KHẢO SÁT MỨC ĐỘ MẪN CẢM VỚI KHÁNG SINH CỦA VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI PHÂN LẬP TỪ PHÂN GIA SÚC

Đề tài được thực hiện với mục đích góp phần cho việc chọn lựa liệu pháp điều trị bằng kháng sinh trên một số loài gia súc heo, bò và xây dựng cơ sở dữ liệu về đề kháng kháng sinh trên cá

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HỒ CHÍ MINH

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT MỨC ĐỘ MẪN CẢM VỚI KHÁNG SINH

CỦA VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI

PHÂN LẬP TỪ PHÂN GIA SÚC

Họ và tên sinh viên: Đào Thị Phương Lan Ngành: Dược Thú Y

Niên khóa: 2004 – 2009

Tháng 09/2009

HẢO SÁT MỨC ĐỘ MẪN CẢM VỚI KHÁNG SINH CỦA VI KHUẨN

Escherichia coli PHÂN LẬP TỪ PHÂN GIA SÚC

Tác giả

ĐÀO THỊ PHƯƠNG LAN

Khoá luận được đệ trình để đáp ứng yêu cầu cấp bằng

Bác sỹ Thú Y chuyên ngành Dược

Giáo viên hướng dẫn:

TS VÕ THỊ TRÀ AN BSTY LÊ HỮU NGỌC

LỜI CẢM ƠN

™ Tôi xin gửi lời biết ơn sâu sắc đến ban giám hiệu Trường Đại học Nông Lâm

Tp HCM, ban chủ nhiệm khoa Chăn Nuôi – Thú Y cùng toàn thể thầy cô đã tạo điều kiện học tập và truyền đạt những kiến thức quí báu cho tôi trong suốt thời gian khoá học

™ Em mãi khắc ghi công ơn cô Võ Thị Trà An, người giáo viên đã tận tình dạy

dỗ, hướng dẫn và động viên em trong cuộc sống cũng như trong thời gian thực hiện đề tài

™ Em chân thành cảm ơn thầy Lê Hữu Ngọc đã giúp đỡ, hướng dẫn, góp ý và tạo mọi điều kiện thật tốt để em hoàn thành đề tài

™ Em cũng xin cảm ơn chị Bùi Thị Thu Trang và anh Nguyễn Thanh Tùng đã truyền đạt kinh nghiệm và giúp đỡ em trong thời gian qua

™ Xin cảm ơn đến các bạn trong phòng thực hành Kiểm Nghiệm Thú Sản và Môi Trường Sức Khỏe Vật Nuôi, em Minh Thành, chị Tuyền, bạn Trí Thức… đã an

ủi và giúp đỡ tôi rất nhiều

™ Để có được ngày hôm nay, con xin kính dâng lên ba mẹ tấm lòng hiếu thảo và vâng lời Ba mẹ đã hy sinh và chịu rất nhiều khổ cực vì con Với con, ba mẹ là những người thầy dạy con đứng lên sau những lần vấp ngã và là những người bạn lớn nhất của cuộc đời con

™ Con thật may mắn khi có bên cạnh rất nhiều người quan tâm và thương yêu như

bà Ngoại, bác Hát, chị hai… xin kính gửi mọi người lời cảm ơn và tình yêu thương của con

™ Và cuối cùng, xin cảm ơn đến tất cả các bạn bè trong và ngoài lớp Dược Y 30 Những người đã luôn ở bên cạnh chia sẻ buồn vui, âu lo cùng tôi Chúc cho tình cảm ấy luôn bền chặt và đoàn kết

Đào Thị Phương Lan

TÓM TẮT ĐỀ TÀI

Đề tài ”Khảo sát mức độ mẫn cảm với kháng sinh của vi khuẩn Escherichia coli

phân lập từ phân gia súc” được tiến hành tại phòng thực hành Kiểm Nghiệm Thú Sản

và Môi Trường Sức Khỏe Vật Nuôi, khoa Chăn Nuôi – Thú Y, Trường Đại học Nông Lâm Tp HCM trong thời gian từ tháng 05/2009 đến tháng 08/2009 Đề tài được thực hiện với mục đích góp phần cho việc chọn lựa liệu pháp điều trị bằng kháng sinh trên một số loài gia súc (heo, bò) và xây dựng cơ sở dữ liệu về đề kháng kháng sinh trên các loài gia súc này tại Tp Hồ Chí Minh và các tỉnh lân cận

100 gốc vi khuẩn phân lập từ phân gia súc (heo, bò) được xác định độ mẫn cảm với 11 loại kháng sinh thử nghiệm bằng phương pháp khuếch tán trên thạch Các gốc

đề kháng với ceftazidime được xác định emzyme β-lactamase phổ rộng bằng phản ứng

Double disc test và AmpC disc test Kết quả thu được như sau:

- Kháng sinh vẫn còn khả năng chống E coli (in vitro) là ceftazidime, kế đến

là amoxicillin/clavulanic acid, norfloxacin với tỉ lệ các gốc E.coli mẫn cảm lần lượt là

93%, 73% và 66%

- Các kháng sinh đã bị E coli đề kháng là tetracycline, ampicillin,

trimethoprim/sulfamethoxazole, chloramphenicol với tỉ lệ đề kháng lần lượt là 77%, 70%, 69%, 60%

- Các kháng sinh có tỉ lệ các gốc E coli nhạy cảm trung gian cao bao gồm

colistin (với 55% nhạy cảm trung gian và 38% đề kháng), cephalexin (với 45% nhạy cảm trung gian và 30% đề kháng); kanamycin (với 20% nhạy cảm trung gian và 47%

đề kháng), gentamicin (15% nhạy cảm trung gian và 45% đề kháng)

- Trong 5 gốc vi khuẩn E coli đề kháng với ceftazidime, chúng tôi phát hiện

1 gốc (kí hiệu H5.2) có chứa enzyme β-lactamase phổ rộng Không tìm thấy gốc nào

có chứa enzyme β-lactamase phổ rộng nhóm AmpC

MỤC LỤC

Trang

Trang tựa i

Lời cảm ơn ii

Tóm tắt iii

Danh sách chữ viết tắt vi

Danh sách bảng vii

Danh sách hình, biểu đồ viii

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu 2

1.3 Yêu cầu 2

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN 3

2.1 Sơ lược về Escherichia coli 3

2.2 Những kiến thức cơ bản về kháng sinh 4

2.2.1 Khái niệm 4

2.2.2 Phân loại 4

2.3 Đề kháng kháng sinh 6

2.4 Biện pháp hạn chế sự đề kháng thuốc 8

2.5 Biện pháp kiểm soát đề kháng kháng sinh 8

2.6 Kháng sinh nhóm cephalosporin 9

2.7 Đề kháng với nhóm β-Lactam 12

2.8 Enzyme β-lactamase và các chất ức chế β-lactamase 13

2.8.1 Enzyme β-lactamase 13

2.8.2 Các chất ức chế β-lactamase 14

2.9 Các phương pháp khảo sát sự nhạy cảm của vi khuẩn đối với kháng sinh 15

2.9.1 Phương pháp định tính 15

2.9.1.1 Các yếu tố có thể ảnh hưởng đến kết quả phản ứng 15

2.9.1.2 Chọn lựa đĩa kháng sinh 16

2.9.2.3 Qui trình kiểm tra chất lượng 17

2.9.2 Phương pháp định lượng 19

2.10 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 19

2.10.1 Trong nước 19

2.10.2 Ngoài nước 20

CHƯƠNG 3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH 22

3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện 22

3.1.1 Thời gian 22

3.1.2 Địa điểm 22

3.2 Nội dung nghiên cứu 22

3.3 Vật liệu 22

3.3.1 Đối tượng khảo sát 22

3.3.2 Thiết bị và dụng cụ 24

3.3.3 Môi trường, hóa chất 24

3.4 Phương pháp tiến hành 25

3.4.1 Cách thực hiện 25

3.4.2 Tăng sinh gốc vi khuẩn chuẩn bị làm kháng sinh đồ 26

3.4.3 Phương pháp kháng sinh đồ 29

3.4.4 Phản ứng xác định sự hiện diện β–lactamse phổ rộng (Double Disc Test) 30

3.4.5 Phản ứng xác định sự hiện diện β-lactamse phổ rộng nhóm AmpC 31

3.5 Chỉ tiêu theo dõi 31

3.6 Xử lý số liệu 31

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32

4.1 Xác định độ mẫn cảm của các gốc E coli với 11 loại kháng sinh thử nghiệm bằng phương pháp kháng sinh đồ 32

4.2 Xác định emzyme β-lactamase phổ rộng trên các gốc E coli bằng phản ứng double disc test và AmpC disc test 40

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 43

5.1 Kết luận 43

5.2 Đề nghị 43

TÀI LIỆU THAM KHẢO 45

PHỤ LỤC 47

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ESLBL Extended-Spectrum Beta-Lactamase

ATCC American Type Culture Collection

EMB Agar Eosin Methylen Blue

VP Voges-Proskauer

NCCLS National Committee for Clinical Laboratory Standards

DANH SÁCH CÁC BẢNG Trang

Bảng 3.1: Nguồn gốc các gốc vi khuẩn thu thập được 23

Bảng 3.2: Nguồn gốc các chủng vi khuẩn đối chứng 23

Bảng 4.1: Kết quả kháng sinh đồ của 2 chủng ATCC 25922 và 35218 32

Bảng 4.2: Kết quả kháng sinh đồ của vi khuẩn E coli 34

Bảng 4.3: Tính nhạy cảm của vi khuẩn E.coli theo nguồn gốc phân lập 39

Bảng 4.4: Kết quả phản ứng xác định enzyme β -lactamase phổ rộng 40

DANH SÁCH CÁC HÌNH, BIỂU ĐỒ

Trang

Hình

Hình 2.1: công thức cấu tạo của cephalosporin 9

Hình 3.1: Độ đục chuẩn Mc Farland 0.5 24

Hình 3.2: Đĩa giấy tẩm các loại kháng sinh 25

Hình 3.3: Khuẩn lạc tím ánh kim của E coli trên môi trường EMB 27

Hình 3 4: Kết quả phản ứng sinh hóa của khuẩn E coli trên từng loại môi trường

citrate (-), methyl red (+), Voges-Proskauer (-) 28

Hình 3 5: Khuẩn lạc E coli mọc trên môi trường thạch NA 28

Hình 3.6: Các kháng sinh được đặt đều trên 2 đĩa petri chứa môi trường MHA 30

Hình 3.7: Phản ứng xác định enzyme β-lactamase phổ rộng 30

Hình 3.8: Phản ứng xác định enzyme β-lactamase nhóm AmpC 31

Hình 4 1: Vòng vô khuẩn của vi khuẩn E coli với 11 loại kháng sinh trên 2 đĩa MHA sau khi ủ 370C/ 24 giờ 33

Hình 4.2: Kết quả dương tính của vi khuẩn E coli với phản ứng xác định enzyme β -lactamase phổ rộng 41

Hình 4.3: Kết quả âm tính của vi khuẩn E coli với phản ứng xác định enzyme β -lactamase phổ rộng nhóm AmpC 42

Biểu đồ Biểu đồ 4.1: Tỉ lệ nhạy cảm của E coli với từng loại kháng sinh 35

Biểu đồ 4.2: Tỉ lệ đề kháng của E coli với từng loại kháng sinh 36

Biểu đồ 4.3: Tỉ lệ nhạy cảm trung gian của E coli với từng loại kháng sinh 38

Chương 1

MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề

Escherichia coli là vi khuẩn cộng sinh chiếm ưu thế, tồn tại tự nhiên trong hệ vi

sinh vật đường ruột của người và động vật Tuy nhiên, khi có điều kiện thích hợp, một

số nhóm E coli gây độc tăng sinh mạnh, trở thành nguyên nhân gây tiêu chảy nghiêm trọng trên người và gia súc, đặc biệt là gia súc non Ngoài ra, E coli thải qua phân ra

môi trường bên ngoài dễ dàng trở thành nguyên nhân gây ô nhiễm nước và thực phẩm

Khi có bệnh nhiễm trùng xảy ra thì kháng sinh luôn được nhắc đến như là một phương pháp trị liệu đặc hiệu Để sử dụng kháng sinh có hiệu quả trong phòng trị bệnh cho gia súc, gia cầm, người sử dụng kháng sinh cần phải biết loại kháng sinh đó có mẫn cảm với các chủng vi khuẩn gây bệnh hay không Muốn vậy, các dữ liệu về nhạy cảm kháng sinh phải được khảo sát và áp dụng trên các vi khuẩn gây bệnh cho từng ca bệnh hoặc từng khu vực địa lí

Trong các kháng sinh sử dụng cho gia súc và gia cầm, kháng sinh nhóm lactam, đặc biệt là các cephalosporin thế hệ III bắt đầu được sử dụng rộng rãi Kháng sinh nhóm cephalosporin thế hệ III có phổ kháng khuẩn rộng trên các vi khuẩn G+ và G-, chúng lại có đặc tính dược động học tốt, dễ hấp thu và phân bố đều khắp các mô trong cơ thể Việc đề kháng với các kháng sinh nhóm này của các chủng vi khuẩn sẽ gây khó khăn trong công tác điều trị Đặc biệt, nếu vi khuẩn có khả năng sản sinh các

β-β-lactamase phổ rộng (extended-spectrum beta-lactamase, ESBL) thì chúng sẽ có thể

đề kháng với rất nhiều kháng sinh trong họ β-lactam Do đó, tầm soát sự hiện diện các enzyme này trong các chủng vi khuẩn sẽ góp phần trong việc chọn lựa các kháng sinh thích hợp cho điều trị

Vì lí do trên, chúng tôi tiến hành đề tài “Khảo sát mức độ mẫn cảm với kháng

sinh của vi khuẩn Escherichia coli phân lập từ phân gia súc” dưới sự hướng dẫn của

TS Võ Thị Trà An, Bộ môn Nội Dược, Khoa CN-TY, và sự giúp đỡ của BSTY Lê Hữu Ngọc, Bộ môn Cơ Thể Ngoại Khoa, Khoa CN-TY

1.2 Mục tiêu

Góp phần cho việc chọn lựa liệu pháp điều trị nhiễm khuẩn E coli bằng kháng

sinh trên một số loài gia súc (heo, bò) và xây dựng cơ sở dữ liệu về đề kháng kháng

sinh của E coli trên các loài gia súc này tại Tp Hồ Chí Minh và các tỉnh lân cận

1.3 Yêu cầu

Giữ gốc vi khuẩn E coli gây bệnh phân lập được từ gia súc

Khảo sát mức độ mẫn cảm kháng sinh của các gốc vi khuẩn thu được

Kiểm tra sự hiện diện của ESBL trong các gốc E coli có đề kháng với kháng

sinh cephalosporin thế hệ III

Chương 2

TỔNG QUAN

2.1 Sơ lược về Escherichia coli:

E coli sống bình thường trong ruột người và động vật, nhất là ở ruột già (vùng

hồi manh tràng) Vi khuẩn theo phân ra ngoài thiên nhiên, do đó còn được phát hiện trong đất, nước và không khí Đây là một trực khuẩn Gram âm, không bào tử, tạo giáp

mô mỏng, có lông quanh cơ thể, một số có lông bám (pili) Trong bệnh phẩm có khi

bắt màu lưỡng cực 2 đầu E coli là vi khuẩn hiếu khí hay yếm khí tùy nghi, nhiệt độ

thích hợp 370C, pH 7,4 Trên môi trường nuôi cấy chọn lọc EMB, E coli tạo khóm

ánh kim Có thể xác định vi khuẩn này nhờ các đặc tính sinh hóa: lên men sinh hơi lactose, glucose, galactose, mannite, lên men không đều saccarose, không lên men dextrin, glycogen Các phản ứng IMVIC (indol, methyl red, Vosges-Proskauer, citrate): +/- + - - Không tạo H2S và hoàn nguyên NO3 thành NO2 (Nitrate dương tính)

E coli có 4 loại cấu trúc kháng nguyên gồm: O, H, K, F Kháng nguyên O là

kháng nguyên chịu nhiệt, phân bố trên thành tế bào, được chia thành 4 nhóm lớn O I,

O II, O III, O IV với 150 loại kháng nguyên đơn giá Kháng nguyên K là loại kháng nguyên chịu nhiệt kém (dễ phá hủy 1000C trong vòng 1 giờ) Kháng nguyên gồm 4 loại A, B, L, và M Các kháng nguyên này có tính chất ngưng kết chéo với kháng nguyên thân O, vì vậy khi tiến hành thử ngưng kết cần phải đun sôi để loại bỏ kháng

nguyên E coli có khoảng 20 loại kháng nguyên H, ít có ý nghĩa trong chẩn đoán

Kháng nguyên lông bám (pili: F) giúp cho vi khuẩn bám chặt lên niêm mạc ruột và tiết độc tố gây bệnh

Bình thường E coli có sẵn trong ruột nhưng chỉ gây bệnh khi sức đề kháng của

con vật bị sút kém, khi quản lí kém, mất vệ sinh, con vật bị cảm lạnh Bệnh do nhiễm

E coli còn được gọi là bệnh colibacillosis thường xảy ra ở gia súc non Ở heo thường

có 3 loại E coli có liên quan: (i) Loại sinh độc tố đường ruột ETEC (Enterotoxigenic

E coli) gây tiêu chảy ở heo sơ sinh và cai sữa ETEC gây bệnh bằng cách tiết 2 độc tố

ST và LT (ii) Loại gây bệnh đường ruột EPEC (Enteropathogenic E coli) gây bệnh

tiêu chảy thường gặp trên heo lớn (iii) Loại gây phù thủng VTEC

(verocytotoxin-producing E coli): ngoại độc tố EDP (Edema Disease Principle) hay SLT (Shiga Like Toxin) vì gần giống độc tố của Shigella hay verotoxin do gây độc với tế bào Vero

Độc tố này tạo bệnh tích ở biểu mô của mạch máu và tạo bệnh tích thủy thủng Các serotype gây bệnh thủy thủng phổ biến là O138K81, O139K82, O141K85

Biểu hiện của bệnh do E coli gồm đi tháo dạ, phân xanh, mùi hôi thối Heo con

bỏ bú, gầy rạc Tỉ lệ chết cao ở heo sơ sinh, heo chết do phù thủng có biểu hiện xuất

huyết toàn thân Ngoài ra, E coli còn gây bệnh trên các loài khác như: tiêu chảy phân

trắng trên bê dưới 1 tuần tuổi; viêm nhiễm đường niệu trên chó; viêm rốn ở gà con,

nhiễm trùng huyết trên gà mọi lứa tuổi và thường kết hợp với Mycoplasma gallsepticum gây viêm túi khí, phúc mạc, viêm nhiễm buồng trứng (Tô Minh Châu và

Nhóm polypeptide: colistin, bacitracin, polymycin Kháng sinh colistin, polymyxin và polyen (chất kháng nấm) gắn kết trên các chất hóa học riêng biệt làm xáo trộn chức năng thẩm thấu khiến các chất trong bào tương như Mg2+, K+, Ca2+ thoát

ra ngoài (tác động như một chất tẩy loại cation) Bacitracin ngăn cản tiến trình tổng hợp thành tế bào vi khuẩn bằng cách gắn với isoprenyl phosphate tạo phức hợp vô dụng Trong khi đó, vancomycin ức chế ở một giai đoạn khác với việc ngăn cản sự di chuyển đường pentapeptide thành chuỗi đa phân tử bên ngoài màng tế bào

Nhóm tetracycline: tetracycline, oxytetracycline, chlotetracycline, doxycycline Kháng sinh nhóm tetracycline gắn vào tiểu đơn vị 30S và phong bế sự kết hợp của tRNA với mRNA, làm ngừng quá trình tổng hợp protein

Nhóm phenicol: chloramphenicol, thiamphenicol, florphenicol Kháng sinh

nhóm chloramphenicol gắn với tiểu đơn vị 50S, ức chế enzyme peptidyl transferase

không cho acid amin gắn vào chuỗi polypeptide Chloramphenicol có ái lực với cả ribosome của động vật hữu nhũ

Nhóm macrolide: erythromycin, spiramycin, tulathromycin, josamycin, tylosin… Nhóm kháng sinh gần gũi với macrolide: lincomycin, virginiamycin Kháng sinh nhóm macrolide tranh giành vị trí gắn ở ribosome và ngăn cản vị trí dịch chuyển các acid amin Các kháng sinh này ức chế tổng hợp protein của vi khuẩn

Nhóm sulfonamide: sulfaguanidin, sulfacetamid, sulfamethoxazole Sulfonamide đối kháng cạnh tranh với PABA (para-aminobenzoic acid) một tiền chất

để tổng hợp acid folic (động vật hữu nhũ dùng acid folic có sẵn trong thực phẩm còn

vi khuẩn phải tổng hợp folate) PABA kết hợp với pteroic acid hoặc glutamic acid để tạo pteroylglutamic acid (PGA), chất này giống như một coenzyme trong sự tổng hợp purin và timin PGA cũng là một phần của phân tử B12 có liên quan đến sự biến dưỡng acid amin và purin Do đó khi thiếu PABA sẽ gây thiếu purin, acid nucleic Điều này cũng giải thích tại sao các vi khuẩn tự tổng hợp được PABA thì đề kháng với sulfonamide và tại sao thymin, purin, methionin, và một số acid amin khác lại đối kháng hiệu quả với sulfonamide Sulfonamide chỉ có tác động kìm khuẩn

Nhóm diaminopyrimidine: trimethoprim, diaveridin… Trimethoprim ức chế

dihydrofolat reductase ngăn quá trình chuyển hóa dihydrololate thành tetrahydrofolate

(dạng hoạt động của acid folic)

Nhóm quinolone: acid nalidixic, flumequin, norfloxacin, ciprofloxacin

Quinolone ức chế mạnh sự tổng hợp DNA trong giai đoạn nhân đôi do ức chế DNA gyrase

Các nhóm khác: glycopeptide, pleuromutilin, polyetherionophore, nitrofurane (Võ Thị Trà An, 2007)

2.3 Đề kháng kháng sinh

Mặc dù việc sử dụng kháng sinh trong phòng, trị bệnh cho người và thú đem lại nhiều thành công và có hiệu quả kinh tế, nhưng đồng thời đã tạo một áp lực chọn lọc đối với vi khuẩn Việc dùng kháng sinh sẽ luôn tạo ra một sự đề kháng với chính nó ở một mức độ nhất định trong quần thể vi khuẩn Bằng chứng rõ ràng nhất là khi kiểm tra các chủng vi khuẩn thời tiền kháng sinh, các nhà khoa học không phát hiện ra sự đề kháng với kháng sinh cũng như bất kỳ gen liên quan đến tính trạng đề kháng thường gặp ở các chủng vi khuẩn lúc ấy Áp lực chọn lọc đối với sự đề kháng kháng sinh xuất phát từ nhiều nguồn như việc sử dụng kháng sinh trong phòng, trị bệnh cho động vật, kháng sinh dùng với mục đích kích thích tăng trọng trong thức ăn gia súc

Hiện tượng đề kháng kháng sinh ngày càng gia tăng trong nhiều loài vi khuẩn gây bệnh cho người và gia súc đang là mối quan tâm lo lắng cho toàn xã hội Vi khuẩn

đề kháng kháng sinh làm giới hạn khả năng điều trị bệnh nhiễm trùng, một số trường hợp dẫn đến tử vong do vi khuẩn gây bệnh đề kháng với hầu hết kháng sinh dùng trong lâm sàng Hơn thế nữa, các chủng vi khuẩn không gây bệnh nhưng đề kháng với kháng sinh hay đa đề kháng còn là nơi tồn trữ tính kháng thuốc để truyền lại cho những vi khuẩn gây bệnh khác

Đề kháng với kháng sinh được phân loại gồm đề kháng tự nhiên (insitrinsic resistance) và đề kháng thu nhận (acquired resistance) Vi khuẩn đề kháng tự nhiên với kháng sinh do chúng không có cơ chế tế bào cần thiết cho kháng sinh tác động Ví dụ,

Enterobacteriaceae kháng vancomycin, vi khuẩn G+ kháng polymyxin B Đề kháng

thu nhận có thể xảy ra do đột biến nhiễm sắc thể của tế bào vi khuẩn hoặc do vi khuẩn nhận các vật liệu di truyền (gene) liên quan đến kháng thuốc từ vi khuẩn khác Do vi khuẩn có chu kỳ phát triển từ vài giây đến vài phút nên chúng rất linh hoạt trong biến đổi để phù hợp với những thay đổi của môi trường sống Đề kháng do đột biến nhiễm sắc thể nhìn chung xảy ra từ từ và là một tiến trình tích lũy Một đột biến điểm có thể

không dẫn đến sự đề kháng kiểu hình nhưng một đột biến điểm tiếp theo có thể làm thay đổi mức độ nhạy cảm với kháng sinh của vi khuẩn (đề kháng với quinolone) Tần

số xuất hiện đề kháng do đột biến trong phòng thí nghiệm (in vitro) là khoảng 1/108 tế bào đối với streptomycin, nalidixic acid và rifampin; ở tần suất thấp hơn với erythromycin và dường như không xảy ra với vancomycin và polymycin Tuy nhiên trên thực tế lâm sàng (in vivo), các kiểu đột biến này không đáng kể do hệ thống phòng vệ của cơ thể tiêu diệt đa số các chủng vi khuẩn đề kháng dạng này

Trong khi đó, đề kháng thu nhận các gene có khả năng di chuyển thường đạt mức đề kháng cao và thuộc dạng “tất cả hoặc không có gì” (all or none) Gene kháng thuốc truyền từ vi khuẩn cho sang vi khuẩn nhận có thể hiện được kiểu hình (all) hoặc không thể hiện được tính trạng kháng thuốc (none) ở vi khuẩn nhận Đề kháng do trao đổi thông tin di truyền đóng vai trò quan trọng trong sự lan tràn đề kháng với kháng sinh Do vi khuẩn không có màng nhân, gene kháng thuốc có khả năng di chuyển dễ dàng hơn từ chromosome đến các vật liệu di truyền khác trong tế bào như plasmid Giữa các vi khuẩn khác nhau, gene kháng thuốc có thể được trao đổi qua 3 cách; (1) Tải nạp là quá trình DNA được thực khuẩn thể (phage) sát nhập và chuyển cho một vi khuẩn khác; (2) Biến đổi hay còn gọi là chuyển dạng (transformation) là quá trình một đoạn DNA trần (có nguồn gốc từ một đoạn tế bào vi khuẩn chết) đi vào một tế bào vi khuẩn và gắn vào các yếu tố di truyền của vi khuẩn đó nhờ tương đồng nhiễm sắc thể (crossover); (3) Tiếp hợp (conjugation) là quá trình tế bào vi khuẩn cho (donor) tổng hợp lông giới tính (sex pili) và gắn vào tế bào vi khuẩn nhận (recipient) Từ cầu nối này, một bản sao (copy) gen kháng thuốc nằm trên plasmid được chuyển cho vi khuẩn nhận Trong quá trình tải nạp, vi khuẩn cần có điểm tiếp nhận phù hợp với phage trên

bề mặt của chúng Trong quá trình biến đổi, DNA phải chèn vào đoạn gen nhờ tương đồng về di truyền Như vậy với cả hai tiến trình này, vi khuẩn phải tương đồng về di truyền để sự tái tổ hợp có thể xảy ra Dạng trao đổi này chỉ có thể xảy ra ở các loài vi khuẩn có mối liên hệ về di truyền Trong khi đó, tiến trình tiếp hợp không có giới hạn này

Sự đề kháng kháng sinh của vi khuẩn đã được nghiên cứu và ghi nhận với các

cơ chế chủ yếu sau: (1) sản xuất enzyme làm vô hoạt kháng sinh; (2) tạo ra enzyme thay thế cho enzyme mà kháng sinh tác động vào; (3) đột biến ở điểm tiếp nhận làm

giảm gắn kết của kháng sinh với điểm tiếp nhận; (4) sửa đổi điểm tiếp nhận để giảm gắn kết của kháng sinh với điểm tiếp nhận; (5) giảm hấp thu kháng sinh vào tế bào vi khuẩn; (6) đẩy kháng sinh ra ngoài bằng bơm thoát dòng làm nồng độ kháng sinh trong tế bào giảm; (7) tạo quá nhiều điểm gắn kết kháng sinh

Dường như chúng ta không thể hoàn toàn loại bỏ được hiện tượng đề kháng với kháng sinh một khi chúng xuất hiện Ngoài sự linh hoạt do đặc tính sinh học, vi khuẩn còn có khả năng bảo tồn sự đề kháng một khi gene kháng thuốc nằm trên nhiễm sắc thể của nó Ngược lại, khi yếu tố di truyền liên quan đến đề kháng nằm trên plasmid, nhất là plasmid tiếp hợp, vi khuẩn sẽ có khả năng truyền sự đề kháng này cho vi khuẩn khác của cùng hay khác loài Từ đó sự kháng kháng sinh gia tăng dần lên trong quần thể vi khuẩn (Võ Thị Trà An, 2007)

2.4 Biện pháp hạn chế sự đề kháng thuốc: (1) không sử dụng kháng sinh khi không

có nhiễm trùng; sử dụng với mục đích phòng nhiễm trùng chỉ khi chứng minh được hiệu quả của nó; (2) không sử dụng kháng sinh có phổ rộng, kháng sinh thế hệ mới trong khi kháng sinh có phổ hẹp, kháng sinh cũ vẫn có hiệu quả; (3) thường xuyên nắm bắt thông tin về tình hình dịch tễ và khả năng nhạy cảm kháng sinh của hệ vi khuẩn; (4) sử dụng đúng liều lượng, đường cấp và liệu trình; (5) không tự ý kết hợp kháng sinh khi không cần thiết Nếu kết hợp kháng sinh với mục đích ngăn đề kháng, các kháng sinh thành phần phải sử dụng nguyên liều lượng (Võ Thị Trà An, 2007)

2.5 Biện pháp kiểm soát đề kháng kháng sinh: (1) giảm sử dụng kháng sinh bằng

cách cấm dần việc sử dụng kháng sinh như chất kích thích tăng trọng, thay vào đó là các chế phẩm sinh học hoặc các chất kích thích có nguồn gốc thực vật; thay thế việc phòng bệnh bằng kháng sinh bằng việc phòng bệnh bằng vaccine; tăng cường biện pháp vệ sinh môi trường để hạn chế mầm bệnh (2) Có qui định về việc sử dụng kháng sinh trong bệnh viện, nhà thuốc như phân loại các kháng sinh được kê toa tự do, nhóm dùng cho các mục đích đặc biệt, nhóm dự phòng (3) Cách li bệnh nhân với các nhiễm trùng có tính lây lan hoặc có thể mang vi khuẩn đề kháng (4) Thông tin về lượng kháng sinh sử dụng, số liệu về nhạy cảm kháng sinh, tần suất về đề kháng của vi khuẩn phải được công bố và cập nhật trên các phương tiện thông tin chuyên ngành (5) Giáo dục nhân viên y tế, thú y, người sản xuất và phân phối thuốc, người chăn nuôi, và người tiêu dùng về việc sử dụng kháng sinh có hiệu quả (Võ Thị Trà An, 2007)

Ở Việt Nam, các kháng sinh sau đây đã bị cấm sử dụng theo thông tư số 15/2009/TT-BNN, ngày 17/03/2009: chloramphenicol, furazolidon và một số dẫn xuất nhóm nitrofuran, metronidazole, dimetridazole, ciprofloxacin, enrofloxacin, ofloxacin, tylosin phosphate, carbadox, olaquindox, bacitracin Zn

2.6 Kháng sinh nhóm cephalosporin

Các kháng sinh cephalosporin thuộc nhóm β-lactam Chúng có vòng dihydrothiazin nối với vòng β-lactam Các cephalosporin thường được nhận biết bởi tiếp đầu ngữ (prefix) cepha hoặc cef trong tên hoạt chất (Võ Thị Trà An, 2007)

Năm 1984, các hoạt chất có khả năng chống lại vi khuẩn thương hàn được chiết

xuất lần đầu tiên từ nấm Cephalosporin acremonium do công của một nhà khoa học

người Ý Sau đó, các nhà nghiên cứu thuộc đại học Oxford (Anh) phân lập được cephalosporin C bền dưới tác động của β-lactamase Nhưng mãi đến năm 1964,

cephalothin, kháng sinh cephalosporin đầu tiên phát triển từ cephalosporin C, mới được đưa vào sử dụng trong lâm sàng (Võ Thị Trà An, 2007)

Cấu trúc chung của các cephalosporin gồm có vòng dihydrothiazin nối với vòng β-lactam (hình 2.1) Những cephalosporin bán tổng

hợp sử dụng trong điều trị có những nhóm thế rất

khác nhau trên C3 và chuỗi acylamino ở vị trí 7

Nhóm –COOH có thể ở dạng acid, muối hay este

Phân tử có 2C bất đối C6 (R) và C7 (R) mới có hoạt

tính sinh học Nhóm R1 làm biến đổi đặc tính

kháng khuẩn và tính bền của phân tử Sự thay đổi

trên R2 làm thay đổi đặc tính dược động học của

phân tử (điều này có thể làm gia tăng hoạt tính

kháng khuẩn đặc biệt đối với Staphylococcus và

Pseudomonas) (Huỳnh Thị Ngọc Phương, 2008)

N NH

O O

R1

1

3 4 5 6

7

Cephalosporin

S

2 COOH

R2

Hình 2.1: công thức cấu tạo của

cephalosporin (nguồn: Huỳnh Thị Ngọc Phương, 2008)

Các cephalosporin thường ở dạng bột tinh thể trắng có màu nhẹ, không mùi hoặc có mùi thoảng nhẹ Vài cephalosporin có mùi lưu huỳnh (ví dụ cephalexin, cefradin…) Các chất này thường tan trong nước và tương đối ổn định với sự thay đổi

pH và nhiệt độ Sự hiện diện của 3 cacbon bất đối (6, 7 và trong trường hợp α thay thế

ở vị trí 7), do đó trong dung dịch nước cephalosporin là những chất quay cực phải (Huỳnh Thị Ngọc Phương, 2008)

Dựa vào phổ kháng khuẩn các kháng sinh cephalosporin được phân thành các nhóm (1) cephalosporin thế hệ I gồm cefalotin, cefapirin, cefacetril, cefaloridin, cefazolin, cefalexin, cefaroxil, cefradin, cefaclor, cefatrizin; cấu tạo nhóm này gồm

những phân tử bị thủy giải bởi cephalosporinase sản xuất từ nhiều loài vi khuẩn (2)

Cephalosporin thế hệ II gồm cefamandol, cefuroxim, cefuroxim acetyl (uống được),

cefoxitin; đặc điểm nhóm này là những phân tử thay đổi, có đặc tính kháng lại lactamase và cephalosporinase (3) Cephalosporin thế hệ III với một số chất đại diện

β-như ceftriazon, ceftiofur, cefotaxime, ceftazidime; nhóm này cũng có đặc tính kháng

lại β-lactamase và cephalosporinase (Huỳnh Thị Ngọc Phương, 2008)

Hầu hết cephalosporin dùng đường tiêm chích, chỉ có vài loại dùng đường uống như cephalexin, cephradin, cefaclor, cefadroxil và cefuroxim acetyl Cephalothin và cephapirin gây đau khi tiêm bắp (IM) vì vậy thường chỉ tiêm đường tĩnh mạch (IV) Các loại cephalosporin khác có thể IM hoặc IV (Trần Thị Thu Hằng, 2003)

Cephalosporin thế hệ I được hấp thu tốt qua đường tiêu hóa Một vài kháng sinh trong nhóm này có thể bị giảm hấp thu bởi thức ăn trong dạ dày Đa số các cephalosporin không qua được hàng rào máu não (trừ cefotaxime, ceftriaxone, cefepime), chúng qua được nhau thai và tuyến sữa Cephalosporin chuyển hóa ở gan

và được đào thải chủ yếu qua thận Cefalexin và cefadoxin bài thải qua thận dạng không chuyển hóa Cefoperazon và ceftriaxone đào thải ưu thế qua mật (Võ Thị Trà

An, 2007)

Các cephalosporin ức chế sự tổng hợp tế bào thành vi khuẩn bằng cách can

thiệp vào các enzyme transpeptidase có vai trò trong sự tạo các liên kết của chuỗi

peptidoglycan Các enzyme này liên kết với một nhóm protein gọi là PBP binding protein) nằm ở bên ngoài màng nguyên sinh chất Mức độ mẫn cảm của vi khuẩn đối với một kháng sinh trong nhóm này phụ thuộc vào mức độ gắn kết với PBP,

(penicillin-khả năng xâm nhập vào tế bào (pH môi trường hơi acid gia tăng (penicillin-khả năng này) và (penicillin-khả năng kháng được các enzyme β-lactamase Cephalosporin không chỉ ức chế những kết

nối cuối cùng của peptidoglycan trong tiến trình tổng hợp thành tế bào vi khuẩn mà còn gây tiết lipoteichoic acid tạo phản ứng tự ly giải hay tự sát của vi khuẩn do sự hư hỏng peptidoglycan Cephalosporin có tác động sát khuẩn phụ thuộc thời gian, nghĩa là phải đảm bảo rằng trong thời gian trị liệu nồng độ kháng sinh trong huyết tương hoặc

mô bào đạt trên MIC Tuy nhiên, do cephalosporin chỉ tác động lên vi khuẩn trong giai đoạn tăng trưởng (giai đoạn tổng hợp thành), ở nồng độ quá cao trên mức nồng độ sát khuẩn tốt nhất sẽ gây hiệu ứng Eagle (hiệu ứng ngược), nghĩa là giảm khả năng sát khuẩn Đây là một khái niệm quan trọng để tránh sử dụng quá liều kháng sinh nhóm này (Võ Thị Trà An, 2007)

Do có cấu trúc vòng β-lactam, một số cephalosporin cũng có thể bị vô hoạt bởi nhóm enzyme β-lactamase Ngoài ra kháng sinh nhóm này còn có thể vô hoạt bởi các cephalosporinase, enzyme không tác động đến các penicillin Tất cả các cephalosporin đều không có khả năng tác động đến Enterococci, Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus kháng methicillin và Acinetobacter Hiệp lực chống Pseudomonas aeruginosa có thể đạt được khi phối hợp cefoperazone với clavulanic

acid hoặc aminoglycoside (gentamicin, amikacin) nhưng không nên trộn chung khi cấp (Võ Thị Trà An, 2007)

Các cephalosporin thế hệ I tác dụng trên hầu hết các cầu khuẩn gram (+) trừ tụ cầu kháng methicillin, trên vi khuẩn gram (-) cephalosporin thế hệ I thể hiện hoạt tính không đồng đều Nhóm cephalosporin thế hệ II phổ kháng khuẩn trên cầu khuẩn gram (+) không có lợi bằng cephalosporin thế hệ I, tuy nhiên, trên cầu khuẩn gram (-) cephalosporin II hoạt tính mạnh hơn cephalosporin I Nhóm cephalosporin thế hệ III phổ kháng khuẩn trên cầu khuẩn gram âm kém hơn cephalosporin thế hệ I Tuy nhiên,

nó có hoạt tính cao đối với Streptococcus Trên vi khuẩn gram âm có hoạt tính giống như cephalosporin thế hệ I và mở rộng phổ tác động đến hầu hết Enterbacteria (Citrobacter, Seratia, Providencia), Neisseria, Pseudomonas và Haemophilus, kể cả

dòng tạo β-lactamase (Trần Thị Thu Hằng, 2003)

Vi khuẩn nhạy cảm với cephalexin, cefadroxil có MIC ≤ 8μg/ml; nhạy cảm vừa khi MIC = 16 μg/ml và đề kháng nếu MIC ≥ 32 μg/ml Vi khuẩn nhạy cảm với cefotaxime, ceftiofur, ceftriaxone có MIC ≤ 2 μg/ml; nhạy cảm vừa khi MIC = 4 μg/ml và đề kháng khi MIC ≥ 8 μg/ml (Võ Thị Trà An, 2007)

Một số tác dụng phụ có thể gặp phải khi sử dụng kháng sinh nhóm cephalosporin: (1) dị ứng thuốc từ ban đỏ đến sốc phản vệ; các phản ứng này ít gặp hơn so với penicillin; dị ứng chéo giữa penicillin và cephalosporin khoảng 6 – 18% (2) Các kháng sinh này cũng gây độc trên thận (nhất là khi phối hợp với các kháng sinh nhóm aminoglycoside), gây viêm thận kẽ và hoại tử ống thận (kém hơn so với aminoglycoside hoặc polymyxin) (3) Ói mửa, tiêu chảy, viêm lưỡi… (Trần Thị Thu Hằng, 2003)

Vi khuẩn đề kháng với cephalosporin chủ yếu do (1) Giảm thấm thuốc qua màng tế bào vi khuẩn (2) Không có PBP (penicillin binding protein) là receptor chuyên biệt của thuốc (3) Tạo β-lactamase để phân hủy thuốc (4) Không hoạt hóa các

enzyme tự phân giải ở thành tế bào (Trần Thị Thu Hằng, 2003)

Một số kháng sinh nhóm cephalosporin có mặt trên thị trường như: cefquinome (Cobactan, Intervet), ceftiofur (Citius, Virbac; Bio-Cef-5, Biopharmachemie), cefoperazone (Startmast, Intervet); amoxicillin + clavulanic acid (Clavamox, Synulox, Pfizer)

2.7 Đề kháng với nhóm β-Lactam

Đề kháng với các kháng sinh nhóm β-lactam chủ yếu do (1) Sự hiện diện của enzyme β-lactamase làm hư hỏng vòng β-lactam (2) Sự hiện diện của các enzyme thay thế PBP (penicillin binding protein) của vi khuẩn mà penicillin không gắn kết được

Các β-lactamase có thể được phân loại dựa vào khả năng thủy phân các cơ chất

thuộc kháng sinh β-lactam và mức độ bị ức chế bởi clavulanic acid, nhưng các đột biến đơn giản có thể làm thay đổi sự phân loại này Ví dụ β-lactamase TEM-1 là một penicillinase đơn giản và hoạt động của chúng có thể bị ức chế bởi clavulanic acid và

tazobactam TEM-1 phân bố rộng rãi trong các chủng vi khuẩn của

Enterobacteriaceae Tuy nhiên, do đột biến điểm, các enzyme thuộc nhóm TEM (ví

dụ, TEM-52) có phổ hoạt động rộng hơn dẫn đến sự đề kháng với cephalosporin thế hệ III Sự bất hoạt của aztreonam, ceftazidime, cefotaxime hoặc ceftriaxone được xem là chỉ thị cho sự hiện diện các enzyme β-lactamase có phổ rộng (extended-spectrum beta-lactamase, ESBL) Nhóm enzyme thứ 2 là carbapenemase, có khả năng vô hoạt

carbapenem, imipenem và meropenem Nhưng rất may sự đề kháng này còn rất hiếm

Các enzyme thay thế PBP liên quan đến sự đề kháng với methicillin ở

Staphylococci, Streptococcus pneumoniae Cả methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) và methicillin-resistant Staphylococcus epidermidis (MRSE) đều là

những tác nhân gây nhiễm trùng bệnh viện Điều trị các nhiễm trùng này rất khó vì cả MRSA và MRSE thường đa đề kháng và chỉ nhạy cảm với một số ít kháng sinh (Võ Thị Trà An, 2007)

2.8 Enzyme β-lactamase và các chất ức chế β-lactamase

2.8.1 Enzyme β-lactamase

Nhiều loài vi khuẩn có khả năng tiết ra các enzyme phân hủy các kháng sinh họ β-lactam Đó là một trong những cơ chế chính tạo nên sự đề kháng của vi khuẩn đối với kháng sinh β-lactam Các enzyme này được gọi là những enzyme β-lactamase

Sự sản sinh các enzyme này của vi khuẩn được qui định bởi 1 gen hoặc nằm trong bộ nhiễm sắc thể của vi khuẩn hoặc nằm trong plasmid Sự sản sinh này có thể là

tự nhiên hoặc là tiếp nhận được (do đột biến nhiễm sắc thể, do nhận gen từ plasmid hoặc do sự kích hoạt bởi các chất có tính kích hoạt như clavulanic acid

Người ta chia các enzyme β-lactamase thành các enzyme cephalosporinase và các enzyme penicillinase Sự sản sinh các enzyme cephalosporinase ở các loài vi

khuẩn được quy định bởi gen nằm trong bộ nhiễm sắc thể, sự tiết enzyme này có thể

do (1) Tự nhiên: ở mức độ thấp (Enterobacter, Citrobacter, Serratia, Providencia, Proteus vulgaris, P aeruginosa, Actinetobacter) hoặc ở mức độ cao (Bacteroides) (2)

Tiếp nhận được do đột biến nhiễm sắc thể (tiết enzyme ở mức cao): các họ vi khuẩn

đường ruột, Acinetobacter, P aeruginosa (3) Tiếp nhận được do sự kích hoạt (tiết

enzyme ở mức cao và có tính chất tạm thời, tức là sẽ mất đi khi không còn tiếp xúc với

kháng sinh có tính kích hoạt): các vi khuẩn đường ruột (trừ E coli và Shigella), Acinetobacter, Pseudomonas Sự tiết enzyme cephalosporinase ở mức thấp sẽ gây ra

sự phân hủy các penicillin phân nhóm G và phân nhóm A, các cephalosporin thế hệ I

và II Sự tiết enzyme cephalosporinase ở mức cao sẽ gây ra sự phân hủy các penicillin

phân nhóm G và A, các cephalosporin thế hệ I và II, bất hoạt các cephalosporin thế hệ III

Trong khi đó, sự sản sinh các enzyme penicillinase được quy định bởi gene

nằm trong bộ nhiễm sắc thể (vi khuẩn tiết ra enzyme ở mức độ thấp như trường hợp

Klebsiella hoặc ở mức độ cao) hoặc nằm trong plasmid (tiết enzyme ở mức độ cao)

Sự tiết enzyme penicillinase ở mức thấp sẽ gây ra sự phân hủy các penicillin phân nhóm G, phân nhóm A và carbenicillin Sự tiết enzyme penicillinase ở mức cao sẽ gây

phân hủy các penicillin phân nhóm G và A, carbenicillin, các cephalosporin thế hệ I và

II (trừ cefoxitin)

Hiện nay ngoài các enzyme penicillinase và cephalosporinase, người ta còn

phát hiện một số vi khuẩn tiết ra các enzyme β-lactamase phổ rộng spectrum beta-lactamase, ESBL) có khả năng phân hủy phần lớn các kháng sinh nhóm

(extended-penicillin và cephalosporin (Nguyễn Thị Thanh và Hồ Huỳnh Quang Trí, 2000)

2.8.2 Các chất ức chế β-lactamase

Là chất có cấu trúc tương tự β-lactam, hoạt tính kháng khuẩn rất yếu nhưng lại gắn với β-lactamase làm mất hoạt tính của enzyme này nên bảo vệ các thuốc loại β-lactam không bị phân hủy (Trần Thị Thu Hằng, 2003)

Do có cấu tạo tương tự như các kháng sinh nhóm penicillin, các thuốc này sẽ

gắn với enzyme penicillinase do vi khuẩn tiết ra tạo điều kiện cho kháng sinh nhóm

penicillin “rảnh tay” để tác dụng lên các cầu nối penicillin của vi khuẩn Sau khi gắn

với enzyme penicillinase các thuốc này sẽ bị phân hủy, vì vậy người ta còn gọi các

thuốc này là những “thuốc ức chế tự sát” (inhibiteurs suicides) (Nguyễn Thị Thanh và

Hồ Huỳnh Quang Trí, 2000)

Các chất ức chế β-lactamase đang được sử dụng trong lâm sàng gồm có: clavulanic acid (Lấy từ Streptomyces clauvuligerus Clavulanic acid ức chế β- lactamase của nhiều vi khuẩn gram dương và gram âm), sulbactam, tazobactam (Trần

Thị Thu Hằng, 2003)

2.9 Các phương pháp khảo sát sự nhạy cảm của vi khuẩn đối với kháng sinh

2.9.1 Phương pháp định tính

Có một vài phương pháp phòng thí nghiệm đo lường sự mẫn cảm của vi khuẩn đối với thuốc kháng sinh, tuy nhiên phương pháp khuếch tán trên thạch được sử dụng nhiều nhất Phương pháp được đề nghị bởi National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS, 1990, MA-A4) là phương pháp khuếch tán trên thạch Kirby-Bauer (Quinn và các cộng sự, 1998)

2.9.1.1 Các yếu tố có thể ảnh hưởng đến kết quả phản ứng

Phương pháp khuếch tán trên thạch yêu cầu dàn đều vi khuẩn kiểm tra trên bề mặt đĩa thạch và đặt những đĩa giấy kháng sinh với nồng độ qui định, lên bề mặt thạch trước khi ủ bệnh Nếu vi khuẩn nhạy cảm với kháng sinh thì một vòng vô khuẩn sẽ xuất hiện xung quanh đĩa giấy sau khi ủ ấm Một trong những lý do cho việc tiêu chuẩn hóa chặt chẽ các bước tiến hành phản ứng là do có rất nhiều yếu tố có thể ảnh hưởng đến độ lớn của vòng vô khuẩn và chúng bao gồm:

(1) Độ đục của huyễn dịch vi khuẩn: đây là yếu tố rất quan trọng và độ đục của huyễn dịch vi khuẩn cần kiểm tra phải tương đương với độ đục Mac Farland 0,5 Mục đích là để có được những vệt dày đặc vi khuẩn phát triển liên quan đến những những khuẩn lạc riêng lẻ tương ứng Bên cạnh đó, mức độ mẫn cảm của một vi khuẩn đối với một kháng sinh có sự khác nhau trong từng loài và từng chủng phân lập từ nguồn bệnh

(2) Môi trường phản ứng: Mueller-Hinton hoặc các môi trường tương tự (Isosensitest agar, Oxoid) thường được chọn cho những phản ứng nhạy cảm thông thường Môi trường này có chứa một ít chất ức chế sulfonamide, trimethoprim và tetracycline, và hầu hết mầm bệnh phát triển tốt trên nó Hàm lượng quá mức thymidine hoặc thymine trong môi trường phản ứng có thể ức chế sulfonamide và trimethoprim, vùng vô khuẩn nhỏ hoặc không có Sự thay đổi các cation hóa trị hai, chủ yếu là magie và canxi, sẽ ảnh hưởng đến độ lớn vòng vô khuẩn của tetracycline,

polymycin và aminoglycoside trong phản ứng chống Pseudomanas aeruginosa Đối với một số vi khuẩn, như Streptococcus, có thể sẽ mọc yếu trên môi trường Mueller-

Hinton, thay vào đó môi trường thạch máu chứa 5 - 10% máu cừu có thể sử dụng Nhưng độ lớn vòng vô khuẩn của nafcilin, novobiocin và methicillin sẽ nhỏ hơn 2 - 3

mm so với giới hạn thông thường Độ dày của thạch và pH của môi trường cũng nên được tiêu chuẩn hóa vì nó cũng có thể ảnh hưởng đến độ lớn của vòng vô khuẩn

(3) Chất kháng sinh và nồng độ của nó trên đĩa giấy: khả năng khuyếch tán của kháng sinh trên bề mặt thạch có sự khác nhau và vùng vô khuẩn của một số chất, như streptomycin, thì luôn tương đối nhỏ Nồng độ của chất kháng sinh trên đĩa giấy được chọn dựa vào sự tương quan giữa độ lớn vùng vô khuẩn với nồng độ đạt được trong máu khi điều trị Hiệu lực của chất kháng sinh trên đĩa giấy nên có phương pháp kiểm soát và duy trì

(4) Điều kiện ủ: Tiêu chuẩn chung cho các phản ứng thử độ mẫn cảm thông thường là ủ trong điều kiện đủ oxy ở 350C trong 16 - 18 giờ hoặc 24 giờ Đĩa thạch không nên ủ trong điều kiện gia tăng CO2 vì điều đó sẽ làm thay đổi có ý nghĩa vòng

vô khuẩn của một số kháng sinh Vi khuẩn kị khí không nên kiểm tra bằng phương pháp khuếch tán trên thạch và NCCLS (1990) đã công bố phương pháp chuẩn để kiểm tra sự nhạy cảm của vi khuẩn kị khí (M11-T2) (Quinn và các cộng sự, 1998)

2.9.1.2 Chọn lựa đĩa kháng sinh

Việc chọn lựa loại kháng sinh sử dụng trong phản ứng khuyếch tán trên thạch dựa vào phổ kháng khuẩn rộng, thuốc có thông dụng và được sử dụng rộng rãi trong thú y Tuy nhiên, một gợi ý cho việc chọn lựa kháng sinh trong những phản ứng xác định độ mẫn cảm thông thường như sau:

Đĩa kháng sinh tetracycline được sử dụng để dự đoán kết quả cho tất cả kháng sinh khác thuộc họ tetracycline

Sulfisoxazole là một đại diện tiêu biểu cho tất cả kháng sinh họ sulfonamide Erythromycin được sử dụng để dự đoán kết quả cho tất cả kháng sinh khác thuộc họ macrolide

Đĩa kháng sinh lindamycin được sử dụng để dự đoán kết quả cho tất cả kháng sinh khác thuộc họ lincomycin

Aminoglycoside và quinolone nên kiểm tra riêng biệt Việc tách ra hay phối hợp thì không đủ chứng tỏ đến việc đề kháng chéo

Chloramphenicol, vancomycin, trimethoprim/sulfamethoxazole, nitrofurantoin bắt buộc kiểm tra riêng lẻ

Penicillin:

- Staphylococcus nên kiểm tra với penicillin G và oxacillin (cho chủng đề

kháng với methicillin, cephalosporin và các β-lactam khác)

- Enterroccus faecalis kiểm tra với penicillin G có thể dự đoán kết quả với

ampicillin, chất tương tự ampicillin, amoxicillin

- Streptococcus có thể kiểm tra với penicillin G hoặc ampicillin Kiểm tra

với cả hai chất là không cần thiết

Cephalosporin:

- Staphylococcus thì thường nhạy cảm với cephalosporin trừ các chủng đề

kháng methicillin; nên báo cáo về sự đề kháng ngay nếu phát hiện

- Đĩa kháng sinh cephalothin có thể chỉ ra kết quả cho cefaclor, cephapirin, cefazolin, cephradine, cephalexin và cefadroxil Cefatoxime là tiêu biểu cho ceftazidime, ceftizoxime và ceftriaxone (Quinn và các cộng sự, 1998)

2.9.1.3 Qui trình kiểm tra chất lượng

Chủng vi khuẩn chuẩn

Kho dự trữ lạnh các chủng vi khuẩn chuẩn của American Type Culture Collection (ATCC) nên được duy trì Các chủng chuẩn này có phản ứng với các đĩa kháng sinh với vùng vô khuẩn trong phạm vi giới hạn chuẩn Các chủng vi khuẩn chuẩn có:

- Escherichia coli (E coli) ATCC 25922

- Staphylococcus aureus ATCC 25923

- Prseudomonas aeruginosa ATCC 27853

- E coli ATCC 35128 sản sinh enzyme β-lactamase

- Enterrococus faecalis ATCC 29212 và 33186 có thể kiểm tra được môi

truờng phản ứng có cân bằng thymidine và thymine

Các chủng chuẩn này được dự trữ trong môi trường soybean casein digest hoặc một môi trường tương tự (thạch tryptone soya, Oxoid) ở 40C và cấy truyền hàng tuần Các chủng này được thay thế ít nhất hàng tháng từ những kho đông lạnh dưới -200C, hoặc trong nitơ lỏng Khi thực hiện phản ứng, các chủng này sẽ được cấy sang một đĩa thạch để lấy những khuẩn lạc rời (Quinn và các cộng sự, 1998)

Đĩa kháng sinh

Kháng sinh được thấm vào những đĩa giấy bảo đảm hiệu lực được duy trì Chúng được giữ ở điều kiện khô thoáng thích hợp và được dự trữ ở -40C Các đĩa kháng sinh nên được để cân bằng với nhiệt độ phòng trước khi sử dụng Các đĩa chứa kháng sinh thuộc nhóm β-lactam có thể được dự trữ ở 40C trong vòng một tuần Nên đặt ở -140C hay thấp hơn để bảo quản lâu dài Nhiệt độ thấp hơn này thì cũng được dùng để bảo quản các đĩa chứa kháng sinh khác Những đĩa hết hạn sử dụng phải được loại bỏ

Kiểm tra chất lượng những đĩa chứa phức hợp β-lactam và chất ức chế enzyme

β-lactamase được xem xét sử dụng cả hai dòng E coli chuẩn Một trong hai dòng đó là ATCC 35218 là dòng sản xuất enzyme β-lactamase

Chất lượng của những đợt đĩa kháng sinh mới phải được kiểm tra bằng những dòng vi khuẩn chuẩn và vùng vô khuẩn phải được so sánh với bảng giới hạn chuẩn (Quinn và các cộng sự, 1998)

Môi trường phản ứng

Độ dày của đĩa thạch Muller-Hinton xấp xỉ 4 mm Tương đương với 60 - 70 ml môi trường trong đĩa petri 140 mm, hoặc 25 – 30 ml môi trường trong đĩa petri 90 mm

pH của môi trường cần được kiểm tra và phải nằm trong khoảng 7,2 - 7,4

Mỗi đợt môi trường sau khi đổ nên được kiểm tra có bị nhiễm khuẩn bằng cách đặt ở 30 tới 350C trong vòng 24 giờ hoặc lâu hơn Những đĩa bị nhiễm khuẩn thì loại

bỏ Môi trường được bảo quản ở 40C và nên sử dụng trong vòng 7 ngày sau khi pha chế

Kiểm tra môi trường phản ứng không có thymidine và thymine bằng chủng vi

khuẩn chuẩn Enterroccus faecalis (ATCC 29212 hoặc 33186) với đĩa kháng sinh

trimethoprim/sulfamethoxazole Môi trường tốt sẽ cho vòng vô khuẩn rõ ràng và khoảng 20 mm hoặc hơn Môi trường không tốt sẽ cho vòng vô khuẩn không rõ ràng hoặc rất mờ (Quinn và các cộng sự, 1998)

2.9.2 Phương pháp định lượng

Có thể xác định tính nhạy cảm với kháng sinh bằng cách dựa vào nồng độ ức chế tối thiểu MIC (minimal inhibitory concentration) để biết vi khuẩn đó có nhạy cảm hay đề kháng với kháng sinh Nồng độ ức chế tối thiểu là nồng độ thấp nhất của kháng sinh ức chế sự phát triển của vi khuẩn có thể nhìn thấy được sau 18 - 24 giờ được nuôi cấy Đối chiếu MIC với nồng độ huyết tương của kháng sinh, có thể gặp 3 trường hợp

- Nếu MIC < nồng độ huyết tương của kháng sinh: vi khuẩn nhạy cảm với kháng sinh Trong thực tế, một vi sinh vật được gọi là nhạy cảm với kháng sinh khi MIC ≤ ¼ nồng độ huyết an toàn của kháng sinh đó

- Nếu MIC > nồng độ huyết an toàn: vi khuẩn đề kháng với kháng sinh

- Nếu MIC ở khoảng giữa hai trường hợp trên: vi khuẩn nhạy cảm trung gian với kháng sinh Nghĩa là vi khuẩn không bị tiêu diệt nếu dùng liều điều trị thông thường, nhưng nếu dùng liều cao bằng đường toàn thân hoặc bất cứ đường nào miễn là kháng sinh tập trung vào ổ nhiễm khuẩn (chẳng hạn đào thải qua nước tiểu thì trị được nhiễm khuẩn đường tiểu) thì kháng sinh có tác dụng trên vi khuẩn

Nồng độ diệt khuẩn tối thiểu MBC (minimal bacteriocidal concentration) là nồng độ thấp nhất làm giảm 99,9% số lượng vi khuẩn Sự xác định MBC chỉ được thực hiện khi biết rất chính xác một kháng sinh có thể diệt được một vi khuẩn chuyên biệt đã được cô lập như trị viêm màng trong tim do vi khuẩn Thường MBC = 2 - 8 lần MIC Đối với các kháng sinh có MBC gần với MIC và dễ dàng đạt nồng độ bằng MBC trong huyết tương, đó là các kháng sinh diệt khuẩn như penicillin, cephalosporin, aminoglycoside, polymycin Trái lại, các kháng sinh có MBC < MIC và khó đạt được nồng độ bằng MBC trong huyết tương, đó là các kháng sinh kiềm khuẩn như tetracycline, chloramphenicol, macrolide (Trần Thị Thu Hằng, 2003)

2.10 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước

2.10.1 Trong nước

(1) Trần Sỹ Trung (2000) cho rằng các chủng Escherichia coli phân lập từ phân

heo con theo mẹ tại trại heo Đồng Hiệp chỉ còn nhạy cảm với norfloxacin và nitrofurantoin, nhạy cảm với mức trung gian với gentamicin và đã đề kháng mạnh với colistin, neomycin, chloramphenicol và bactrim