Phân lập và xác định các hợp chất có hoạt tính chống oxy hóa trong lá chùm ngây (moringa oleifera lam., moringaceae)

Nghiên cứu được thực hiện với mục tiêu nhằm phân lập và xác định các hợp chất có hoạt tính chống oxy hóa trong lá chùm ngây (moringa oleifera lam., moringaceae). Nghiên cứu áp dung với lá chùm ngây thu tại Tri Tôn, An Giang; xác định độ tinh khiết của nguyên liệu. Phân lập và xác định cấu trúc các chất có hoạt tính chống oxy hóa mạnh trong lá Chùm ngây, và đánh giá hoạt tính chống oxy hóa các chất phân lập được.

Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ Số * 2013 Nghiên cứu Y học PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH CÁC HỢP CHẤT CÓ HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HĨA TRONG LÁ CHÙM NGÂY (MORINGA OLEIFERA LAM., MORINGACEAE) Trần Công Luận*, Trần Thị Thúy Quỳnh**, Salihah** TÓM TẮT Mục tiêu: Chùm ngây (Moringa oleifera Lam.) loài quan tâm hoạt tính chống oxy hóa Để tìm hiểu sâu khả chống oxy Chùm ngây, nhằm sử dụng lồi hiệu hơn, góp phần cho mục đích phát triển Chùm ngây loại thuốc hay thực phẩm chức chống oxy hóa, chúng tơi thực đề tài “Phân lập xác định hợp chất có hoạt tính chống oxy hóa Chùm ngây (Moringa oleifera Lam., Moringaceae)” Đối tượng phương pháp: Lá Chùm ngây thu Tri Tôn, An Giang Xác định độ tinh khiết nguyên liệu Phân lập xác định cấu trúc chất có hoạt tính chống oxy hóa mạnh Chùm ngây Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa chất phân lập Kết quả: Xác định độ tinh khiết nguyên liệu Chùm ngây Phân lập hợp chất có hoạt tính chống oxi hóa vitexin (25 mg) isoquercitrin (200 mg) Cả chất phân lập từ phân đoạn ethyl acetat Chùm ngây có khả chống oxy hóa theo chế khác Kết luận: Những kết nghiên cứu cho thấy Chùm ngây có tiềm làm thuốc hay thực phẩm chức chống oxy hóa Từ khóa: Moringa oleifera, vitexin, isoquercitrin, chống oxy hóa ABSTRACT ISOLATION AND IDENTIFICATION OF ANTIOXIDANT COMPOUNDS FROM LEAVES OF MORINGA OLEIFERA LAM., MORINGACEAE Tran Cong Luan, Tran Thi Thuy Quynh, Salihal * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 18 - Supplement of No – 2014: 175 - 179 Objective: Chum (Moringa oleifera Lam.) is well interested in antioxidant activity In order to use the plant more effectively and contribute to developing antioxidant production of Chum ngay, this study was conducted with the aim of isolating and identifying the antioxidant compounds from leaves of Moringa oleifera Lam Methods: Leaves of “Chum ngay” were collected at Tri Ton district, An Giang province Isolation and structure determination of compounds having strong antioxidant activity in leaves Isolated compounds were tested on antioxidant activities Results: Purity standard of Chum leaves was determined Two antioxidant compounds vitexin (25 mg) and isoquercitrin (200 mg) were isolated and structural identification by means of 1D and 2D NMR techniques Two isolated compounds had antioxidant effects with different mechanisms of action Conclusion: The results of this study showed potential antioxidant drug or functional food from Chum leaves Keywords: Moringa oleifera, vitexin, isoquercitrin, antioxidant ∗ Trung tâm sâm dược liệu Tp HCM ∗∗ Khoa Y học cổ truyền – Đại học Y dược Tp HCM Tác giả liên lạc: PGS TS Trần Công Luận ĐT: 0903671323 Email: congluan53@gmail.com Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 175 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ Số * 2013 ĐẶT VẤN ĐỀ Cuộc sống người đối mặt với nhiều bệnh nguy hiểm tác động chất oxy hóa: Đái tháo đường, xơ vữa động mạch, đục nhân mắt, cao huyết áp, ung thư… Do đó, chất chống oxy hóa có vai trò quan trọng thiếu phác đồ điều trị liệu pháp dự phòng bệnh thối hóa ác tính Chùm ngây (Moringa oleifera Lam.) loài quan tâm hoạt tính chống oxy hóa Để tìm hiểu sâu khả chống oxy Chùm ngây, nhằm sử dụng lồi hiệu hơn, góp phần cho mục đích phát triển Chùm ngây loại thuốc hay thực phẩm chức chống oxy hóa, chúng tơi thục đề tài “Phân lập xác định hợp chất có hoạt tính chống oxy hóa Chùm ngây (Moringa oleifera Lam., Moringaceae)” NGUYÊNLIỆU -PHƯƠNGPHÁP NGHIÊNCỨU Nguyên liệu Lá Chùm ngây thu Tri Tôn, An Giang vào ngày 1/8/2010 Mẫu sử dụng bao gồm cuống chét Mẫu thu hái, loại bỏ bụi bẩn, hư, sâu… Một phần phơi khô 50 0C – 60 0C xay nhỏ thành bột Một phần tươi dùng để chiết etanol thu cao toàn phần Mẫu định danh lưu trữ Trung tâm Sâm Dược liệu TP Hồ Chí Minh Cao cồn toàn phần cao phân đoạn tiến hành định lượng phenolic tổng phương pháp Folin – Ciocalteu theo Waterman Mole (1994)(5) sàng lọc hoạt tính chống oxy hóa phản ứng qt gốc tự DPPH Phân lập chất cao có hoạt tính chống oxy hóa cao sắc kí cột nhanh – cột khơ sắc kí cột cổ điển với hệ dung mơi thăm dò SKLM Tinh chế chất phân lập cách lọc qua phễu thủy tinh xốp kết tinh lại với dung mơi phù hợp Khảo sát cấu trúc hóa học chất phân lập phương pháp phổ UV, phổ khối MS, phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR Đánh giá hoạt tính chống oxi hóa chất phân lập Phương pháp quét gốc tự DPPH(4) Dựa vào phương trình hồi quy, tính giá trị IC50 nồng độ quét 50% gốc tự DPPH Các mẫu có giá trị IC50 thấp hoạt tính chống oxy hóa cao Phương pháp xác định lực khử: Theo phương pháp Yen Duh (1993) (6) Phương pháp thử hoạt tính quét gốc hydroxyl tự do: Được xác định theo phương pháp Li cộng (2007) (3) KẾT QUẢ Phương pháp nghiên cứu Xác định độ tinh khiết nguyên liệu Xác định độ tinh khiết nguyên liệu Xác định độ ẩm bột dược liệu, xác định độ tro toàn phần, xác định độ tro không tan acid hydrocloric theo DĐVN IV (1) Xác định giảm khối lượng sấy khô 78,13 % Độ ẩm bột dược liệu 8,857 % Độ tro toàn phần 13,30 % Tro khơng tan HCl 0,36 % Phân tích sơ thành phần hóa thực vật có Chùm ngây Xác định sơ thành phần hóa thực vật, Chùm ngây có hợp chất tinh dầu, acid béo, carotenoid, triterpenoid, alkaloid, anthraquinon, coumarin, tanin, flavonoid, saponin, chất khử, acid hữu polyuronic Nghiên cứu hóa học Chiết xuất dược liệu phương pháp ngấm kiệt thu hồi để cao cồn tồn phần Cao cồn toàn phần chiết phân bố lỏng – lỏng qua dung mơi có độ phân cực tăng dần, thu cao phân đoạn 176 Chiết xuất dược liệu thu cao phân đoạn Từ 10 kg nguyên liệu tươi thu 600 g cao toàn phần Bằng phương pháp chiết lỏng – Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ Số * 2013 Nghiên cứu Y học lỏng, thu cao phân đoạn: Cao eter 168 g, cao cloroform 2,63 g, cao etyl acetat 28,40g, cao nước 120 g Kiểm tra SKLM phân đoạn E4 EM có chứa nhiều thành phần có hoạt tính chống oxy hóa khối lượng cao lớn Định lượng phenolic toàn phần khảo sát hoạt tính chống oxi hóa phân đoạn Phân đoạn E4 tiến hành sắc ký cột cổ điển phân lập hợp chất tinh khiết Hệ dung môi giải ly etyl acetat : metanol, thu phân đoạn Định lượng phenolic toàn phần - Hàm lượng phenolic toàn phần cao cồn toàn phần 108,011 µg GAE/mg (µg đương lượng acid gallic/ml), chiếm khoảng 8,6 % khối lượng cao Kết cho thấy Chùm ngây có chứa hàm lượng phenolic cao, có tiềm nguồn chất chống oxy hóa tự nhiên dồi - Hàm lượng phenolic toàn phần cao eter, cao cloroform, cao etyl acetat cao nước 44,528 µg GAE/mg, 110,914 µg GAE/mg, 271,822 µg GAE/mg, 90,881µg GAE/mg Hàm lượng phenolic tồn phần tập trung nhiều phân đoạn etyl acetat Khảo sát hoạt tính chống oxi hóa thơng qua chế quét gốc tự DPPH Giá trị IC50 khả quét gốc tự DPPH cao cồn toàn phần, cao eter, cao cloroform, cao etyl acetat cao nước 95,26 µg/ml, 287,79 µg/ml, 148,35 µg/ml, 24,59 µg/ml 206,69 µg/ml Kết cho thấy phân đoạn etyl acetat phân đoạn có hoạt tính chống oxi hóa cao Phân lập hợp chất có hoạt tính chống oxi hóa Tiến hành khai triển cao phân đoạn SKLM với hệ dung môi etyl acetat – metanol – nước (100: 17: 13) sử dụng thuốc thử DPPH Kết cho thấy chất có hoạt tính chống oxy hóa tập trung phân đoạn etyl acetat chủ yếu hợp chất phenolic Tiến hành sắc kí cột nhanh – cột khơ phân đoạn etyl acetat với hệ dung môi rửa giải: Cloroform 100% thu phân đoạn, etyl acetat 100% thu phân đoạn (E1-E4), etyl acetat – metanol (50 : 50) thu phân đoạn (EM) Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền Phân đoạn 3, xuất tủa màu vàng lắng đáy Tách riêng tủa rửa tủa metanol, thu chất I Từ phân đoạn 5, xuất kết tinh hình kim màu vàng Tách riêng kết tinh, làm cách cho tái kết tinh dung môi etyl acetat, thu chất II Chất I chất II đo giải phổ NMR (phổ H, phổ C, DEPT, HSQC, COSY, HMBC) khối phổ MS Chất I: 13C-NMR (125 MHz, DMSO) δc163,85; 102,37; 181,97; 155,90; 98,08;162,49; 104,55; 160,32; 103,96; 121,54; 128,81; 115,73; 161,03; 115,73; 128.81; 73,31; 70,82; 78,62; 70,54; 81,71; 61,26 1H-NMR (500 MHz, DMSO) δH 4,93 (1H,d, J = 9,8 Hz, H-1’’); 6,77 (1H, s, H-3); 6,88 (2H, d, J= 8,7 Hz, H-5’); 6,90 (2H, d, J= 8,7 Hz, H-3’); 8,01(2H, d, J = 8,7 Hz, H-6’); 8,03 (2H, d, J = 8,7 Hz, H-2’); 13,16 (1H, s, 5-OH) Chất II: 13C-NMR (125 MHz, DMSO) δc 156,16; 133,35; 177,39; 161,18; 98,58; 164,03; 93,42; 156,27; 103,95; 121,15; 115,15; 144,72; 148,37; 116,19; 121,51; 100,96; 74,06; 76,49; 69,94; 77,42; 60,97 1H-NMR (500 MHz, DMSO) δH 5,45 (1H, d, J = 6,9 Hz, H-1″);6,20 (1H, d, J = 1,8 Hz, H-6); 6,40 (1H, d, J = 1,8 Hz, H-8); 6,83 (1H, d, J = 9,0 Hz, H-5′); 7,56 (1H, br s, H-2′); 7,58 (1H, d, J = 9,0 Hz, H-6′) Phổ H phổ C chất I chất II đối chiếu với phổ chất chuẩn công bố ta thấy chất I vitexin (C21H20O10 : (1S)-1,5anhydro-1-[5,7-dihydroxy-2-(4-hydroxyphenyl)4-oxo-4H-chromen-8-yl]-D-glucitol)(7) chất II 2-(3,4là isoquercitrin (C21H20O12: dihydroxyphenyl)-5,7-dihydroxy-4-oxo-4Hchromen-3-yl β-D-glucopyranosid) (2) 177 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ Số * 2013 Nghiên cứu Y học (I) Hình Hoạt tính qt gốc tự DPPH Isoquercitrin Khảo sát lực khử Ở nồng độ 1000 µg/ml, vitexin đạt 21,66 % lực khử vitamin C isoquercitrin đạt 70% lực khử Vitamin C (II) Hình Cấu trúc vitexin (I) isoquercitrin (II) Hoạt tính quét gốc hydroxyl tự Giá trị IC50 vitexin isoquercitrin vitamin C 248,152Ɔg/ml, 394Ɔg/ml 2183Ɔg/ml Kết cho thấy vitexin có hoạt tính qt gốc hydroxyl tự cao nhất, cao vitamin C Đánh giá hoạt tính chống oxi hóa chất phân lập Hoạt tính quét gốc tự DPPH Giá trị IC50 vitexin isoquercitrin 85,18 µg/ml 6,64 µg/ml Isoquercitrin có hoạt tính cao vitexin cao chứng dương vitamin C Hình Năng lực khử vitexin, isoquercitrin Vitamin C Hình Hoạt tính qt gốc tự DPPH vitexin Hình Hoạt tính qt gốc hydroxyl tự vitexin isoquercitrin 178 Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ Số * 2013 BÀN LUẬN TÀI LIỆU THAM KHẢO Chùm ngây đối tượng quan tâm nghiên cứu nhiều giới nước Kết cho thấy hợp chất Chùm ngây có tiềm làm thuốc hay thực phẩm chức chống oxy hóa KẾT LUẬN Đây nghiên cứu nước công bố phân lập hợp chất flavonoid vitexin (25mg) isoquercitrin (200mg) có hoạt tính chống oxi hóa từ phân đoạn etyl acetat Chùm ngây Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa chất phân lập cho thấy: - Isoquercitrin có hoạt tính qut gốc tự DPPH cao vitexin cao chứng dương vitamin C - Vitexin đạt 21,66 % lực khử vitamin C isoquercitrin đạt 70% lực khử Vitamin C - Vitexin có hoạt tính qt gốc hydroxyl tự cao nhất, cao vitamin C Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền Nghiên cứu Y học Bộ Y tế (2009) Dược điển Việt Nam IV, NXB Y học, tr.PL – 182, PL – 183, PL – 239 Deepralard K., Kazuko K., Masataka M., Thitima P., Rutt S (2009) Flavonoid glycosides from the leave of Uvaria rufa with advanced glycation end – products inhibitory activity Thai J Pharm Sci., 33, pp 84 – 90 Li TR, Yang ZY, Wang BD (2007) Synthesis, characterization and antioxidant of naringenin schiff base and its Cu (II), Ni(II), Zn (II) complexes Chem Pharm Bull, 55, pp 26 – 28 Nguyễn Thị Thu Hương (2010) Nghiên cứu tác dụng chống oxy hóa theo hướng bảo vệ gan nấm Linh chi đỏ Ganoderma lucidum Tạp chí Y học TP HCM, tập 14 số 2, tr 131 - 132 Pilaipark C., Panya K., Yupin S., Srichan P., Noppawan M (2008) The in vitro and ex vitro antioxidant properties, hypolipidaemic and antitherosclerotic activities of water extract of Moringa oleifera Lam Leave Journal of Ethnopharmacology, 119, pp 439 – 436 Zhang Z., Jin J., Shi L (2008) Antioxidant activities of derivative of polysacchride extracted from a Chinese medical herb (Ramulus mori) Food Sci Technol Res., 14, pp 160 -1 68 Zhou X., Peng J., Guorong F (2005) Isolation and purification of flavonoid glycosides from Trollius ledebouri using high-speed counter-current chromatography by stepwise increasing the flow-rate of the mobile phase J Chromatoqr A., 1092 (2), pp 216 – 221 Ngày nhận báo: 3/10/2013 Ngày phản biện nhận xét báo: 15/10/2013, 20/10/2013 Ngày báo đăng: 02/01/2014 179 ... chức chống oxy hóa, chúng tơi thục đề tài Phân lập xác định hợp chất có hoạt tính chống oxy hóa Chùm ngây (Moringa oleifera Lam., Moringaceae) NGUYÊNLIỆU -PHƯƠNGPHÁP NGHIÊNCỨU Nguyên liệu Lá Chùm. .. (25mg) isoquercitrin (200mg) có hoạt tính chống oxi hóa từ phân đoạn etyl acetat Chùm ngây Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa chất phân lập cho thấy: - Isoquercitrin có hoạt tính qut gốc tự DPPH cao... µg/ml 206,69 µg/ml Kết cho thấy phân đoạn etyl acetat phân đoạn có hoạt tính chống oxi hóa cao Phân lập hợp chất có hoạt tính chống oxi hóa Tiến hành khai triển cao phân đoạn SKLM với hệ dung môi