Candida miệng là một bệnh phổ biến thường gặp ở những đối tượng bị suy giảm miễn dịch và đặc biệt nghiêm trọng với những bệnh nhân ung thư đang trải qua liệu pháp hóa, xạ trị. Để điều trị, rất cần sơ bộ định danh và khảo sát mức độ nhạy cảm của các chủng Candida spp. với các thuốc kháng nấm, nhằm hạn chế tình trạng kháng thuốc. Nghiên cứu này thực hiện định danh sơ bộ các chủng Candida spp. gây bệnh và kiểm tra tính nhạy cảm/đề kháng thuốc của chúng nhằm phục vụ cho công tác phòng và điều trị.
Tạp chí Khoa học & Cơng nghệ Số 10 52 Khảo sát tính nhạy cảm số chủng Candida spp phân lập từ miệng bệnh nhân ung thư với số thuốc kháng nấm Đinh Quang Long, Phạm Bền Chí* Bộ mơn Vi sinh – Kí sinh trùng, Khoa Dược, Đại học Nguyễn Tất Thành * pbchi@ntt.edu.vn Tóm tắt Candida miệng bệnh phổ biến thường gặp đối tượng bị suy giảm miễn dịch đặc biệt nghiêm trọng với bệnh nhân ung thư trải qua liệu pháp hóa, xạ trị Để điều trị, cần sơ định danh khảo sát mức độ nhạy cảm chủng Candida spp với thuốc kháng nấm, nhằm hạn chế tình trạng kháng thuốc Với 60 chủng Candida spp phân lập được, thử nghiệm khảo sát hình thái khuẩn lạc mơi trường CHROMagar Candida, khả sinh bào tử bao dày môi trường thạch bột ngô thử nghiệm sinh ống mầm môi trường huyết người, sơ định danh đến mức loài 51 chủng: 34 chủng C albicans, 14 chủng C tropicalis, chủng C krusei Sử dụng phương pháp khuếch tán đĩa theo hướng dẫn CLSI M44 – A để đánh giá mức độ nhạy cảm 60 chủng Candida spp với thuốc kháng nấm clotrimazole, nystatin, amphotericin B, fluconazole miconazol Kết cho thấy, tất chủng nhạy cảm với nystatin, khơng có chủng đề kháng với với amphoterin B, thuốc nhóm azole bị đề kháng nhiều với với fluconazole (11,67%), miconazole (10%) clotrimazole (5%) Trong loài Candida spp phân lập được, C tropicalis có tỉ lệ đề kháng cao ® 2020 Journal of Science and Technology - NTTU Mở đầu Tỉ lệ mắc ung thư giới ngày gia tăng Điều đáng lo ngại là, đối tượng lại dễ bị nhiễm nấm miệng Candida, đặc biệt đối tượng trải qua liệu pháp xạ trị, hóa trị tác dụng phụ làm khơ miệng, giảm tiết nước bọt Các thuốc dùng điều trị Candida miệng phần lớn thuộc nhóm azole: miconazole (gel bơi), itraconazole, fluconazole (uống), clotrimazole (ngậm, bơi) nhóm polyene: nystatin (ngậm, bơi), amphotericin B (uống) Tình trạng đề kháng thuốc Candida có dấu hiệu gia tăng, đặc biệt nhóm thuốc azole Muốn lựa chọn thuốc, cần tiến hành định danh thử nhạy cảm Candida với thuốc kháng nấm Những năm gần đây, Việt Nam chưa có nhiều nghiên cứu khảo sát Candida đối tượng bệnh nhân ung thư Vì nghiên cứu thực định danh sơ chủng Candida spp gây bệnh kiểm tra tính nhạy cảm/đề kháng thuốc chúng nhằm phục vụ cho cơng tác phịng điều trị Đối tượng phương pháp nghiên cứu Đại học Nguyễn Tất Thành Nhận 24.10.2019 Được duyệt 09.06.2020 Cơng bố 29.06.2020 Từ khóa Candida spp., ung thư, định danh, thuốc kháng nấm, nhạy cảm 2.1 Đối tượng nghiên cứu 60 chủng Candida spp phân lập từ niêm mạc miệng bệnh nhân ung thư tại Bệnh viện Ung bướu Thành phố Hồ Chí Minh từ tháng 9/2018 đến tháng 4/2019 2.2 Vật liệu nghiên cứu Các đĩa tẩm thuốc thử nghiệm gồm: clotrimazol 10µg/đĩa (CLT), nystatin 100IU/đĩa (NY), amphotericin B 100IU/đĩa (AMB), fluconazole 25µg/đĩa (FLU) miconazol 10µg/đĩa (MIZ), xuất xứ Bioanalyse (Thổ Nhĩ Kỳ) Môi trường thử nghiệm gồm CHROMagar Candida (Himedia, Ấn Độ), Muller Hilliton Agar (Merck, Đức), Sabouraud Dextrose Agar (Merck, Đức), thạch bột ngô (Corn Meal Agar – Himedia, Ấn Độ) 2.2 Phương pháp nghiên cứu Các mẫu Candida spp sau li trích từ bệnh nhân bảo quản nước tiệt trùng nhiệt độ phòng Các mẫu sơ định danh thử nghiệm gồm khảo sát hình thái mơi trường CHROMagar Candida, thử nghiệm sinh bào tử bao dày thử nghiệm sinh ống mầm để phân biệt C.albicans, C.tropicalis, C.krusei Candida spp khác; khảo sát mức độ nhạy cảm mẫu Candida spp với số thuốc kháng nấm[1] Tạp chí Khoa học & Cơng nghệ Số 10 53 2.2.1 Khảo sát hình thái khuẩn lạc mơi trường CHROMagar Candida Các mẫu Candida spp phân lập môi trường CHROMagar Candida ủ điều kiện hiếu khí 370C 48 Tiến hành ghi nhận đặc điểm bề mặt, màu sắc kích thước khuẩn lạc Từ đặc điểm này, sơ định danh loài C.albicans (khuẩn lạc trơn, màu xanh lá), C.tropicalis (khuẩn lạc trơn, màu xanh tím xanh dương) C.krusei (khuẩn lạc nhăn, màu hồng viền trắng) với độ xác lên đến 99%[2] 2.2.2 Thử nghiệm sinh ống mầm[3] Các mẫu Candida spp hoạt hóa mơi trường SDA 48 Môi trường sử dụng thử nghiệm môi trường huyết người Sau đó, cấy vi nấm vào ống nghiệm có chứa 0,5ml huyết người ủ 370C Lấy giọt huyết đáy ống nghiệm, nhuộm fuchsin, xem kính hiển vi để ghi nhận xuất đặc điểm ống mầm - Nếu thấy có ống mầm: sơ xác định vi nấm C.albicans; - Nếu không thấy ống mầm: C.non-albicans 2.2.3 Thử nghiệm sinh bào tử bao dày[3] Các mẫu Candida spp hoạt hóa môi trường SDA 48 Môi trường sử dụng thử nghiệm sinh bào tử bao dày môi trường thạch bột ngô bổ sung tween 80 Vi nấm cấy sâu vào lòng thạch thử nghiệm thành hai đường song song đường zigzac bề mặt thạch Đậy lamelle lên đường cấy ủ nhiệt độ phịng 48 Sau đó, soi trực tiếp kính hiển vi quang học vật kính 40X để ghi kết thử nghiệm sinh bào tử bao dày gồm trường hợp sau: - Nếu thấy hạt men: khơng thuộc chi Candida; - Nếu thấy hạt men sợi nấm giả: C.non-albicans; - Nếu thấy hạt men, sợi nấm giả bào tử bao dày: C albicans 2.2.4 Khảo sát mức độ nhạy cảm cảu Candida spp với số thuốc kháng nấm Môi trường thử nghiệm: Môi trường MHA bổ sung 2% glucose xanh methylene 0,5μg/ml Sử dụng đĩa petri đường kính 90mm với bề dày lớp thạch 4mm, khơng nên q dày q mỏng làm kháng sinh khuếch tán theo chiều sâu hay chiều ngang làm sai kết Vi nấm thử nghiệm: Vi nấm hoạt hóa phân lập mơi trường SDA với điều kiện ủ 370C 48 Sau đó, tiến hành chuẩn bị huyền dịch vi nấm Lấy khoảng khuẩn lạc nấm có đường kính khoảng 1mm hòa vào ống nghiệm chứa 9ml nước muối sinh lí có 0,05% Tween 80, vortex dịch nấm 20 – 30 giây Điều chỉnh dịch treo nấm dịch đệm Xác định lại nồng độ vi nấm máy đo OD bước sóng 530nm với giá trị OD xấp xỉ 0,1 (0,08 – 0,12), tương đương với – × 106 tế bào/ml Phương pháp khuếch tán đĩa: Dùng que vô trùng thấm huyền dịch vi nấm trải bề mặt thạch Sau trải, để khô mặt thạch 370C 15 phút trước tiến hành đặt đĩa kháng nấm Dùng kẹp tiệt khuẩn để lấy đĩa giấy đặt lên mặt thạch cho đĩa giấy tiếp xúc hoàn toàn mặt thạch, khoảng cách đĩa giấy đĩa giấy với thành đĩa petri phải phù hợp Điều kiện ủ 370C 48 Thử nghiệm tiến hành lặp lại lần Đo đường kính vịng kháng nấm đối chiếu theo bảng tham chiếu để xác định mức độ nhạy cảm thuốc vi nấm gồm 03 mức: nhạy cảm (S), nhạy cảm trung gian (I) đề kháng (R) Bảng Bảng tham chiếu đường kính vịng kháng nấm (theo CLSI thơng tin nhà sản xuất) Thuốc kháng nấm Clotrimazole Nystatin Amphotericin B Fluconazole Miconazole STT Đường kính vòng kháng nấm (mm) S I R ≥ 20 12 – 19 ≤ 11 ≥ 15 10 – 14 < 10 ≥ 15 10 – 14 < 10 ≥ 19 15 – 18 ≤ 14 ≥ 20 12 – 19 ≤ 11 Nồng độ/đĩa 10µg 100U 100U 25µg 10µg Kết định danh sơ 60 chủng Candida spp thể Bảng Kết bàn luận 3.1 Sơ định danh Bảng Kết định danh sơ 60 chủng Candida spp STT Mẫu 1 – 3XL – – 7XL – 8XL – 9XL – 11 – 13XLB – 14a – 15XL – 24 – 25 – 26a – 26b – 27 – 28 – 30 – 32 – 34 – 38 – 41XL – 44 – 45 – 49 – 53 – 54 – 55 – 57 – 61 Hình thái khuẩn lạc Khuẩn lạc trơn, màu xanh Ống mầm Bào tử bao dày Kết luận sơ Số lượng (tỉ lệ) + + C.albicans 34 (56,7%) Đại học Nguyễn Tất Thành Tạp chí Khoa học & Cơng nghệ Số 10 54 – 62 – 63 – 66 – 72 – 75 – 68 – 69 Khuẩn lạc trơn, 3XD – 4XMN – – 5XL – màu xanh dương 14b – 16 – 36 – 56 – 58 – 65 – 67 Khuẩn lạc nhăn, 6THC – 8TX – 41T màu hồng, viền trắng 8TT – 10T – 13T – 29 – 39 Khuẩn lạc trơn, – 41 trắng – 46T – 59 – 74 màu hồng Với cỡ mẫu thực nghiên cứu 60, thử nghiệm áp dụng sơ định danh 51 mẫu đến mức loài, chiếm tỉ lệ 85% Kết nghiên cứu cho thấy C.albicans loài chiếm ưu gây bệnh miệng bệnh nhân ung thư - chiếm 56,7%, loài C.non-albicans chiếm 43,3% Trong số loài C.non-albicans, C.tropicalis + - C.tropicalis (5%) - - C.tropicalis 11 (18,3%) - - C.krusei (5%) - - Candida spp (15%) chiếm tỉ lệ cao (23,3%), C.krusei (5%) loài Candida spp khác (15%) Các mẫu nghi ngờ C.albicans cho khuẩn lạc màu xanh môi trường CHROMagar Candida, đồng thời tạo ống mầm môi trường huyết bào tử bao dày mơi trường bột ngơ Hình Đặc điểm hình thể C albicans mơi trường Các mẫu nghi ngờ C.krusei tạo khuẩn lạc nhăn, màu hồng nhạt, viền trắng CHROMagar Candida, thử nghiệm sinh ống mầm bào tử bao dày âm tính Hình Khuẩn lạc C krusei mơi trường CHROMagar Candida Các mẫu nghi ngờ C.tropicalis tạo khuẩn lạc màu xanh dương môi trường CHROMagar Candida không sinh bào tử bao dày thạch bột ngơ Có 3/13 Đại học Nguyễn Tất Thành chủng C.tropicalis (mẫu 2, 68, 69) cho kết dương tính với thử nghiệm sinh ống mầm Kết phù hợp với nhiều nghiên cứu khả sinh ống mầm C.tropicalis, điển hình nghiên cứu vào năm 1975 Huppert M cộng sử dụng thử nghiệm sinh ống mầm để xác định nhanh 46 loài nấm men cho kết C.albicans C.stellatoidea sản xuất ống mầm C.tropicalis tạo cấu trúc giống ống mầm[4] Mặc dù thử nghiệm sinh ống mầm môi trường huyết coi thử nghiệm chuyên biệt Bộ Y tế khuyến cáo áp dụng phòng xét nghiệm để chẩn đoán phân biệt C.albicans, với kết nghiên cứu giúp khẳng định tầm quan trọng việc phối hợp thử nghiệm để định danh xác Candida spp phương pháp truyền thống Tạp chí Khoa học & Cơng nghệ Số 10 55 Hình Đặc điểm hình thể C tropicalis môi trường 3.2 Kết nhạy cảm Candida spp với số thuốc kháng nấm: Kết nhạy cảm Candida spp với số thuốc kháng nấm thể Bảng Bảng Tỉ lệ mức đáp ứng với số thuốc thử nghiệm Candida spp phân lập từ miệng bệnh nhân ung thư STT Thuốc CLT NY AMB FLU MCZ Nhạy cảm Số mẫu Tỉ lệ (%) 54 90 60 100 59 98,33 51 85 46 76,67 Mức độ nhạy cảm Nhạy cảm trung gian Số mẫu Tỉ lệ (%) 0 1,67 3,33 13,33 60 mẫu Candida spp phân lập có độ nhạy cảm cao với nystatin amphotericin B với tỉ lệ 100% 98,33%, nhạy cảm thấp với clotrimazole (90%), fluconazole (85%) thấp miconazole (76,67%) Kết phù hợp với nghiên cứu trước đây, tiêu biểu nghiên cứu Madiyal M vào năm 2016 với kết thử nhạy cảm 79 mẫu Candida spp cho thấy tất mẫu nhạy cảm với nystatin có 12 mẫu đề kháng fluconazole 14 mẫu nhạy cảm phụ thuộc liều với fluconazole[5] Kết thử nghiệm cho thấy, thuốc thử nghiệm nystatin nên lựa chọn ưu tiên điều trị bệnh Candida miệng Kết phù hợp với khuyến cáo Bộ Y Tế vào năm 2015 Điều đáng quan tâm khuyến cáo việc sử dụng thuốc thuộc nhóm azole fluconazole, ketoconazole cho bệnh nhân nặng, với kết nghiên cứu điều khơng cịn phù hợp tỉ lệ đề kháng cao, cụ thể 10% 11,67% miconazole fluconazole Khi so sánh kết nghiên cứu Đề kháng Số mẫu Tỉ lệ (%) 0 0 11,67 10 với khuyến cáo Hiệp hội bệnh nhiễm Hoa Kì 2016, có vài điểm cần lưu ý: Thứ nhất, khuyến cáo nêu, tình trạng bệnh nhẹ, sử dụng viên ngậm clotrimazole ưu tiên hàng đầu, lựa chọn thay hỗn dịch nystatin; với kết nghiên cứu cho thấy nhạy cảm chủng Candida spp với clotrimazole thấp so với nystatin Thứ hai, theo khuyến cáo nên sử dụng fluconazole cho tình trạng bệnh trung bình đến nặng; xảy tình trạng đề kháng với fluconazole, amphotericin B dạng hỗn dịch lựa chọn thay Trong đó, kết nghiên cứu lại cho thấy tỉ lệ nhạy cảm fluconazole thấp có ý nghĩa thống kê so với amphotericin B Những khác biệt số lượng mẫu nghiên cứu cịn có khác biệt đặc điểm địa người Việt Nam người Hoa Kì Tỉ lệ đáp ứng thuốc lồi, nhóm loài Candida spp với loại thuốc kháng nấm thử nghiệm thể Bảng Bảng Tỉ lệ đáp ứng thuốc lồi/nhóm lồi Candida spp với loại thuốc kháng nấm thử nghiệm Thuốc CLT NY AMB S I R S I R S I C.albicans 34 (100%) 0 34 (100%) 0 34 (100%) C.tropicalis (57,14 %) (21,43%) (21,43%) 14 (100%) 0 14 (100%) C.krusei (100%) 0 (100%) 0 (66,7%) (33,3%) Candida spp (100%) 0 (100%) 0 (100%) Đại học Nguyễn Tất Thành Tạp chí Khoa học & Công nghệ Số 10 56 FLU MCZ R S I R S I R 34 (100%) 0 34 (100%) 0 (50%) (7,4%) (42,86%) (21,43%) (35,71%) (42,86%) C.albicans tác nhân chủ yếu gây tình trạng Candida miệng bệnh nhân ung thư tham gia thử nghiệm Tuy nhiên, tất chủng C.albicans phân lập nhạy cảm với loại thuốc thử nghiệm với tỉ lệ 100% Đây tín hiệu tốt sở để bác sĩ điều trị có nhiều lựa chọn việc điều trị bệnh Candida miệng C.albicans gây Tất mẫu C.tropicalis nhạy cảm với nystatin amphotericin B với tỉ lệ 100% Điều đáng quan tâm tỉ lệ đề kháng với thuốc nhóm azole (clotrimazole, fluconazole, miconazole) C.tropicalis cao, 21,43%, 42,86% 42,86% C.tropicalis có mức độ đáp ứng thuốc thấp nghiên cứu mẫu 4XMN – 36 – 68 đề kháng loại thuốc nhóm azole thử nghiệm; mẫu – 16 – 65 kháng fluconazole miconazole Trong thuốc azole nghiên cứu, miconazole thuốc khơng cịn tác động mạnh in vitro C.tropicalis, với mức độ nhạy cảm có 21,43%, tỉ lệ nhạy cảm trung gian đề kháng cao, 35,71% 42,86% Trong nay, lựa chọn bác sĩ điều trị nhiễm nấm Candida miệng bệnh nhân ung thư miconazole (chế phẩm dạng gel Daktarin – dạng bào chế sử dụng tại chỗ nên hạn chế tác dụng phụ), với kết cung cấp thơng tin hữu ích việc cân nhắc sử dụng chế phẩm chứa miconazole để điều trị Candida miệng lâm sàng, đặc biệt trường hợp C.tropicalis Cả mẫu C.krusei nhạy cảm với clotrimazole nystatin Đáng lưu ý chủng C.krusei 41T xuất tình Đại học Nguyễn Tất Thành (66,7%) (33,3%) (66,7%) (33,3%) 0 (88,9%) (11,1%) (77,8%) (22,2%) trạng đề kháng với fluconazole, nhạy cảm trung gian với amphotericin B miconazole Trong nghiên cứu này, có mẫu khơng thể định danh sơ đến mức lồi Khi đánh giá mức độ nhạy cảm mẫu với thuốc kháng nấm thử nghiệm cho kết mẫu nhạy cảm 100% với clotrimazole, nystatin amphotericin B, khơng có chủng đề kháng với tất loại thuốc thuốc có mức độ nhạy cảm thấp fluconazole miconazole với tỉ lệ 88,9% 77,8% Kết luận Tóm lại, nghiên cứu định danh sơ đến mức loài 51/60 chủng Candida spp gồm C.albicans (34), C.tropicalis (14) C.krusei (3) phân lập từ miệng bệnh nhân điều trị ung thư liệu pháp xạ trị tại Bệnh viện Ung bướu thành phố Hồ Chí Minh Đồng thời, nghiên cứu đánh giá mức độ nhạy cảm chủng Candida spp phân lập với số thuốc kháng nấm (clotrimazole, nystatin, amphotericin B, fluconazole miconazole) Thử nghiệm cho kết C.albicans nhạy cảm hoàn toàn với thuốc thử nghiệm; đó, lồi C.non-albicans có xu hướng tăng dần mức độ đề kháng thuốc, đặc biệt C.tropicalis đề kháng cao với thuốc nhóm azole Lời cảm ơn Nghiên cứu tài trợ Quĩ Phát triển Khoa học Công Nghệ Đại học Nguyễn Tất Thành đề tài mã số 2019.01.63 Tạp chí Khoa học & Cơng nghệ Số 10 57 Tài liệu tham khảo Alhussaini M S., El-Tahtawi N F., Moharram A M (2013), "Phenotypic and molecular characterization of Candida species in urine samples from renal failure patients ", Science Journal of Clinical Medicine, 2(1), pp 14-25 Odds F C et al (1994), "CHROMagar Candida, a new differential isolation medium for presumptive identification of clinically important Candida species", Journal of Clinical Microbiology 32 (8), pp 1923-1929 Nguyễn Đinh Nga (2013), NXB Giáo dục Việt Nam, tr 210 - 222 Huppert M et al (1975), "Rapid methods for identification of yeasts", Journal of Clinical Microbiology (1), pp 21-34 Madiyal M et al (2016), "Clinical and microbiological profile of Candida isolates from oral candidiasis in patients undergoing radiotherapy for head and neck malignancy", Asian J Pharm Clin Res (3), pp 1-4 The antifungal susceptibility of Candida spp isolated from oral’s cancer patients Dinh Quang Long, Pham Ben Chi* Microbiology and Parasitology Department, Faculty of Pharmacy, Nguyen Tat Thanh University * pbchi@ntt.edu.vn Abstract Oral candidiasis is a common disease in immunocompromised individuals and especially serious to cancer patients that are undergoing chemotherapy and radiation therapy Therefore it is necessary to identify and evaluate their susceptibility to antifungal agents in vitro Via conventional techniques such as CHROMagar Candida, chlamydospore formation test on Corn Meal Agar, and germ tube test on human serum, we identified 51/60 strains included: 34 strains of C albicans, 14 strains of C tropicalis and strains of C krusei Antifungal susceptibility of 60 isolated strains was evaluated by CLSI M44-A disk diffusion method for clotrimazole, nystatin, amphotericin B, fluconazole and miconazole All isolated strains were sensitive to nystatin and none were resistant to amphotericin B All C.albicans isolates were susceptible to clotrimazole, nystatin, amphotericin B, fluconazole, and miconazole The resistance rate for fluconazole, miconazole, and clotrimazole in this study were 11.67%, 10% and 5% respectively In isolated Candida spp., the resistance rate for antifungal agents of C tropicalis was the highest Keywords Candida spp., cancer, identify, antifungal agents, susceptibility Đại học Nguyễn Tất Thành ... Kết nhạy cảm Candida spp với số thuốc kháng nấm: Kết nhạy cảm Candida spp với số thuốc kháng nấm thể Bảng Bảng Tỉ lệ mức đáp ứng với số thuốc thử nghiệm Candida spp phân lập từ miệng bệnh nhân. .. mức độ nhạy cảm mẫu với thuốc kháng nấm thử nghiệm cho kết mẫu nhạy cảm 100% với clotrimazole, nystatin amphotericin B, khơng có chủng đề kháng với tất loại thuốc thuốc có mức độ nhạy cảm thấp... (42,86%) C.albicans tác nhân chủ yếu gây tình trạng Candida miệng bệnh nhân ung thư tham gia thử nghiệm Tuy nhiên, tất chủng C.albicans phân lập nhạy cảm với loại thuốc thử nghiệm với tỉ lệ 100% Đây