớt dung dịch đệm điện di (η), bán kính hyddrat hạt mang điện (r) Nghĩa là, điện trường E định, chất có điện tích lớn kích thước nhỏ di chuyển nhanh; với chất mang điện có điện tích, chất có kích thước nhỏ di chuyển nhanh hơn; với chất mang điện có bán kính, chất có điện tích lớn di chuyển nhanh 4 1.1.4 Dòng điện di thẩm thấu phương pháp thay đổi dòng điện di thẩm thấu phân cực ngược anion chất phân tích Dòng chảy khối chất lỏng mao quản gọi dòng điện di thẩm thấu (EOF) Trong mao quản Silica khoảng pH điện di ÷ 9, dòng EOF thường hướng theo phương từ Anot (cực dương) Catot (cực âm) Ở điều kiện đó, anion có tốc độ điện di riêng nhỏ tốc độ dòng EOF dòng EOF mang theo phía cực âm Nếu tăng tốc độ dòng EOF làm anion bị theo, di chuyển dòng EOF phía cực âm nên cần phân cực ngược (áp đầu bơm mẫu) để phân tách anion 1.1.5 Các detector thông dụng phương pháp điện di mao quản Tùy thuộc vào mục đích phát hay định lượng, tùy thuộc vào tính chất hóa học, hóa lý, vật lý chất phân tích sử dụng detector tương ứng như: Detector quang học, detector khối phổ, detector điện hóa, detector độ dẫn… Trong detector độ dẫn khơng tiếp xúc (C4D) có ưu điểm đáp ứng với tất hợp phần mang điện, chế tạo thu nhỏ đặc biệt tự chế tạo Việt Nam C4D ứng dụng khoảng 10 năm trở lại đây, trở thành detector phổ biến điện di mao quản 1.1.6 Quá trình xảy mao quản Sự xuất lớp điện kép sát thành mao quản Trong mao quản có dòng điện I (5-200µA) Xuất dòng điện di thẩm thấu, EOF Sự tương tác chất mẫu pha động (MP) với thành mao quản Sự khuếch tán, hay hội tụ vùng mẫu chất, di chuyển Hiệu ứng nhiệt Jun, làm mao quản nóng lên Sự phân tán, gradient truyền nhiệt từ tâm mao quản xung quanh Sự điện di chất (như ion âm, ion dương, phần tử trung bình) - mao quản, tạo phân tách chất 1.1.7 Ứng dụng phương pháp điện di mao quản • Ứng dụng dược phẩm dược liệu: Thường sử dụng phương pháp • MEKC Ứng dụng phân tích dược phẩm: Carbohydrate, Aminoacid, Peptide, Vitamin, Các chất phụ gia thực phẩm • Ứng dụng sinh học: Điện di mao quản kỹ thuật phổ biến sinh học phân tử dùng để nhận điện, định lượng tính protein, DNA/RNA, acid nucleic dựa phương pháp điện di mao quản gel (CGE) 5 PHƯƠNG PHÁP ĐIỆN DI MAO QUẢN ĐIỆN ĐỘNG HỌC KIỂU MICELL 1.2 (MEKC) 1.2.1 Giới thiệu phương pháp MEKC Trong MEKC, môi trường chất điện giải có chứa chất hoạt động bề mặt nồng độ cao nồng độ mixen tới hạn (CMC) Trong môi trường nước, chất hoạt động bề mặt tự ngưng kết hình thành mixen gồm nhóm có đầu thân nước tạo nên lớp áo bên nhóm có khơng thân nước tạo nhân khơng phân cực bên mixen chất tan phân bố Nói chung, mixen có anion bề mặt ngoài, tác dụng điện áp đặt chúng di chuyển theo hướng ngược lại so với dòng EOF Kiểu phân bố tương tự với phân bố chiết xuất với dung môi hay sắc ký lỏng hiệu cao pha đảo Sự phân bố khác phân tử trung tính vào pha động nước pha "tĩnh giả" mixen sở cho trình tách Dung dịch đệm mixen tạo thành hệ thống hai pha, chất tan phân bố hai pha Hệ thống mixen thích hợp cho MEKC phải đáp ứng tiêu chuẩn sau: • Chất hoạt động bề mặt tan tốt đệm dung dịch mixen đồng suốt detector UV • Chất hoạt động bề mặt phổ biến cho MEKC natri dodecyl sulfat (chất • hoạt động bề mặt anion) Những chất hoạt động khác bao gồm cetyltrimethylamoni bromid (chất hoạt động bề mặt cation) muối mật (chất hoạt động bề mặt chiral) • Độ chọn lọc hệ thống MEKC chủ yếu tùy thuộc vào chất chất • hoạt động bề mặt Dung mơi hữu thường thêm vào đệm MEKC để điều chỉnh hệ số dung lượng, tương tự tách HPLC pha đảo • MEKC sử dụng để tách đồng phân đối quang • Để tách đồng phân, dung dịch đệm thêm vào chất phụ gia chiral chất hoạt động bề mặt chiral muối mật Kiến thức chung sắc ký cột cổ điển hỗ trợ cho hiểu biết nguyên lý MEKC Tuy vậy, MEKC, mixen không túy pha tĩnh Bởi vậy, lý thuyết sắc ký cột cần thiết phải điều chỉnh Sự điều nh nguyên lí MEKC chất xác định cửa sổ tách phân tử trung tính Thời gian lưu (t R ) chất trung tính biểu diễn phương trình sau: t R = (1+ k’)t / [1+( t / t MC )] Trong đó, t thời gian yêu cầu chất không lưu giữ qua chiều dài hiệu dụng cột mao quản, t MC thời gian cần để mixen qua mao quản, k ′ hệ số dung lượng t R luôn giá trị t t MC Hệ số dung lượng (k′) chất trung tính tính theo phương trình: k’= (t R / t -1) / (1- t R / t MC ) Trong ký kiệu định nghĩa Để áp dụng cho mục đích thực tiễn, k′ tính phương trình: k’= t R / t - Trong t R thời gian đo từ thời điểm đặt (hoặc điểm bắt đầu tiêm mẫu) đến thời điểm ứng với đỉnh pic tối đa, t0 đo từ điểm đặt (hoặc điểm bắt đầu tiêm mẫu) đến điểm biên phía trước pic dung mơi hay đến tín hiệu chất khơng lưu giữ k ′ MEKC có ý nghĩa định đặc trưng chất tan định hệ MEKC Những bàn luận khác k ′ trình bày phần tính phù hợp hệ thống mục thông số làm việc 1.2.2 Các chất hoạt động bề mặt dùng MEKC Chất hoạt động bề mặt Cơng thức hóa học Nồng độ tới Số phân hạn CMC tử kết tụ (mM) Anion Sodium dodecyl sulfate (SDS) Sodium octyl sulfate (SOS) Cation Hexadecyltrimetylammonium chloride (CTAC) Dodecyltrimethylammonium bromide (DTAB) − C 12 H 25 OSO Na − C H 17 OSO Na + + 8.1 62 136.0 20 + − 1.3 78 + − 15.0 50 C 16 H 35 N (CH ) Cl C 12 H 25 N (CH ) Br Ionic kép (Zwitterionie) Polyoxyethylene –t- + C 12 H 25 (CH ) N CH octylphenol (Triton X-100) CH CH SO Non – Ionie Polyoxyethylene –toctylphenol (Triton X-100) 1.3 1.2 − (CH ) CCH C(CH ) 0.2 143 C H(OCH CH ) 9.5 OH CHIẾT XUẤT VÀ PHÂN LẬP CÁC CHẤT TỪ DƯỢC LIỆU 1.3.1 Chiết xuất Chiết xuất phương pháp sử dụng dung môi để lấy chất tan khỏi mô thực vật Sản phẩm thu trình chiết xuất dung dịch chất hòa tan dung mơi Dung dịch gọi dịch chiết Có ba q trình quan trọng đồng thời xảy chiết xuất là: - Sự hòa tan chất tan vào dung mơi - Sự khuyếch tán chất tan dung môi - Sự dịch chuyển phân tử chất tan qua vách tế bào thực vật Các yếu tố ảnh hưởng lên ba trình (bản chất chất tan, dung môi, nhiệt độ, áp suất, cấu tạo vách tế bào, kích thước tiểu phân bột dược liệu ) định chất lượng hiệu trình chiết xuất Nguyên liệu trước chiết xuất cần kiểm tra mặt thực vật xem có lồi, đơi thứ hay chủng mà ta cần hay không Cần ghi rõ nơi thu hái, thời gian thu hái Tùy theo trường hợp mà đặt vấn đề thời vụ thu hái, để đảm bảo hoạt chất mong muốn có hàm lượng cao Dược liệu sau làm khơ để tươi mà chiết Nhiều hoạt chất rắn dễ bị biến đổi trình làm khơ tươi khơng xử lý để diệt enzym (xem phần ổn định dược liệu) Kích thước bột dược liệu yếu tố quan trọng ảnh hưởng tới chất lượng hiệu q trình chiết Có nhiều kỹ thuật thiết bị chiết khác áp dụng cho hai phương pháp chiết như: chiết nhiệt độ thường (ngâm lạnh, ngấm kiệt nhiệt độ thường) hay nhiệt độ cao (chiết nóng, hãm, sắc, ngấm kiệt nóng); chiết với thiết bị soxhlet, kumagawa tùy yêu cầu, điều kiện mà lực chọn kỹ thuật chiết thích hợp 8 Các phương pháp chiết gồm có ngâm chiết kiệt Trong phương pháp ngâm dược liệu ngâm lượng thừa dung môi thời gian định để chất tan dược liệu hòa tan vào dung mơi Dịch chiết sau rút hết dung môi thêm vào trình ngâm - chiết lập lại lấy hết chất khỏi dược liệu Trong phương pháp ngấm kiệt, dung mội dịch chuyển khối dược liệu theo chiều xác định với tốc độ định Trong trình dịch chuyển, chất tan dược liệu tan vào dung môi nồng độ dung dịch tăng dần bão hòa đầu khối dược liệu Như vậy, ngấm kiệt q trình chiết ngược dòng với nồng độ dịch chiết tăng dần từ đầu tới cuối khối dược liệu Dung môi tiếp xúc với dược liệu có lượng hoạt chất thấp q trình chiết thực hồn tồn Dung môi chiết tùy theo loại họat chất mà chọn cho thích hợp Về nguyên tắc, để chiết chất phân cực (các glycosic, muối alcaloid, hợp chất polyphenol ) phải sử dụng dung môi phân cực Để chiết chất phân cực (chất béo, tinh dầu, carotenoid, triterpen steroid tự ) phải sử dụng dung mơi phân cực Trên thực tế, cồn với độ cồn khác dung mơi hay dùng Cồn hòa tan nhiều nhóm hoạt chất, khơng độc, rẻ tiền dễ kiếm Trong vài trường hợp, dược liệu tươi thả từ từ cồn sôi vừa để diệt enzym vừa để hòa tan hoạt chất Ngoài kỹ thuật chiết cổ điển trên, kỹ thuật chiết chiết với hỗ trợ sóng siêu âm, vi sóng, chiết chất lỏng tới hạn, chiết áp suất cao v.v phát triển để nâng cao hiệu chất lượng chiết xuất Chiết với hỗ trợ siêu âm Trong q trình chiết xuất, đơi sóng siêu âm áp dụng để tăng hiệu chiết Sóng siêu âm với tần số 20 KHz thường sử dụng Sóng siêu âm có tác dụng làm tăng hòa tan chất tan vào dung mơi tăng q trình khuyếch tán chất tan Sóng siêu âm cường độ cao phá vỡ cấu trúc tế bào, thúc đẩy trình chiết Chiết với hỗ trợ sóng siêu âm thường sử dụng tng chuẩn bị mẫu phân tích thay cho phương pháp ngâm lạnh hay chiết Soxhlet cổ điển Khi đó, người ta nhúng bình chiết vào bể siêu âm có chứa nước, sóng siêu âm phát từ đầu phát truyền qua môi trường nước vào hỗn hợp chiết Trong chiết siêu âm, hỗn hợp chiết với dung mơi phân cực nóng lên Tuy nhiên, người ta gia nhiệt để trình chiết nhanh Trong chiết xuất quy mô lớn hơn, đầu phát siêu âm thường nhúng trực tiếp vào bình chiết chứa dược liệu Do khả xuyên sâu nên việc sử dụng thường quy mơ phòng thí nghiệm Chiết với hỗ trợ vi sóng Khi chiếu xạ điện từ tần số 2450 MHz (bức xạ vòng vi sóng dải sóng điện từ) vào mơi trường chất phân cực, phân tử chịu đồng thời tác động: dẫn truyền ion quay lưỡng cực tác dụng điện trường Cả hai tác động làm sinh nhiệt lòng khối vật chất làm cho việc gia nhiệt nhanh hiệu nhiều so với phương pháp dẫn nhiệt truyền thống Trong chiết xuất, chiếu xạ vi sóng vào mơi trường có chứa tiểu phân dược liệu dung môi phân cực, phân tử dung môi chất phân cực dao động nóng lên nhanh chóng làm tăng khả hòa tan chất vào dung mơi Thêm vào đó, vi sóng làm phá hủy cấu trúc vách tế bào thực vật làm chất tan giải phóng trực tiếp vào dung mơi chiết làm cho q trình chiết chuyển thành hòa tan đơn giản Điều làm cho việc chiết xuất nhanh làm dịch chiết nhiều tạp chất Việc sử dụng vi sóng hỗ trợ việc chiết xuất dược liệu quy mơ phòng thí nghiệm áp dụng thay cho chiết xuất truyền thống (như chiết Soxhlet) rút ngắn thời gian chiết xuống từ vài chục giây tới 15-20 phút Cũng có thiết bị chiết vi sóng quy mơ lớn Chiết với hỗ trợ vi sóng có nhược điểm tạp chất dịch chiết nhiều hơn, cần có quy trình loại tạp Thiết bị chiết hỗ trợ vi sóng đặc biệt thích hợp cho tinh cất tinh dầu phương pháp lôi theo nước Thời gian chưng cất rút ngắn đáng kể, hàm lượng tinh dầu thu thường cao chất lượng tốt thời gian tiếp xúc với nhiệt ngắn Cũng có báo cáo chiết xuất nhóm hoạt chất khác phương pháp chiết saponin, anthraquinon, alkaloid Cơ quan Bảo vệ môi trường Mỹ đa chấp thuận sử dụng kỹ thuật vi sóng việc chuẩn bị mẫu cho phân tích chất hữu phân tích môi trường (EPA Method 3546) 10 Chiết chất lỏng tới hạn Những năm gần phương pháp chiết xuất chất lỏng tới hạn (supercritical fluid extraction,SFC) áp dụng để chiết xuất định tính công nghiệp hợp chất tự nhiên Nguyên tắc phương pháp sau: điều kiện áp suất bình thường, nâng nhiệt độ chất lỏng tới điểm sơi nó, chất lỏng hóa Tuy nhiên, tiếp tục tăng nhiệt độ đồng thời tăng áp suất hệ lên nhiệt độ áp suất định đó, người ta thu “chất lỏng” đặc biệt gọi chất lỏng tới hạn Chất lỏng không giống với trạng thái lỏng thông thường mà mang đặc tính chất khí chất lỏng Điểm (ứng với nhiệt độ áp suất) mà chất chuyển từ trạng thái sang trạng thái lỏng gọi điểm tới hạn (critical point) chất Điểm tới hạn nước có nhiệt độ tới hạn (tc) áp suất tới hạn (pc) tương ứng 374,20C 220,5 bar, với carbon dioxid t c = 31,10C pc= 73,8 bar, với ethanol t c = 243,40C pc = 72 bar Do mang đặc tính chất khí chất lỏng nên chất lỏng q tới hạn có khả hòa tan chất đồng thời có độ nhớt thấp khả khuếch tán cao dùng để hòa tan chất ứng dụng vào chiết xuất chất dược liệu Các đặc tính chất lỏng tới hạn (khả hòa tan chất, độ nhớt ) phụ thuộc vào nhiệt độ áp suất Thay đổi điều kiện làm thay đổi đặc tính (độ phân cực, khả hòa tan) chất lỏng tới hạn Trong thực tế, người ta thực chiết điều kiện cao điểm tới hạn Chất lỏng thơng dụng CO lỏng tới hạn CO2có điểm tới hạn thấp, rẻ tiền, không độc hại thân thiện với mơi trường, thu hồi, khơng làm tăng hiệu ứng nhà kính Khi chiết xuất hoạt chất từ dược liệu, CO lỏng tới hạn có lợi dung mơi hữu thơng thường chỗ độc hại, nâng cao hiệu suất không để lại dư lượng dung mơi cao chiết Ngồi q trình chiết xuất tiến hành nhiệt độ thấp nên không làm biến đổi thành phần bền với nhiệt độ Một nhược điểm SFE tính phân cực CO lỏng tới hạn Ở điều kiện chiết thông thường, CO lỏng tới hạn dung môi phân cực, dung để chiết chất phân cực Để cải thiện khả 11 hòa tan chất phân cực hơn, trình chiết xuất, người ta thêm vào CO2 lỏng tới hạn lượng định dung môi phân cực (như methanol) để thay đổi tính phân cực dung môi để chiết chất phân cực Chiết chất lỏng tới hạn ứng dụng nhiều ngành quy mô công nghiệp (từ năm 1978), nghiên cứu phân tích kiểm nghiệm Trong pạm vi nghiên cứu thuốc, tác giả ứng dụng nghiên cứu Stahl cộng [Planta Med , 1980, 40, 12] Các nhóm hợp chất thích hợp để chiết chất lỏng tới hạn tinh dầu, chất béo, carotenoid chất phân cực khác Với tinh dầu, việc chiết CO lỏng tới hạn cho hiệu suất chiết cao, thời gian chiết ngắn không làm hư hỏng chất nhạy cảm với nhiệt độ Tinh dầu thu có hương thơm gần với tự nhiên Người ta dung carbon dioxyd nitrogen oxyd hóa lỏng để chiết xuất nhiều loại hoạt chất alcaloid ví dụ loại cafein hạt Cà phê, chiết thành phần hoa Dương cam cúc – Matricara chamomilla, hoa Cúc trừ sâu – Pyrethrum cinerariifolium Bằng phương pháp chiết hiệu suất pyrethrin nâng lên đến 50% so với phương pháp chiết ether dầu Trong phòng thí nghiệm, SFE dung để chiết mẫu cho phân tích dư lượng thuốc trừ sâu, chất hữu độc hai môi trường Chiết áp suất cao Một kỹ thuật chiết sử dụng chiết suất đại chiết áp suất cao (pressurized liquid extraction – PLE) Khả hòa than chất dung mơi phụ thuộc nhiều vào nhiệt độ Khi nhiệt độ tăng, khả hòa tan chất tăng Vì thế, chiết xuất, người ta có xu hướng tăng nhiệt độ để giảm lượng dung môi sử dụng giả thời gian chiết Tuy nhiên, điều kiện bình thường, việc tăng nhiệt độ để chiết có giới hạn nhiệt độ sơi dung mơi Khi hóa hơi, dung mơi khơng khả hòa tan chất Để khắc phục điều này, người ta tiến hành chiết chất áp suất cao dựa vào nguyên tắc: nhiệt độ sôi chất lỏng tăng áp suất tăng Khi ta có phương pháp chiết chất lỏng áp suất Khi nhiệt độ tăng lên 100C, khả hòa tan dung mơi tăng lên gấp rưỡi Trong chiết áp suất, dung môi chiết đưa tới nhiệt độ áp suất gần với 12 vùng tới hạn Nhiệt độ áp suất cao làm tăng khả hòa tan khuếch tán dung mơi việc chiết xuất hiệu Nhiệt độ thay đổi từ 80 – 2000C áp suất tới 150 bar tùy theo loại dung mơi chất cần chiết So với SFE, PLE có linh hoạt việc lựa chọn dung môi chiết chất giới hạn rộng độ phân cực Các thiết bị không cần đạt áp suất cao nghiêm ngặt SFE nên dễ dàng áp dụng thực tế quy mơ lớn PLE sử dụng thức quy trình chuẩn bị mẫu phân tích thuốc trừ cỏ, thuốc trừ sâu hdrocarbon thơm đa vòng quan bảo vệ mơi trường (EPA Method 3454) Trong nghiên cứu sản xuất dược liệu, PLE sử dụng để chiết quy mơ phòng thí nghiệm, chuẩn bị mẫu phân tích hay chiết chất quy mơ lớn Ví dụ, chiết dioxin toluen toluen + 5% acid acetic (150 0C, 150 bar), chiết chất béo hạt dầu n-hexen (100 0C, 100 bar), chiết hypericin Hypericum perforatum acetonitril (1000C, 100 bar) Một biến thể PLE áp dụng chiết xuất dược liệu chiết nước nóng áp suất (pressurized hot water extraction, PHWE) Do diểm tới hạn nước cao nên PHWE người ta dùng áp suất thấp nhiều (chỉ vào khoảng 20 bar) nhiệt độ thay đổi từ 100 - 200 0C Đặc tính (độ phân cực) nước thay đổi nhiều điều kiện làm cho nước chiết chất phân cực Trong PHWE, phân hủy chất xảy 1.3.2 Phân lập hoạt chất Phân lập tách riêng chất dạng tinh khiết khỏi hỗn hợp Thành phần dược liệu thường phức tạp, nhiều trường hợp, vài chất hỗn hợp toàn phần dược liệu sử dụng làm thuốc, ví dụ, strychnin hạt Mã tiền, vincristin vinblastin Dừa cạn, paclitaxen Taxus, quinin quinidin từ Canh kina Để tách riêng hoạt chất nghiên cứu muốn tách riêng chất để xác định cấu trúc, làm chất chuẩn, nghiên cứu dược lý người ta cần tiến hành phân lập chất dạng tinh khiết 13 Có nhiều phương pháp sử dụng để phân lập chất từ hỗn hợp Có phương pháp kinh điển phương pháp kết tinh phân đoạn, chưng cất phân đoạn hay kỹ thuật sắc ký đại v.v Kết tinh phân đoạn Phương pháp dựa vào độ hòa tan khác chất hòa tan hỗn hợp vào một hỗn hợp dung môi Trong trình để n để dung mơi bốc từ từ, thành phần khó tan tủa kết tinh trước Lọc lấy phần tinh thể thô kết tinh lại thu chất tinh khiết Phần dung dịch lại để bay dung mơi kết tinh để tách chất khác Có thể kết hợp việc bay dung môi với giảm nhiệt độ để q trình kết tinh hiệu Dung mơi dùng để hòa tan/kết tinh phân đoạn thường dung mơi hỗn hợp hay dung môi trường hợp chất khó kết tinh Đối với số nhóm chất đặc biệt, để phân lập người ta tạo dẫn chất tan ví dụ tạo muối picrat alcaloid, tạp osazon đường để chất dễ kết tinh Tách phân đoạn Đối với vài nhóm chất, người ta tách riêng phân đoạn khỏi hỗn hợp dựa vào lý hóa tính khác chất thành phần độ hòa tan dung mơi, tính acid hay base độ mạnh tính acid hay base Ví dụ, hỗn hợp muối alcaloid nước, kiềm hóa từ từ alcaloid có tính kiềm yếu giải phóng dạng tự trước, kiềm hóa tiếp alcaloid có tính kiềm mạnh tiếp tục giải phóng Nếu ta dùng dung mơi hữu để chiết sau giai đoạn thu alcaloid khác Cũng hỗn hợp acid hữu dạng muối giải phóng phân đoạn thêm từ từ acid vô chiết dung môi hữu Thăng hoa Một số chất hay nhóm hợp chất thăng hoa coumarin anthranoid dạng tự (aglycon); cafein, ephedrin, camphor, borneol tách khỏi hỗn hợp hay tinh chế cách cho thăng hoa Q trình thăng hoa thực áp suất thường hay áp suất giảm Khi thăng hoa áp suất giảm, nhiệt độ thăng hoa chất giảm làm giảm bớt tác động phân hủy nhiệt độ lên chất Với dụng thăng hoa áp suất 14 giảm theo dõi áp suất nhiệt độ người ta thăng hoa chất khó hay không thực cách thăng hoa áp suất thường Với dụng cụ người ta phân lập, tinh chế số alcaloid, flavonoid Chưng cất phân đoạn Chưng cất phân đoạn phương pháp kinh điển dùng để tách chất bay khỏi hỗn hợp dựa vào khác biệt nhiệt độ sôi chất hỗn hợp Q trình chưng cất thực áp suất khí hay áp suất giảm Phương pháp chưng cất phân đoạn thực với bình cất có lắp cột phân đoạn thường nối với máy hút chân không để giảm nhiệt độ chưng cất, giảm ảnh hưởng tới chất nhạy cảm với nhiệt độ Nhiệt độ áp suất theo dõi trình chưng cất Phương pháp thường áp dụng để tách chất thành phần tinh dầu Các phương pháp sắc ký Sắc ký điều chế phương pháp sử dụng nhiều đóng vai trò quan trọng nghiên cứu chất tự nhiên Thành phần dịch chiết thực vật thường phức tạp, thường vài chục chất Tính chất chất cần tách thay đổi, từ chất không hay phân cực tới chất phân cực mạnh, từ chất phân tử nhỏ tới đại phân tử Hàm lượng chất hỗn hợp thay đổi, từ vài % tới phần nghìn hay chí số trường hợp Trong trường hợp vậy, phương pháp phân lập cổ điển kết tinh phân đoạn, chưng cất phân đoạn v.v khơng thể đáp ứng Khi đó, kỹ thuật sắc ký sắc ký cột, sắc ký lớp mỏng điều chế, sắc ký lỏng áp suất trung bình, sắc ký lỏng cao áp điều chế sắc ký ngược dòng kỹ thuật lựa chọn sử dụng Các kỹ thuật sắc ký lớp mỏng điều chế, sắc ký lỏng cao áp điều chế, mặt lý thuyết thiết bị đề cập tới phần phuơng pháp đánh giá dược liệu Dưới số kỹ thuật sắc ký khác, đặc trưng cho phân lập chất thường sử dụng nghiên cứu dược liệu Sắc ký cột Sắc ký côt phương pháp sắc ký mà pha tĩnh nhồi cột hình trụ hở đầu tráng lòng mao quản có đường kính hẹp Theo nghĩa rộng, sắc ký cột bao gồm sắc ký cột cổ điển dùng điều chế chất sắc ký cột đại thường dùng phân tích HPLC, GC 15 trình bày kỹ thuật sắc ký cột cổ điển Với kích thước cột lớn, sắc ký cột cổ điển chủ yếu dùng việc chiết tách phân lập chất Trong sắc ký cột cổ điển, người ta thường dùng cột thủy tinh đường kính 5cm dài 30 – 100cm để nhồi pha tĩnh Chất nhồi cột có kích thước từ 15 300µm Kích thước hạt lớn, dung mơi qua cột dễ dàng hiệu tách Với vật liệu nhồi cột Silica gel dùng cho sắc ký cột, người ta thường phân làm loại loại mịn (15 - 40µm), loại vừa (40 - 63µm) loại thơ (63 - 200µm) Lượng mẫu nạp lên cột thay đổi tùy theo tính chất phức tạp mẫu khả tách hệ thống Tỉ lệ mẫu / pha tĩnh thường 1/30 – 1/100 hay Trong vài kỹ thuật, tỉ lệ tăng tới 1/10 Cột triển khai dung mơi thích hợp Dung mơi có chất tách khỏi cột hứng thành phân đoạn, tay hay phận hứng phân đoạn Các phân đoạn kiểm tra sắc ký lớp mỏng phân đoạn giống gộp chung, loại dung môi để thu chất tinh khiết Trong trường hợp sắc ký cột khô hay cột ngược, băng chất tách không rửa giải khỏi cột mà cắt thành “khoang” giải hấp dung môi để thu chất Trong sắc ký cột cổ điển, áp lực đẩy dòng dung mơi qua cột áp suất thủy tĩnh Với cột dài chất nhồi cột mịn, tốc độ dòng dung mơi giảm ảnh hưởng đến kết sắc ký tượng khuyếch tán Thời gian khai triển dài, có nhiều ngày hay Để khắc phục phần nhược điểm này, số kỹ thuật sắc ký cột cải tiến sử dụng giúp giảm thời gian phân tách Tuy nhiên, hiệu lực tách cột giảm Khi người ta thường thu phân đoạn đơn giản để tiếp tục phân tách cột sắc ký khác Hai kỹ thuật hay sử dụng sắc ký cột nhanh (flash chromatography, FC) sắc ký cột chân không (vacuum liquid chromatography, VLC) Cả hai sử dụng cột ngắn đường kính lớn để tăng tốc độ dòng tăng lượng mẫu FC sử dụng áp suất dương thấp đầu cột VLC sử dụng áp suất âm cuối cột Trang bị cho sắc ký cột cổ điển đơn giản, không tốn nên phương tiện chủ yếu để tách chất có thành phần hóa học dược liệu Hiện nay, sắc ký cột cổ điển kỹ thuật cải tiến đóng vai trò việc chiết tách phân lập chất tinh khiết từ dược liệu 16 Sắc ký lỏng áp suất trung bình Để cải thiện khả phân tách chất sắc ký cột phân lập chất, người ta sử dụng sắc ký cột áp suất trung bình (MPLC) MPLC phát triển vào năm 1980 sử dụng cột chịu áp lực có kích thước tương tự sắc ký cột cổ điển nhồi pha tĩnh loại hạt mịn (15 40µm) Cột nhồi áp suất nên có mật độ pha tĩnh cao làm cho khả tách tốt Để có tốc độ dòng tối ưu, áp suất không 40 bar, thường – 20 bar, tạo bơm nén dùng để nén dòng dung mơi chảy qua cột với tốc độ dòng từ ml/phút tới 60 -200 ml/phút tùy theo kích thước cột Lượng mẫu thử cho MPLC thay đổi từ vài chục mg tới 100g Mẫu thử đưa trực tiếp lên đầu cột, sau nối với hệ thống bơm đẩy dung mơi để triển khai hay bơm vào hệ thống qua hệ thống van bơm mẫu Pha tĩnh dùng MPLC pha tĩnh dùng sắc ký cột cổ điển (thường silica gel) hay loại pha đảo (RP) với kích thước tiểu phân thích hợp Cột nạp pha tĩnh RP sử dụng lại nhiều lần Việc thăm dò lựa chọn hệ thống dung mơi thích hợp cho MPLC tiến hành sắc ký lớp mỏng Một hệ dung mơi thích hợp cho MPLC hệ dung mơi có Rf chất cần tách vào khoảng 0,3 sắc ký lớp mỏng Với pha tĩnh RP, sử dụng HPLC phân tích để thăm dò hệ dung mơi Trên thực tế, máy MPLC đại thường có hệ thống dung mơi gồm bơm thay đổi tốc độ dòng phụ kiện (chặn xung, gradient ); hệ thống bơm mẫu với vòng lặp van chuyển; cột MPLC, detector UV, máy tính để điều khiển thiết bị ghi nhận kết quả; hưng phân đoạn So với sắc ký cột cổ điển, hiệu tách MPLC cao Hiệu tách MPLC trung gian sắc ký cột cổ điển sắc ký lỏng cao áp điều chế So với HPLC điều chế, MPLC sử dụng cột lớn nên tách lượng mẫu nhiều Do cột sắc ký tự nhồi chất nhồi cột loại thông thường, dung môi không đòi hỏi chất lượng đặc biệt, thiết bị khơng q phức tạp nên MPLC dễ áp dụng kinh tế so với HPLC điều chế Sắc ký phân bố ngược dòng 17 Trong sắc ký cột cổ điển MPLC, pha tĩnh sử dụng thường chất hấp phụ pha thuận tương đối rẻ tiền thường sử dụng lần Các pha tĩnh thích hợp với chất từ phân cực tới phân cực trung bình Trong trường hợp phân tích hỗn hợp phức tạp, chất phân cực mạnh glycosid có mạch đường dài, polyphenol, alcol, acid phân tử nhỏ v.v pha tĩnh hấp phụ thường không cho kết tốt Khi ấy, người ta thường sử dụng chế phân bố để tách chất Các pha tĩnh phân bố sử dụng HPLC (thường pha đảo) thích hợp trường hợp Tuy nhiên, pha tĩnh thường đăt tiền, sử dụng sắc ký điều chế thật cần thiết Để cải thiện khả phân tách chất phân cực, người ta phát triển phương pháp sắc ký phân bố ngược dòng (Countercurent chromatography, CCC) Sắc ký phân bố ngược dòng phương pháp sắc ký pha tĩnh pha động trạng thái lỏng Do không sử dụng giá mang rắn nên sắc ký phân bố ngược dòng loại trừ khó khăn thường gặp phương pháp sắc ký pha tĩnh rắn mẫu hay phân hủy mẫu Sắc ký phân bố ngược dòng phương pháp có khả tách chất phân cực hiệu quả, hệ dung môi dùng cho pha tĩnh pha động linh hoạt, rẻ tiền tiến hành phân tích lượng mẫu lớn thời gian tương đối ngắn Khác với HPLC hay kỹ thuật sắc ký cột pha tĩnh lỏng mà pha tĩnh thường giữ giá mang rắn, pha tĩnh sắc ký phân bố ngược dòng chất lỏng theo nghĩa Hai chất lỏng hay hỗn hợp chất lỏng không đồng tan ‘dịch chuyển’ ngược chiều tiếp xúc liên tục với Trong trình dịch chuyển, chất hỗn hợp mẫu cần phân tích hòa tan cách cạnh tranh vào pha tĩnh pha động Mức độ hòa tan chất pha phụ thuộc vào hệ phân bố tronng pha Các chất có hệ số phân bố khác phân bố vào pha động pha tĩnh với tỉ lệ khác trình dịch chuyển pha động tách khỏi Trong trình pha động dịch chuyển, phân bố chất pha diễn ra, chất hỗn hợp mẫu ( đuợc đưa vào đầu pha tĩnh) dịch chuyển dần cuối pha tĩnh tách khỏi Các chất có hệ số phân bố pha động lớn tách trước pha động khỏi hệ thống trước tiên Chất có hệ số k lớn sớm Các chất có hệ số phân bố pha tĩnh lớn 18 tách khỏi dịch chuyển pha tĩnh phía cuối cột Đến thời điểm đó, chất tan nhiều pha động tách khỏi hệ thống, người ta ngừng không đưa pha động vào mà dùng pha tĩnh để đẩy phần chất lỏng hệ thống Các chất tách pha tĩnh hứng thành phân đoạn riêng biệt Các chất tách hệ tôt “số đĩa lý thuyết” hệ lớn, tức tiếp xúc dung môi chiều dài “cột” (pha tĩnh) lớn Hệ dung môi sử dụng sắc ký phân bố ngược dòng thường hỗn hợp hay nhiều (thường khơng q 4)dung mơi có khả hòa tan hạn chế vào Khi tỉ lệ dung mơi vượt q giới hạn hòa tan, chúng tách thành pha với tỉ lệ dung mơi pha hồn tồn khác Hai pha sử dụng làm pha động pha tĩnh sắc ký phân bố ngược dòng Ví dụ, với hỗn hợp hai dung mơi n-butanol nước 300C, tỉ lệ hai dung môi vượt khả hòa tan vào tách thành hai lớp chất lỏng riêng biệt n-butanol bão hòa nước (với lượng nước 7% kl/kl) nước bão hòa n-butanol (với lượng n-butanol ~ 21% kl/kl) Để hỗn hợp chất lỏng “đứng yên” làm pha tĩnh, người ta cần có thiết bị đặc biệt Thiết bị tách phân bố đơn giản sử dụng tách hỗn hợp chất thiết bị Phân bố ngược dòng (Countercurrent distribution – CCD) L C Craig thiết kế vào năm 1940 Thiết bị gồm nhiều phận ống thủy tinh có thiết kế đặc biệt để chứa pha tĩnh pha động, vận hành chuyển pha động từ ống sang ống khác Mỗi ống chiết đuợc xem đĩa lý thuyết Nhược điểm thiết bị số đĩa không nhiều nên khả tách tương đối hạn chế thiết bị tương đối cồng kềnh Ngày nay, có số thiết bị sắc ký phân bố ngược dòng với số đĩa lý thuyết lớn hơn, gọn dễ sử dụng sử dụng phòng thí nghiệm Sắc ký ngược dòng giọt nhỏ (Droplet countercurrent chromatography – DCCC) Yoichiro Ito cộng giới thiệu vào năm 1970 DCCC sử dụng ống nhỏ có đường kính -4 mm chiều dài 40cm Các ống (khoảng 300 ống) xếp đứng song song với nối với qua hệ thống ống teflon với đầu ống nối vào cuối ống Pha động dịch chuyển qua pha tĩnh dạng hạt nhỏ lên hay chìm xuống pha 19 tĩnh (tùy thuộc vào pha động nặng hay nhẹ pha tĩnh) Nhược điểm DCCC tốc độ chậm hiệu tách chưa cao tiếp xúa pha Sắc ký phân bố ly tâm (Centrifugal partition chromatography –CPC) hay gọi Sắc ký ngược dòng giọt nhỏ ly tâm (Centrifugal droplet countercurrent chromatography – CDCCC) tương tự DCCC dòng pha động bơm vào với tốc độ cao ( tới 100 lần so với DCCC) nhờ tác động lực ly tâm Thiết bị gồm ống polymer chịu dung môi (như teflon) nối với giống DCCC xếp theo hướng từ tâm trục quay Khi vận hành, ống quay quanh trục lực ly tâm giữ chop tĩnh ống Pha tĩnh bơm vào hệ thống theo hướng từ tâm với pha động nặng hay ngược lại với pha tĩnh nhẹ Do khả tiếp xúc dung mơi tốt nên CDCCC có số đĩa lý thuyết lớn Tốc độ phân tách CPC nhanh so với DCCC Hệ thống sắc ký phân bố ngược dòng tốc độ cao (High speed countercurrent chromatography – HSCCC) hệ thống Y Ito phát triển vào năm 1980 sử dụng nhiều thiết bị sắc ký phân bố ngược dòng hiệu phân bố cao tốc độ phân tách nhanh Cũng giống DCCC, HSCCC sử dụng lực ly tâm để giữ chất lỏng hệ thống làm pha tĩnh chất lỏng lại bơm vào hệ thống làm pha động Thiết bị HSCCC bao gồm ống nhựa teflon với đầu ống dùng làm đầu vào đầu đầu hệ thống Đầu vào đầu hệ thống đảo ngược tùy theo pha động nặng hay nhẹ so với pha tĩnh Ống cuộn xoắn lại theo kiểu lò xo hay xoắn ốc, vừa quay quanh trục đồng thời xếp để quay quanh trục chung theo kiểu chuyển động hành tinh quanh mặt trời Tùy theo thiết kế mà thiết bị có số lượng cuộn cách đặt cuộn có khác Trong đó, loại thiết bị có cách xếp cuộn xoắn theo ‘kiểu J’ phổ biến sử dụng nhiều Trong phân lập chất dược liệu, để việc phân lập hiệu hơn, đặc biệt với hỗn hợp phức tạp có cấu trúc gần giống nhau, người ta thường sử dụng phối hợp phương pháp sắc ký với chế tách khác Ví dụ, phân tách cao chiết thành phân đoạn đơn giản phương pháp sắc ký cột cải tiến (FC, VLC) sau tách sắc ký cột cổ điển với loại pha 20 tĩnh khác nhau, sắc ký rây phân tử, MPLC HPLC điều chế Việc áp dụng phương pháp nên dần từ đơn giản đến phức tạp, từ phương tiện, pha tĩnh rẻ tiền tới loại có giá thành cao PHẦN II LÝ THUYẾT ỨNG DỤNG ĐIỆN DI MAO QUẢN TRONG CHIẾT XUẤT VÀ PHÂN LẬP DƯỢC LIỆU (5 trang) 21 * Tài liệu liên quan: (10 – 20 tài liệu) Thơng tin tài liệu Nội dung (tóm tắt pp nghiên cứu, chi tiết hóa kết đạt được) "Điện cực mao mạch điện cực ion hóa ion trap Chi tiết: Phát morphine codeine chùm khối lượng để phân tích xác nhận thử chất chuyển hóa từ đến 10 ppm nghiệm morphine hợp chất có liên quan từ đến ppm thông qua phát khối nước tiểu ", 2001 AB Wey T lượng CE + Mass Spectrometric Wolfgang, J Chromatogr khơng có tập trung trước v916; 225-238 "Phân tích đồng thời số dẫn chất Chi tiết: 20 đến 70 ppb xác định amphetamine nước tiểu điện di amphetamines thông qua phát phổ mao mạch nong lỏng hồng ngoại khối phổ sau tập với quang phổ khối lượng điện ion hóa trung lỏng / lỏng điện "2000, L Geiser, S Cherkaoui J.-L Veuthey J Chromatogr A ;; v895; 111-121 "Nhóm máu gõ điện di dựa tập Chi tiết: Tách protein enzyme trung"; 1999; M Kanea, A Nishimurab K máu cách sử dụng tập trung Nishi; Anal Cái cằm Acta; v383; 157-168 CE "So sánh độ phân giải DNA mạch kép Chi tiết: 200 đoạn DNA cặp base với sợi đơn điện di mao khác cặp sở mạch"; 1997; M J van der Schans AWHM phân tách 7phút Kuypers, AD Kloosterman, HJT Janssen FM Everaerts; J Chromatogr A ,; V772; 255264 PHẦN III ĐÚC KẾT LẠI TRONG NGHÀNH DƯỢC Ở VIỆT NAM ĐỀ XUẤT PHƯƠNG PHÁP CÓ THỂ ỨNG DỤNG VÀO DƯỢC LIỆU Ở VIỆT NAM NHƯ THẾ NÀO (5 trang) 22 Tài liệu tham khảo: https://books.google.com.vn/books? hl=vi&lr=&id=lG6UcaKFJpgC&oi=fnd&pg=PP1&dq=Capillary+electrophoresis+in+ extraction+and+isolation+of+materia+medica&ots=u145sJmZp&sig=B2pQ4JluXckN-3eAXlw1blxkzA8&redir_esc=y#v=onepage&q&f=false https://www.agilent.com/cs/library/primers/Public/5990_3777EN.pdf - Karger, Basel (1989) Baldo BA In Chrambach A, Dunn M, Radola BJ Eds Advances in Electrophoresis VCH, Weinheim (1994) 409–478 - Banks R Dunn MJ, Forbes MA, Stanly A, Pappin DJ, Naven T, Gough M, Harnden P, Selby PJ Electrophoresis 20 (1999) 689–700 - Barros F, Carracedo A, Victoria ML, Rodriguez-Calvo MS Electrophoresis 12 (1991) 1041– 1045 - Baumstark M, Berg A, Halle M, Keul J Electrophoresis (1988) 576–579 Bayer EA, BenHur H, Wilchek M Anal Biochem 161 (1987) 123–131 - Graham Kemp, Điện di mao mạch: gia đình đa kỹ thuật phân t- ch Archived ngày 27 tháng năm 2006, Wayback Machine Cơng nghệ sinh học Hố học Ứng dụng (1998) 27, (9-17) - Skoog, DA; Holler, FJ; Crouch, SR "Các Nguyên Tắc Phân Tích Cụ Thể" 6th ed Thomson Brooks / Cole Xuất bản: Belmont, CA 2007 - Skoog, DA; Holler, FJ; Crouch, SR "Các Nguyên Tắc Phân Tích Cụ Thể" 6th ed Chương 30 Thomson Brooks / Cole Xuất bản: Belmont, CA 2007 - Dovichi, Norman (2000) "Phương pháp điện di mao mạch giải mã trình tự gen người nào" (PDF) Angewandte Chemie International Edition 39 : 4463-4468.doi : 10.1002 / 1521-3773 (20001215) 39:24 3.0.co, 2-8 Truy lục 2014-04-09 - Butler, John (2004) "Nhập DNA pháp y điện di mao mạch sử dụng máy phân tích di truyền ABI Prism 310 3100 để phân tích STR" (PDF) Điện di 25 : 13971412 doi : 10.1002 / elps.200305822 PMID 15188225 Truy lục 2014-04-09 - Lin H ; Natan, M; Keating, C Anal Chem 2000 , 72 , 5348-5355 - Hjertén, Stellan (1985) "Điện di hiệu suất cao: loại bỏ thẩm thấu điện hấp phụ hòa tan" Tạp chí Chromatography (347): 191-198 - Doherty EA, Meagher RJ, Albarghouthi MN, Barron AE (2003) "Vách ngăn microchannel để phân tách protein phương pháp điện di mao mạch điện di" Điện di 24 : 3454 doi : 10.1002 / elps.200390029 PMID 12652571 23 - Mandabhushi, Ramakrishna (1998) "Tách sản phẩm mở rộng trình tự DNA màu mao mạch phủ khơng ăn mòn dung dịch polymer có độ nhớt thấp".Điện di 19 : 224-230 doi : 10.1002 / elps.1150190215 PMID 9548284 - Khám phá Mục tiêu "Lớp phủ chống tĩnh điện UltraTrol ™" Truy lục vào ngày tháng năm 2014 - Skoog, DA; Holler, FJ; Nieman, TA "Nguyên tắc Phân tích Phương pháp, 5th ed." Trường cao đẳng Saunders Xuất bản: Philadelphia, 1998 - Lauer Rozing "Điện di mao mạch cao hiệu suất: Một mồi" (PDF) Agilent -Technologies Đã lưu trữ từ gốc(PDF) vào ngày 13 tháng năm 2014 Truy lục 201404-09 - Hauser, Peter C (2016) "Chương Xác định ion kiềm mẫu sinh vật môi trường" Trong Astrid, Sigel;Helmut, Sigel; Roland KO, Sigel Các ion kim loại kiềm: vai trò chúng sống Kim loại kim loại Khoa học Đời sống 16 Springer trang 11-25 doi : 10.1007 / 978-3-319-21756-7_2 - McCord, B Bách khoa toàn thư khoa học pháp y Điện di mao mạch nghiên cứu di truyền pháp y, năm 2013, 394-401 - Oorschot R; Ballantyne K Điện di mao mạch sinh học pháp y, 2013, 560-566 - Shallan A; Guijt R; Breadmore M Quy trình điện di mao mạch, 2013, 549-559  ... tử trung bình) - mao quản, tạo phân tách chất 1.1.7 Ứng dụng phương pháp điện di mao quản • Ứng dụng dược phẩm dược liệu: Thường sử dụng phương pháp • MEKC Ứng dụng phân tích dược phẩm: Carbohydrate,... trở thành detector phổ biến điện di mao quản 1.1.6 Quá trình xảy mao quản Sự xuất lớp điện kép sát thành mao quản Trong mao quản có dòng điện I (5-200µA) Xuất dòng điện di thẩm thấu, EOF Sự tương... chất tích điện (trong dung dịch điện ly, có đệm pH thích hợp) di chuyển với tốc độ khác tách khỏi Hình 1.1.2 Sơ đồ thiết bị điện di mao quản 1.1.2 Phân loại điện di mao quản: Điện di mao quản vùng