Mục tiêu nghiên cứu nhằm khảo sát mức độ nhạy của các chủng candida gây bệnh ở niêm mạc miệng và âm đạo với ketoconazol và fluconazol. Mời các bạn cùng tham khảo bài viết để nắm rõ nội dung chi tiết của đề tài nghiên cứu này.
Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 KHẢO SÁT MỨC ĐỘ NHẠY CẢM CỦA CANDIDA SPP VỚI FLUCONAZOL VÀ KETOCONAZOL Nguyễn Thị Thúy Anh**, Nguyễn Vũ Giang Bắc*, Nguyễn Đinh Nga* TÓM TẮT Đặt vấn đề: Việc sử dụng thường xuyên số kháng sinh kháng nấm điều trị nguyên nhân gây kháng thuốc Candida albicans vi nấm chiếm tỉ lệ cao ca nhiễm nấm Ngoài ra, theo số báo cáo gần tỉ lệ Candida non albicans gây bệnh ngày tăng Mục tiêu nghiên cứu: Khảo sát mức độ nhạy chủng Candida gây bệnh niêm mạc miệng âm đạo với ketoconazol fluconazol Vật liệu phương pháp: sử dụng phương pháp khuếch tán theo hướng dẫn NCCLS M44-A phương pháp pha loãng theo hướng dẫn NCCLS M27-A2 sử dụng môi trường Mueller Hinton bổ sung glucose xanh methylen (MHB-GMB) thí nghiệm để xác định mức độ nhạy 30 chủng Candida albicans 36 chủng Candida non albicans với ketoconazol fluconazol Kết quả: Kết nhận từ hai phương pháp cho thấy tỉ lệ kháng thuốc chủng Candida chưa cao Phương pháp pha lỗng sử dụng mơi trường Mueller Hinton bổ sung xanh methylen giúp đánh giá chủng nhạy tùy thuộc liều với MIC cao mức nhạy Kết luận: Để sử dụng liều điều trị bệnh Candida thích hợp cần xác định MIC để phát chủng nhạy tùy thuộc liều Từ khóa: Candida albicans, Candida non albicans, MIC, MHA-GMB, MHB-GMB ABSTRACT STUDY ON THE ANTIFUNGAL SUSCEPTIBILITY OF CANDIDA SPP TO FLUCONAZOLE AND KETOCONAZOL Nguyen Thi Thuy Anh, Nguyen Dinh Nga, Nguyen Vu Giang Bac * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 15 - Supplement of No - 2011: 450 - 454 Background: Over the past few decades, Candida spp are the most common of fungal pathogens and the emergence of drug resistant Candida spp become an important problem in therapy Objective: To determine the antifungal susceptibility of Candida isolates to ketoconazole and fluconazole Material and methods: The antifungal activity against 66 trains of Candida spp of ketoconazole and fluconazole were determine by the Disk diffusion method and the dilution method according to the guidline of NCCLS M44-A and M27-A2 Outcome: MIC values and the inhibited zone sizes address that Candida spp were sensible to fluconazole and ketoconazole in high ratio Conclusion: Disk diffusion test are easy to set up and provide an screening test However, it is better to confirm by dilution method Results outcome in the dilution method used MHB-BMB was agree to which of disk diffusion method Key words: Candida albicans, Candida non albicans, MIC, MHA-GMB, MHB-GMB *Đại học Y Dược TP HCM, Khoa Dược **Trường Đại học Khoa học tự nhiên TP HCM Tác giả liên hệ: PGS TS Nguyễn Đinh Nga ĐT: 0908 83 69 69 Email: nganguyendinh@yahoo.com 450 Chuyên Đề Dược Khoa Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh vi nấm gây gia tăng nhanh chóng thập niên 1990 đến nay, đặc biệt người suy giảm miễn dịch Candida spp vi nấm gây bệnh thường gặp nhất, với Candida albicans chiếm tỉ lệ cao 80%, nhiên báo cáo gần cho thấy bệnh nhiễm nấm với Candida non albicans chiếm tỉ lệ tăng dần(2,6) Amphophtericin B, fluconazol, itraconazol ketoconazol thuốc thường dùng điều trị bệnh Candida spp., ngồi có thuốc mới, độc tính hơn, amphophtericin B cấu trúc lipid, voriconazol, caspofungins, micafungins giá thành cao chưa phổ biến Việt Nam Vì ketoconazol, itraconazol, fluconazol bác sĩ lâm sàng lựa chọn nhiều Do thuốc kháng nấm nhóm azole kể sử dụng thường xuyên điều trị, Candida spp trở nên đề kháng với azole nguyên nhân làm kéo dài thời gian điều trị thất bại điều trị bệnh nhiễm Candida Trong phạm vi đề tài khảo sát mức độ nhạy cảm Candida spp với ketoconazol fluconazol thuốc thường lựa chọn điều trị Việt Nam ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu 66 chủng Candida spp phân lập từ bệnh nhân nhiễm Candida niêm mạc miệng âm đạo từ 2008 đến 2009 Dựa vào đặc điểm nuôi cấy môi trường Sabouraud, thạch bột ngô, Czapek – Dox bổ sung 1% Tween 80 huyết xác định 30 chủng thuộc Candida albicans 36 chủng thuộc Candida non albicans Candida albicans 10231 sử dụng làm chủng đối chứng Mức độ nhạy với fluconazol Candida albicans 10231 xác định phương pháp khuếch tán, môi trường MHAGMB theo hướng dẫn NCCLS M44-A cho đường kính vòng ức chế từ 43-45 mm MIC = μg/ml xác định phương pháp pha loãng môi trường MHB-GMB Chuyên Đề Dược Khoa Nghiên cứu Y học Chất kháng nấm Ketoconazole chất chuẩn đối chiếu, lô 50030107, hàm lượng 99,63% Fluconazole USP, lô FLU-09 12 085, hàm lượng 99,41% Môi trường: Mueller Hinton Broth (Merck), Mueller Hinton Agar (Merck) Czapeck-Dox ((Merck) Phương pháp nghiên cứu(2,4,5) Các chủng Candida spp xác định mức độ nhạy với ketoconazol fluconazol với hai phương pháp: Phương pháp khuếch tán theo hướng dẫn NCCLS M44, sử dụng đĩa giấy tẩm fluconazol 25 μg ketoconazol 15 μg Môi trường thạch Mueller Hinton bổ sung 2% glucose xanh methylen μg/ml (MHAGMB) Thử nghiệm ủ 37 oC 24 Đường kính vòng ức chế đọc mức 80% ức chế Phương pháp pha loãng: nồng độ tối thiểu ức chế phát triển vi nấm (MIC) thực môi trường lỏng Mueller Hinton bổ sung 2% glucose xanh methylen μg/ml (MHB-GMB) Kết xác định mắt thường, sau 24 48 ủ 37 oC KẾT QUẢ Mức độ nhạy cảm Candida spp với fluconazol ketoconazol xác định phương pháp khếch tán Bảng Mức độ nhạy cảm Candida spp với fluconazol xác định phương pháp khuếch tán Chủng nấm Candida albicans Candida non albicans Số Đường kính vòng ức chế (mm) chủng ≥ 19 15-18 ≤ 14 30 36 29 33 1 Theo hướng dẫn NCCLS M44-A, dựa vào đường kính vòng ức chế để qui định mức độ nhạy cảm Candida spp với fluconazol, thực môi trường MHA-GMB chia thành mức, nhạy (S) đường kính vòng ức chế ≥ 19 mm; nhạy tùy thuộc liều 451 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 Nghiên cứu Y học (SDD) đường kính vòng ức chế từ 15-18 mm đề kháng (R) với đường kính vòng ức chế ≤ 14 mm Bảng Mức độ nhạy cảm Candida spp với ketoconazol xác định phương pháp khuếch tán Chủng nấm Số chủng Đường kính vòng ức chế (mm) ≥ 30 23-29 ≤ 22 Candida albicans 1 Candida non 12 albicans Đối với ketoconazole, chủng phân lập xác định nhạy (S) đường kính vòng ức chế ≥ 30 mm; nhạy tùy thuộc liều (SDD) đường kính vòng ức chế từ 23-29 mm đề kháng (R) với đường kính vòng ức chế ≤ 22 mm Candida albicans Candida non albicans 30 29 29 0 36 19 12 16 11 13 Bảng Nồng độ tối thiểu ức chế Candida spp ketoconazol Chủng nấm Số chủng ≤8 Khoảng MIC µg/ml 8-16 ≥ 16 24 48 24 48 24 48 giờ giờ giờ Candida albicans Candida non albicans 21 16 16 5 0 12 12 12 0 0 So sánh mức độ nhạy cảm Candida spp với ketoconazol fluconazol xác định phương pháp pha loãng phương pháp khuếch tán Mức độ nhạy cảm Candida spp với fluconazol ketoconazol xác định phương pháp pha loãng Theo hướng dẫn NCCLS M27-A2, mức độ kháng nấm men fluconazol ketoconazol qui định sau: Mức độ nhạy Candida spp xác định phương pháp pha loãng, sử dụng môi trường MHB-GMB Kết xác định sau 24 48 ủ 37 oC Điểm dừng đọc kết xác định 80% ức chế phát triển vi nấm Fluconazole: nhạy (S) MIC ≤ μg/ml; trung gian (SDD) MIC từ 16-32 μg/ml; đề kháng (R) MIC ≥ 64 μg/ml Ketoconazol: nhạy (S) MIC < μg/ml; trung gian (SDD) MIC từ 8- 16μg/ml; đề kháng (R) MIC > 16 μg/ml Bảng Nồng độ tối thiểu ức chế Candida spp fluconazol Dựa vào đường kính vòng ức chế nồng độ tối thiểu ức chế Candida spp., mức độ nhạy Candida spp với fluconazol ketoconazol tóm tắt bảng bảng Chủng nấm Số chủng ≤8 Khoảng MIC µg/ml 16-32 ≥ 64 24 48 24 48 24 48 giờ giờ giờ Bảng So sánh mức độ nhạy cảm Candida spp với fluconazol ketoconazol Chủng nấm Phương pháp Thời gian đọc kết Candida albicans Khuếch tán Pha loãng Candida non albicans Khuếch tán Pha loãng 24h 24h 48h 24h 24h 48h Mức độ nhạy cảm với chất kháng nấm (%) S SDD R FLC KTZ FLC KTZ FLC KTZ 96,67 75,00 12,5 3,33 12,5 96,67 76,19 23,81 3,33 96,67 76,19 23,81 3,33 91,67 75,00 5,55 2,78 25,00 52,78 100 44,44 2,78 30,55 100 30,55 36,11 S: nhạy; SDD: nhạy cảm tùy thuộc liều; R: đề kháng; FLC: fluconazol; KTZ: ketoconazol 452 Chuyên Đề Dược Khoa Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 BÀN LUẬN Mức độ nhạy cảm Candida spp với fluconazol ketoconazol Khi xác định mức độ nhạy Candida spp với ketoconazol fluconazol phương pháp khuếch tán, theo hướng dẫn bàn luận kết NCCLS M44-A, nhận thấy tỉ lệ kháng thuốc chủng Candida albicans Candida non albicans phân lập từ niêm mạc miệng âm đạo bệnh nhân không cao, 1/30 1/36 với fluconazol; 1/8 3/12 với ketoconazol (bảng 2) Kết nhận từ phương pháp pha loãng cho kết tương tự So với công bố Trần Phủ Mạnh Siêu Hồ Quang Thắng(6), đề kháng với ketoconazol fluconazol chủng Candida albicans C tropicalis phân lập từ phết họng, đàm, dịch rửa phế quản, nước tiểu chiếm tỉ lệ cao từ 26,67% đến 100% Tuy nhiên tác giả không cho biết thực kháng sinh đồ môi trường nuôi cấy nào, nồng độ kháng sinh đĩa giấy tiêu chuẩn xác định mức độ nhạy kháng thuốc, nên khó tìm lý khác biệt So sánh phương pháp pha loãng phương pháp khuếch tán, Phương pháp khuếch tán phương pháp sử dụng thường qui bệnh viện để xác định mức độ nhạy chủng lâm sàng với kháng sinh sử dụng điều trị Phương pháp đơn giản, tốn thời gian, giúp chọn thuốc thích hợp điều trị nhanh Phương pháp pha lỗng cho tương quan cao phòng thí nghiệm có mối tương quan tốt kết in vitro hiệu điều trị Để xác định nồng độ tối thiểu ức chế phát triển nấm men chất kháng nấm phương pháp pha loãng, theo hướng dẫn NCCLS M27-A2, thử nghiệm thực với môi trường RPMI với đệm MOPS Đây môi trường đắt tiền, qui trình điều chế phức tạp Vì chúng tơi sử dụng môi trường lỏng Mueller Hinton bổ sung glucose xanh Chuyên Đề Dược Khoa Nghiên cứu Y học methylen để xác định nồng độ tối thiểu ức chế Candida spp Đây môi trường NCCLS M44-A hướng dẫn sử dụng để xác định mức độ nhạy nấm men với chất kháng nấm phương pháp khuếch tán Mơi trường Mueller Hinton có cơng thức ổn định, dùng thông dụng cho vi khuẩn, cách điều chế đơn giản Bằng cách so sánh với kết nhận từ phương pháp khuếch tán chuẩn hóa NCCLS M44-A, để tìm tương quan hai phương pháp Kết thực nghiệm cho thấy, môi trường MHB-GMB cho bước nhảy rõ ràng, bị ảnh hưởng tượng kéo (trailing growth), gây khó khăn cho việc xác định MIC Candida MIC xác định sau 24 cho tương quan tốt với phương pháp khuếch tán Tỉ lệ chủng đề kháng với ketoconazol fluconazol C albicans không khác biệt đáng kể hai phương pháp Tuy nhiên, phương pháp pha lỗng phát chủng có mức độ nhạy tùy thuộc liều với MIC cao Ở Candida non albicans, sử dụng phương pháp pha loãng, đọc kết sau 24 phát chủng nhạy tùy thuộc liều cao phương pháp khuếch tán (16/36 chủng có MIC trung gian, so với 0/36 chủng phương pháp khuếch tán), đọc kết sau 48 giờ, tỉ lệ chủng kháng thuốc tăng cao so với phương pháp khuếch tán (13/36 so với 1/36) Qua kết khảo sát, chủng Candida albicans phân lập từ niêm mạc miệng âm đạo bệnh nhân nhạy với ketoconazol fluconazol Đối với Candida non albicans, dùng phương pháp khuếch tán chuẩn hóa NCCLS M44-A, chưa phát nguy kháng thuốc cao, nhiên mức độ nhạy với fluconazol ketoconazol chủng giảm với tỉ lệ chủng nhạy tùy thuộc liều tăng cao đến 44,44% Trong số công bố khác Huang cs., nghiên cứu tương quan giá trị MIC in vitro hiệu điều trị in vivo nhận thấy ca Candida nhiễm trùng huyết có MIC fluconazol < 32 μg 453 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 đáp ứng với fluconazol điều trị Vì chúng tơi đề nghị, để có tương quan tốt kết in vitro lâm sàng, ngồi việc sàng lọc nhanh kháng sinh thích hợp phương pháp khuếch tán, có điều kiện sử dụng môi trường MHB-GMB xác định thêm MIC kháng sinh chọn để chọn liều điều trị hợp lý Cảm ơn: Nhóm nghiên cứu chân thành cảm ơn Khoa Dược, Đại học Y Dược TP HCM cung cấp kinh phí tạo điều kiện nghiên cứu TÀI LIỆU THAM KHẢO 454 Anaissie EJ., McGinnis MR & Pfaller MA (2003) Clinical Mycology Churchill Livingstone, p 161-163 Capoor MR and cs (2005) Emergence of Non-albicans Candida Species and antifungal resistance in a tertiary care hospital Jpn J Infect Dis., 58, 344-348 Ernst EJ Rogers PD (2007), “Methods in Molecular medicine”, Antifungal agent - methods and protocols, Voll.188, Humana Press Inc, Totowa, NJ, pp 3-7 Sheehan DJ., Pfizer (2003), Susceptibility of global isolates of Candida species to fluconazole and Voriconazole by disk diffusion Foccus on Fungal Infections 13.1 The national committee for clinical laboratory standards (1996) Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of yeasts, Approve standard-second edition”, NCCLS document M27-A2.22(15) Trần Phủ Mạnh Siêu, Hồ Quang Thắng (2010) Tình hình nhiễm vi nấm Candida spp bệnh nhân nhập viện bệnh viện Nhiệt đới TP HCM năm 2009 Tạp chí Y học, phụ số 1, tập 14, tr 206-212 Chuyên Đề Dược Khoa ... KẾT QUẢ Mức độ nhạy cảm Candida spp với fluconazol ketoconazol xác định phương pháp khếch tán Bảng Mức độ nhạy cảm Candida spp với fluconazol xác định phương pháp khuếch tán Chủng nấm Candida. .. 16 μg/ml Bảng Nồng độ tối thiểu ức chế Candida spp fluconazol Dựa vào đường kính vòng ức chế nồng độ tối thiểu ức chế Candida spp., mức độ nhạy Candida spp với fluconazol ketoconazol tóm tắt... Mức độ nhạy cảm Candida spp với fluconazol ketoconazol xác định phương pháp pha loãng Theo hướng dẫn NCCLS M27-A2, mức độ kháng nấm men fluconazol ketoconazol qui định sau: Mức độ nhạy Candida spp