Bài viết Vai trò của sinh thiết tủy xương trong chẩn đoán và tiên lượng bệnh đa u tủy xương trình bày về: Bệnh lý đa u xương tủy, tổ chức học, hình thái tế bào, đặc điểm học của tương bào, vi môi trường tủy xương, hóa mô miễn dịch... Mời các bạn cùng tìm hiểu về bệnh đa u tủy xương được đề cập trong bài viết.
Trang 1VAI TRÒ CỦA SINH THIẾT TỦY XƯƠNG TRONG CHẨN ĐOÁN
VÀ TIÊN LƯỢNG BỆNH ĐA U TỦY XƯƠNG
Ngô Ngọc Ngân Linh*, Lê Thanh Tú*, Phù Chí Dũng*
ĐẶT VẤN ĐỀ
Đa u tủy xương là một bệnh lý ác tính của
dòng tế bào B biệt hóa Trong các bệnh lý ung
thư, đa u tủy chiếm tỉ lệ 1% Trong các bệnh máu
ác tính, đa u tủy xương chiếm khoảng 10% và là
bệnh phổ biến đứng hàng thứ hai, chỉ sau bệnh
lymphoma không-Hodgkin Sinh bệnh học của
bệnh ĐUTX là bất thường nhiễm sắc thể và sự
tương tác giữa tế bào tương bào và các yếu tố vi
môi trường trong tủy xương Bệnh đặc trưng bởi
sự tăng sinh và tích luỹ bất thường các tế bào
dòng tương bào trong tuỷ xương, xuất hiện
protein đơn dòng trong huyết thanh và nước
tiểu, tổn thương các cơ quan đích Các đặc trưng
trên cũng là 3 tiêu chuẩn cho chẩn đoán xác định
bệnh
Phân biệt plasmocyte phản ứng hay
plasmocyte ác tính và đánh giá số lượng tế bào
plasmocyte trong tuỷ xương là một bước quan
trọng trong việc chẩn đoán và theo dõi điều trị
bệnh đa u tủy và các rối loạn tương bào khác Vì
vậy, luôn luôn phải phân tích giải phẫu mô bệnh
học tủy xương (histopathology) Mặc dù dịch hút
tủy xương (BMA) là đủ để chẩn đoán vi thể
sự khác biệt đáng chú ý và một tương quan
tương đối kém trong việc xác định tỷ lệ phần
trăm của các tế bào plasma tủy xương giữa BMA
được giải thích là do đa u tủy xương có thể biểu
hiện từng ổ hoặc do ảnh hưởng của quá trình xơ
hóa tủy làm cho dịch tủy khó hút Nghiên cứu
của Sanja Stifter ghi nhận tỷ lệ phần trăm
plasmocyte ước tính cao hơn ở mẫu tủy sinh
việc xác định số lượng plasmocyte, sinh thiết tủy
xương kết hợp hóa mô miễn dịch còn giúp phân
biệt được tế bào plasmocyte phản ứng hay ác tính Giải phẫu mô bệnh học tủy xương có thể cung cấp một số đặc điểm mô học và hình thái học có thể có ý nghĩa tiên lượng, cũng như cho biết một số chi tiết về đặc điểm vi môi trường tủy xương và hoạt động tạo máu của tủy xương Các đặc điểm mô bệnh học sinh thiết tủy xương
và vai trò trong chẩn đoán, theo dõi và tiên lượng bệnh đa u tủy xương sẽ được đề cập trong phạm vi chuyên đề này
TỔ CHỨC HỌC
Bước đầu tiên trong quá trình chẩn đoán mô bệnh học là để phân biệt tăng plasmocyte là plasmocyte phản ứng hay plasmocyte ác tính Trong tăng plasmocyte phản ứng, các tế bào tương bào (plasmocyte) nằm trong các cụm tế bào nhỏ theo các khe thường dọc theo các mạch máu Tế bào plasmocyte ác tính (tế bào đa u tủy)
(Hình 1)
Hình 1 Sinh thiết tủy xương Đám tế bào tương
bào tụ lại ở vùng tế bào mỡ và tế bào tạo máu Hoạt động hủy cốt bào trong xương xốp
Có ba kiểu tổn thương chính trong đa u tủy:
- Theo gian kẽ, có hoặc không có tích tụ
* Bệnh viện Truyền máu – Huyết học
Trang 2tương bào ở bè xương (paratrabecular) Thấm
nhập mô mỡ ở khoảng kẽ và giữa các tế bào tạo
máu liên quan đến quá trình diễn tiến âm thầm
và hủy xương từ từ Vị trí của tế bào plasma nằm
xung quanh các mạch máu nhỏ thấy trong cả
trường hợp ác tính cũng như các trường hợp
tăng plasmocyte phản ứng
- Tập trung thành nốt hoặc trong các dải
rộng Thâm nhiễm dạng nốt có tương quan
với tổn thương hủy xương đa ổ và bệnh tiến
dạng nốt
- Xâm nhập thành đám lớn lan tỏa trong tủy
hoặc thâm nhiễm sarcomatous gặp ở các trường
hợp hủy xương lan tỏa với mật độ xương mỏng
đi Kiểu xâm nhập này được một số tác giả cho là
có tiên lượng xấu nhất(20,22,26)
HÌNH THÁI TẾ BÀO
Hình thái tế bào của tế bào plasmocyte là quan trọng và có thể có ý nghĩa tiên lượng Trong khi ở một số bệnh nhân ghi nhận một hình thái tế bào plasma đồng nhất, một số khác ghi nhận biểu hiện hình thái tế bào plasma không đồng nhất trong các giai đoạn khác nhau của bệnh
Có thể gặp ba kiểu hình thái tế bào tương bào khác nhau: tế bào trưởng thành, tế bào trung gian và tế bào chưa trưởng thành hay tế bào plasmablastic (hình 2 và 3) Các tế bào plasma chưa trưởng thành có liên quan với sự
dụ như các trường hợp tế bào plasma có nhân đa bội phân thùy nhiều
Hình 2 Ba dạng khác nhau của tương bào; A
trưởng thành, B trung gian H&E 600x
Hình 3 Ba dạng khác nhau của tương bào; Kiểu
Plasmablastic H&E 600x
Những đặc điểm tế bào tương bào không
bình thường như thế này không được đưa vào
các tiêu chí phân loại hình thái học hiện tại, mặc
dù thực tế rằng một tế bào bất thường hình thái
plasma có thể chỉ ra sự hiện diện của đa u tủy,
không phụ thuộc vào tỷ lệ phần trăm của các tế
bào plasma Ghi nhận của các hình thái biến thể
của các tế bào ung thư trong huyết tương, liên
quan đến tiên lượng kém hơn, là rất quan trọng
để cảnh báo các bác sĩ lâm sàng để có thể nhận
theo khía cạnh này, ba đặc điểm tế bào học của
các tế bào plasma rất là quan trọng
Đặc điểm tế bào học của tương bào
Sự đa hình của hạt nhân
Đặc điểm này hiếm khi xảy ra trong các tế bào plasma phản ứng và là một chỉ dấu tốt hướng đến bệnh ung thư Các tế bào bình thường cho thấy kiểu hình bánh xe lệch tâm (eccentric wheel-spoke) của hạt nhân (Hình 4) Trong bệnh ác tính, kiểu hình này có thể thay đổi thành nhiều hình dạng khác nhau và có thể thấy hình ảnh hạt nhân rất lớn Tế bào plasmocyte ác tính có thể biểu hiện một số rối loạn hình thái ví
dụ hình ảnh các tế bào có nhân tròn có hình bánh xe nan hoa, thường lệch về một phía của tế bào, nguyên sinh chất rất rộng, ưa base mạnh, có
Trang 3thể có hình “ngọn lửa” Một số sự khác biệt ở hạt
nhân được mô tả trong y văn là: sự lõm tế bào
chất vào trong hạt nhân, sự lõm của màng hạt
nhân vào bên trong, ghi nhận thể Dutcher, hạt
nhân phân thùy và nhiều hạt nhân (Hình 5) Sự
phân thùy của hạt nhân và hình ảnh phân bào là
biểu hiện của bệnh tiến triển về mặt lâm
sàng(8,19,24,30)) Tương bào đa nhân cho chúng ta biết
hoạt động ribosome hơn là cho thấy sự chưa
trưởng thành của tế bào và hoạt động tăng sinh
tế bào
Hình 4 Các tế bào u tủy (tương bào ác tính) phân
biệt với tế bào bình thường bởi sự hiện diện của hạt
nhân rất lớn, thường lệch tâm
Hình 5 Sự đa hình của hạt nhân; A Hạt nhân to nổi
bật, B Nhiều nhân C Hạt nhân phân thùy H&E
600x
Tế bào chất
Tế bào plasmocyte có bào tương lớn và chứa
mạng lưới nội bào dày đặc, mang nhiều hạt; đây
chính là nơi tổng hợp kháng thể, protein màng
và protein tiết Tương bào cũng có phức hợp
Golgi đặc biệt nằm quanh nhân là nơi các phân
tử kháng thể được chuyển thành thể dạng cuối
Ở tế bào plasmocyte ác tính, thường ghi nhận được sự bất thường của tế bào chất qua những thay đổi hình ảnh khi nhuộm tế bào chất Tế bào chất của các tế bào ác tính có chứa các globulin miễn dịch được tạo thành ở lưới endoplasmatic dưới nhiều hình thức khác nhau: thể Russell, các tế bào giống dấu ấn vòng nhẫn, các tế bào nhỏ, các tế bào Mott, các
tế bào flaming (tế bào chất là eosinophilic hoặc
có những vùng rực đỏ như “ngọn lửa” với màu eosinophilic), các tế bào giống nòng nọc,
tế bào giống Gaucher có thể phân biệt được(11,13,27) (hình 6)
Hình 6 Sự bất thường của tế bào chất ; A Thể
Russel, B Thể Gaucher , C Các TB giống nòng nọc H&E 600x
Sự không đồng bộ giữa nhân và tế bào chất
Điều này có thể gặp khi các hạt nhân chứa nhiều hạnh nhân nổi bật hoặc có sự lan tỏa của sợi nhiễm sắc và tế bào chất có vẻ trưởng thành bình thường (hình 7) Tiên lượng liên quan rõ rệt đến sự thay đổi của hạt nhân và sự mất đồng bộ giữa nhân và nguyên sinh chất Không có giá trị tiên lượng nếu chỉ biểu hiện sự bất thường tế bào
Theo Frisch và Bartl, các biến thể trong hình thái tế bào plasma có thể được tóm tắt thành ba lớp tiên lượng dựa trên kiểu tế bào plasma chiếm ưu thế: Marschalko hoặc độ ác thấp (tế bào nhỏ), trung gian (cắt, đa hình, không đồng
Trang 4plasmablastic của tế bào ung thư xảy ra ở
khoảng 10-15 % bệnh nhân đa u tủy trong giai
đoạn đầu của bệnh, nhưng tỷ lệ này có thể tăng
vào thời điểm tái phát tủy xương và nổi bật
trong tái phát ngoài tủy Rõ ràng điều này có liên
quan đến tiên lượng rất xấu(4,9,12,13,15,20,24)
Hình 7 Sự không đồng bộ giữa Nhân & Nguyên
sinh chất H&E 600x
VI MÔI TRƯỜNG TỦY XƯƠNG
Các tế bào B đơn dòng ác tính biệt hóa
thành tế bào plasma bởi sự tương tác với các tế
bào mô đệm, các tế bào nội mô, với matrix
ngoại bào và bởi sự tương tác với các tế bào
plasma ác tính khác
Các phân tử kết dính được chứng minh là có
tầm quan trọng trong đa u tủy xương và đóng
một vai trò trong việc kết nối và tương tác của tất
cả các tế bào và các thành phần khác Các tế bào
đa u tủy biểu hiện một thụ thể đặc hiệu cho
interleukin-6, đó là yếu tố tăng trưởng và yếu tố
sống còn đối với các tế bào đa u tủy
Interleukin-6 được sản xuất bởi các tế bào trong vi môi
trường tủy xương và là một trong những ví dụ
chính về tầm quan trọng của sự tương tác của
các vi môi trường và các tế bào khối u trong
ngoại bào được kích hoạt bởi các tế bào khối u và
cũng sản xuất các cytokine, bao gồm IL-6, VEGF,
IGF1, SDF-1 và TNF-α, yếu tố tăng trưởng quyết
định, sự biệt hóa và độ bám dính của khối u và
do đó điều tiết sự sống còn của khối u, sự trưởng
thành, di cư và sự phát triển(14,17,18) Syndecan-1,
một trong số các phân tử kết dính quan trọng
nhất trong tế bào u tủy, tích tụ trong tủy xương bệnh nhân đa u tủy và nồng độ cao của syndecan-1 trong huyết thanh được xem là một
trị thuốc mới (như Bortezomib, Thalidomide hay các thuốc điều hòa miễn dịch khác) có tác dụng trúng đích trên tế bào đa u tủy cũng như tác dụng trên cả vi môi trường của tủy xương Vì thế
mà điều trị thuốc mới có thể khắc phục vấn đề kháng thuốc(3,18)
Về giải phẫu bệnh, thay đổi khác trong xương và tủy xương là chỉ số hủy cốt bào cao, hình ảnh xơ hóa, suy tủy, rối loạn tạo máu, thoái hóa bột, mạch và tân sinh thứ phát (hình 8 và 9)
Hình 8 Dự hậu tiên lượng xấu: Xơ hóa thô
Gomori 600x
Hình 9 Dự hậu tiên lượng xấu: Hủy cốt bào
H&E 200x
Các dòng tế bào sinh máu bình thường như hồng cầu, bạch cầu, mẫu tiểu cầu có thể bình thường, giảm sinh hoặc rối loạn hình thái nhẹ Mục tiêu trị liệu mới có thể nhắm vào sự tương tác của các tế bào ác tính và vi môi trường của
Trang 5tế bào plasmocyte ghi nhận trên tủy hút và trên
sinh thiết tủy có thể xảy ra do xơ hóa hoặc thâm
nhiễm dạng nốt, làm cho khó hút tương bào
trong dịch tủy hút Sự phát triển của xơ hóa
nhiều thường dự báo dự hậu tiên lượng xấu
Ngoài ra, biểu hiện của nhiều hủy cốt bào hấp
thu trong xương là tiên lượng cho khối u tiến
sự tái hấp thu hủy cốt bào và kích thích sự sửa
hiệu do điều trị có thể là mất đi sự xâm nhập
mức độ nặng, tăng lymphocyte và tế bào u hạt
trong tủy xương
HÓA MÔ MIỄN DỊCH
Có thể phân biệt một trường hợp Đa u tủy
immunoblastic hoặc ung thư biểu mô không biệt
hoá Để chẩn đoán phân biệt, nhuộm hóa mô
miễn dịch là rất hữu ích Trong hầu hết các
trường hợp, tương bào ác tính trong đa u tủy sản
xuất paraproteins đại diện cho globulin miễn
dịch chuỗi nặng hoặc globulin miễn dịch chuỗi
nhẹ Trong 60% bệnh nhân, các paraprotein tiết
ra là IgG; IgA được tiết ra ở 20% bệnh nhân,
trong khi ở 15-20% bệnh nhân, chỉ có chuỗi nhẹ
được sản xuất Các globulin miễn dịch đơn dòng
có thể được phát hiện trong huyết thanh và/hoặc
phát hiện protein Bence-Jones trong nước tiểu
Trên mẫu sinh thiết tủy chúng có thể được nhìn
thấy nhờ kỹ thuật hóa mô miễn dịch Trong bạch
cầu cấp dòng tương bào nguyên phát, các tế bào
thường chỉ biểu hiện chuỗi nhẹ, IgE hoặc IgD và
số lượng tuyệt đối của các tế bào này tương quan
với hoạt động của bệnh
Ngoài các globulin miễn dịch thuộc tế bào
chất, tế bào u tủy thường thể hiện nhiều
marker trên màng mà những marker này có
thể phát hiện qua nhuộm hóa mô miễn dịch
Trong giai đoạn đầu của bệnh CD38, CD79a,
CD56, CD54 và CD40 có thể được tìm thấy
Thông thường, các dấu ấn pan-B, CD19, CD20
(L26) và CD45, là âm tính Đặc biệt là sau khi
điều trị, đánh giá immunophenotypic là rất
quan trọng, vì một kiểu hình polytypic bình thường của các tế bào plasma sau khi điều trị
dự báo thời gian sống không bệnh tiến triển
của CD28 có thể xuất hiện và tại thời điểm tái
Người ta ngày càng nhận thức nhiều hơn
về tầm quan trọng của các phân tử kết dính trong sinh bệnh học bệnh lý ĐUTX Các phân
tử giống như CD44, CD56, CD58, VLA4, VLA5, RHAMM và CD138 (syndecan-1) đóng một vai trò trong việc dẫn đường, tăng trưởng,
phát hiện những phân tử này sẽ trở nên ngày càng quan trọng đối với việc dự đoán tiên lượng và cung cấp các mục tiêu điều trị mới Ki67 (MIB-1) là một kháng nguyên hạt nhân của các tế bào tăng sinh trong pha-S của chu
kỳ tế bào và có thể giúp chẩn đoán phân biệt giữa ĐUTX và MGUS, mặc dù chỉ dương tính trong 1-2% số tương bào trong đa u tủy
KẾT LUẬN
Sinh bệnh học của bệnh ĐUTX là bất thường nhiễm sắc thể và sự tương tác giữa tế bào tương bào và các yếu tố vi môi trường trong tủy xương Chẩn đoán xác định ĐUTX cũng như chẩn đoán phân biệt được thiết lập dựa trên 3 tiêu chuẩn: sự hiện diện của đỉnh gamma đơn dòng trong huyết tương hay nước tiểu, sự tăng sinh tương bào ác tính trong tủy xương
và biểu hiện của tổn thương cơ quan đích Trong đó sinh thiết tủy xương hầu như luôn phải thực hiện, bởi lẽ tiêu chuẩn tăng sinh tương bào đơn dòng ác tính trong tủy xương
là một tiêu chuẩn rất quan trọng
Giải phẫu bệnh, dựa chủ yếu vào đặc điểm
tổ chức học và hình thái học và hóa mô miễn dịch, đóng vai trò quan trọng trong xác định 2 vấn đề cơ bản nhưng là 2 vấn đề chủ chốt: một là phân biệt tương bào ác tính hay tăng sinh tương bào phản ứng, hai là xác định tỉ lệ tương bào ác tính trong tủy xương Việc xác định tỉ lệ tương bào ác tính trên mẫu tủy sinh thiết chính xác hơn
Trang 6so với xét nghiệm tủy đồ trên mẫu tủy hút và kỹ
thuật dấu ấn miễn dịch tế bào (flow cytometry)
Ngoài việc chẩn đoán xác định bệnh, những
đặc điểm mô học, vi môi trường và hình thái học
cũng góp phần trong tiên lượng dự hậu của
bệnh Tuy nhiên ở khía cạnh xếp giai đoạn và
tiên lượng bệnh, hiện nay khảo sát di truyền học
có vai trò chủ chốt hơn
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Alexandrakis MG, Passam FH, Malliaraki N, Katachanakis C,
Kyriakou DS, Margioris AN (2002) Evaluation of bone disease
in multiple myeloma: a correlation between biochemical
markers of bone metabolism and other clinical parameters in
untreated multiple myeloma patients Clinica Chimica
Acta;325;51-7.
2 Bain BJ, Clark DM, Lampert IA (1996) Bone marrow
pathology, 2nd edn Oxfort: Blackwell Science
3 Barlogie B, Epstein J, Selvanayagam P, Alexanian R (1989)
Plasma cell myeloma-new biological insights and advances in
therapy Blood 73: 865-879
4 Bataille R, Harousseau J-L (1997) Multiple myeloma New Eng
J Med 336(23):1657-64
5 Bayer-Garner IB, Sanderson RD, Dhodapkar MV, Owens RB,
Wilson CS (2001) Syndecan-1 (CD138) immunoreactivity in
bone marrow biopsies of multiple myeloma: shed syndecan-1
accumulates in fibrotic regions Mod Pathol 14: 1052-1058
6 Blade J, Samson D, Reece D (1998) Criteria for evaluating
disease response and progression in patients with multiple
myeloma treated by high-dose therapy and haemopoietic
stem cell transplantation Br J Haematol 102:1115–1123
7 Bloem A C, Lamme T, Smet de M, et al (1998) Long term bone
marrow cultured stroma cells regulate myeloma tumour
growth in vitro: studies with primary tumour cells and
LTBMC-dependent cell lines Brit J Haematol;100 (1):166-175
8 Buss D H, Reynolds G D, Cooper M R (1988) Multiple
myeloma associated with multilobated plasma cell nuclei
Virchows Archiv B Cell Pathol; 55: 287-92
9 Carter A, Hocherman I, Linn S, Cohen Y, Tatarsky I (1987)
Prognostic significance of plasma cell morphology in multiple
myeloma Cancer: 60; 1060-65
10 Charles KS, Winfield DA, Angel C (2004) Audit of bone
marrow aspirates and trephine biopsies in multiple myeloma -
a single centre study Clin Lab Haematol 26:403–406
11 Dimopoulos M A, Moulopoulos L A, Maniatis A, Alexanian R
(2000) Solitary plasmacytoma of bone and asymptomatic
multiple myeloma Blood 96:2037-44
12 Fassas AB, Muwalla F, Berryman T et al (2002) Myeloma of
the central nervous system: association with high-risk
chromosomal abnormalities, plasmablastic morphology and
extramedullary manifestations Br J Haematol 117:103-8
13 Frisch B, Bartl R (1999) Biopsy interpretation of bone and bone
marrow Histology and immunohistology in paraffin and
plastic Ahold, Hodder headline group 1999 second
edition;310-25
14 Ghia P, Granziero L, Chilosi M, Caligaris-Cappio F (2002) Chronic B cell malignancies and bone marrow microenvironment Cancer Biology 12:149-55
15 Greipp PR, Leong T, Bennet J M et al (1998) Plasmablastic morphology-an independent prognostic factor with clinical and laboratory correlates: Eastern Co-operative Oncology Group (ECOG) myeloma trail E9486 Blood 91:2501-1207
16 Handa U, Chhabra S, Mohan H (2009) Plasma cell tumours: cytomorphological features in a series of 12 cases diagnosed
on fine needle aspiration cytology Cytopathology in press
17 Hayashi T, Hideshima T, Anderson K C (2003) Review: Novel therapies for multiple myeloma Br J Haematol:120;
10-17
18 Hideshima T, Anderson K C (2002) Molecular mechanisms of novel therapeutic approaches for multiple myeloma Nature reviews; 2:927-37
19 Islam A, Noyes S, Henderson E S (1990) A case of aggressive multiple myeloma with convoluted and multilobated plasma cell nuclei and no visible nucleoli Br J Haematol;76(2):306-7
20 Jaffe E S, Harris N L, Stein H, Vardiman J W (2001) Tumors of haematopoietic and lymphoid tissues Pathology and Genetics World Health Organisation classification of tumours IARC Press Lyon
21 Kuehl W M, Bergsagel P L (2002) Multiple myeloma: evolving genetic events and host interactions Nature reviews;2:175-87
22 Kyle RA et al (1988) Prognostic factors in multiple myeloma Hematological Oncology; 6:125-30
23 Lokhorst H M, Lamme T, Smet de M, et al (1994) Primary tumour cells of myeloma patients induce interleukin-6 secretion in long-term bone marrow cultures Blood; 84(7):2269-77
24 Rajkumar S V, Fonseca R, Lacy M Q et al (1999) Plasmablastic morphology is an independent predictor of poor survival after autologous stem-cell transplantation for multiple myeloma J Clin Oncol;17:1551-7
25 San Miguel J F, Almeida J, Mateo G et al (2002) Immunophenotypic evaluation of the plasma cell compartment in multiple myeloma: a tool for comparing the efficacy of different treatment strategies and predicting outcome Blood;99:1853-6
26 Sanja S et al (2010) Combined evaluation of bone marrow aspirate and biopsy is superior in the prognosis of multiple
myeloma.Diagnostic Pathology, 5:30
27 Van den Tweel JG, Taylor CR, Parker JW, Lukes RJ (1978) Immunoglobulin inclusions in non-Hodgkin’s lymphomas
Am J Clin Pathol;69(3):306-13
28 Yaccoby S, Pearse RN, Johnson CL, Barlogie B, Choi Y, Epstein
J (2002) Myeloma interacts with the bone marrow microenvironment to induce osteoclastogenesis and is dependent on osteoclast activity Br J Haematol;116(2):278-90
29 Yang Y, Yaccoby S, Liu W et al (2002) Soluble syndecan-1 promotes growth of myeloma tumors in vivo Blood;100:610-7
30 Zukerberg L R, Ferry J A, Conlon M, Harris N L (1990) Plasma cell myeloma with cleaved, multilobated, and monocytoid Nuclei Am J Clin Pathol;93: 657-61