Tình hình kháng kháng sinh của vi khuẩn escherichia coli phân lập từ trứng gà tại một số trang trại trên địa bàn hà nội và vùng phụ cận luận văn thạc sĩ nông nghiệp

HỌC VIỆN NƠNG NGHIỆP VIỆT NAM NGUYỄN HỒNG THÁI TÌNH HÌNH KHÁNG KHÁNG SINH CỦA VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI PHÂN LẬP TỪ TRỨNG GÀ TẠI MỘT SỐ TRANG TRẠI TRÊN ĐỊA BÀN HÀ NỘI VÀ VÙNG PHỤ CẬN Chuyên ngành: Thú Y Mã số: 8640101 Người hướng dẫn khoa học: TS Chu Thị Thanh Hương NHÀ XUẤT BẢN HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP - 2019 LỜI CAM ĐOAN Dữ liệu luận văn phần đề tài “Nghiên cứu tính kháng kháng sinh vi khuẩn E.coli phân lập từ trứng phát tán chủng vi khuẩn kháng thuốc trang trại”, mã số 02/DAVB, tài trợ Dự án Việt- Bỉ thuộc chương trình hợp tác nghiên cứu khoa học Học viện Nông nghiệp Việt Nam Trường Đại học Vương quốc Bỉ, giai đoạn 2014-2019 Tôi xin cam đoan số liệu, kết nghiên cứu luận văn trung thực, xác chưa sử dụng để bảo vệ học vị Tôi xin cam đoan thơng tin trích dẫn luận văn rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày tháng năm 2019 Tác giả luận văn Nguyễn Hồng Thái i LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu hồn thành luận văn, tơi nhận hướng dẫn, bảo tận tình thầy giáo Cùng giúp đỡ, động viên bạn bè, đồng nghiệp gia đình Nhân dịp hồn thành luận văn, cho phép cảm ơn Ban Giám Đốc Học viện Nông nghiệp Việt Nam, Bộ môn Vi Sinh Vật – Truyền nhiễm, Khoa Thú y – Học viện Nông nghiệp Việt Nam, tạo điều kiện cho học tập, thực đề tài hoàn thành luận văn Đặc biệt, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới TS Chu Thị Thanh Hương khoa Thú y tận tình hướng dẫn, tạo điều kiện cho tơi suốt q trình thực đề tài hồn thành luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn hộ trang trại chăn nuôi gia cầm địa bàn Hà Nội vùng phụ cận tận tình giúp đỡ, tạo điều kiện cho tơi hồn thành đề tài nghiên cứu Cuối cùng, xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè, đồng nghiệp ln động viên khuyến khích tơi hồn thành luận văn Hà Nội, ngày tháng năm 2019 Tác giả luận văn Nguyễn Hồng Thái ii MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục bảng v Danh mục hình vi Danh mục chữ viết tắt vii Trích yếu luận văn viii Thesis abstract x Phần Mở đầu 1.1 Tính cấp thiết đề tài 1.2 Mục tiêu nghiên cứu đề tài 1.3 Địa điểm thực đề tài Phần Tổng quan tài liệu 2.1 Một số hiểu biết vi khuẩn escherichia coli 2.1.1 Khái quát vi khuẩn E.coli 2.1.2 Đặc tính sinh học 2.1.3 Đặc điểm nuôi cấy 2.1.4 Đặc tính sinh hóa 2.1.5 Đặc tính gây bệnh sức đề kháng 2.2 Tính kháng kháng sinh vi khuẩn E coli 2.2.1 Thuốc kháng sinh 2.2.2 Phân loại kháng sinh 2.2.3 Cơ chế tác dụng kháng sinh 2.2.4 Hiện tượng kháng kháng sinh vi khuẩn 2.2.5 Cơ chế kháng kháng sinh vi khuẩn 12 2.2.6 Cơ chế kháng kháng sinh vi khuẩn E coli số nghiên cứu 14 2.3 Tình hình nghiên cứu kháng kháng sinh vi khuẩn E coli 15 2.3.1 Tình hình nghiên cứu giới 15 2.3.2 Tình hình nghiên cứu Việt Nam 16 2.3.3 Tình hình kháng kháng sinh vi khuẩn E coli gà 19 iii Phần Nội dung, nguyên liệu phương pháp nghiên cứu 21 3.1 Nội dung nghiên cứu 21 3.2 Đối tượng nghiên cứu 21 3.3 Nguyên liệu nghiên cứu 21 3.3.1 Mẫu 21 3.3.2 Các môi trường chuyên dụng dùng để phân lập, giám định vi khuẩn 21 3.3.3 Các kháng sinh sử dụng đề tài 21 3.3.4 Dụng cụ thí nghiệm 21 3.4 Phương pháp nghiên cứu 22 3.4.1 Điều tra tình hình sử dụng thuốc kháng sinh chăn ni gà đẻ 22 3.4.2 Phương pháp thu thập trứng 22 3.4.3 Phương pháp xử lý mẫu 22 3.4.4 Phương pháp bảo quản mẫu 22 3.4.5 Phương pháp phân lập giám định vi khuẩn E coli 22 3.4.6 Thử tính kháng kháng sinh vi khuẩn E coli phân lập 23 3.5 Phương pháp xử lý số liệu 26 Phần Kết nghiên cứu thảo luận 27 4.1 Kết điều tra tình hình sử dụng kháng sinh 27 4.2 Kết phân lập giám định vi khuẩn E coli 28 4.2.1 Kết phân lập vi khuẩn E Coli 28 4.2.2 Kết giám định vi khuẩn E.coli 32 4.3 Kiểm tra tính kháng kháng sinh xác định gen kháng kháng sinh vi khuẩn 33 4.3.1 Đặc điểm kháng kháng sinh vi khuẩn E coli phân lập 33 4.3.2 Xác định gen kháng kháng sinh chủng vi khuẩn phân lập 40 Phần Kết luận kiến nghị 43 5.1 Kết luận 43 5.1.1 Về tình hình sử dụng kháng sinh trang trại 43 5.1.2 Về kết phân lập giám định vi khuẩn E coli 43 5.1.3 Về đặc điểm kháng kháng sinh vi khuẩn E coli 43 5.2 Kiến nghị 43 Phụ lục 48 iv DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Kết xét nghiệm vi khuẩn E coli kháng nhiều loại kháng sinh 18 Bảng 3.1 Bảng đánh giá khả mẫn cảm / kháng E coli 24 Bảng 3.2 Trình tự gen tham chiếu mcr-1 26 Bảng 4.1 Kết phân lập E coli từ trứng swab ổ nhớp 30 Bảng 4.2 Kết phân lập E coli vỏ trứng theo địa phương lấy mẫu 31 Bảng 4.3 Chỉ tiêu sinh hóa Vi khuẩn E.coli 32 Bảng 4.4 Kết kiểm tra tính đa kháng kháng sinh 39 Bảng 4.5 Kết xác định gen kháng kháng sinh 40 v DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 E coli niêm mạc ruột Hình 2.2 E coli kính hiển vi điện tử Hình 2.3 Cơ chế tác dụng kháng sinh Hình 2.4 Cơ chế kháng kháng sinh vi khuẩn 14 Hình 3.1 Tóm tắt bước phân lập bảo quản giống 23 Hình 3.2 Sơ đồ bố trí khoanh giấy kháng sinh 25 Hình 4.1 Kết điều tra tình hình sử dụng kháng sinh 27 Hình 4.2 Hình ảnh đặc trưng vi khuẩn E coli môi trường (1) MacConKey (2) TBX 29 Hình 4.3 Kết phân lập E coli thạch TBX 29 Hình 4.4 Tỷ lệ phân lập E coli vỏ trứng theo tình trạng dùng kháng sinh 32 Hình 4.6 Tính mẫn cảm kháng sinh E coli phân lập từ vỏ trứng 34 Hình 4.7 Tính mẫn cảm với Ciprofloxacin, Amoxicillin Colistin 35 Hình 4.8 Kết thử tính mẫn cảm với Gentamycin, Trimethoprim/sulfamethoxazole, Tetracycline Nitrofurantoin 36 Hình 4.9 So sánh tính mẫn cảm E coli phân lập từ vỏ trứng nhóm khơng sử dụng có sử dụng kháng sinh 37 Hình 4.10 So sánh trình tự amino acid protein mã hóa gen mcr-1 41 Hình 4.11 Cây phát sinh chủng loại dựa vào trình tự amino acid protein mã hóa gen mcr-1 42 vi DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Nghĩa tiếng Việt cs Cộng DNA Deoxyribonucleic acid E coli Escherichia coli Gr+ Gram (+) Gr- Gram (-) H High I Intermediate MIC Minimum inhibitory concentration PABA Para Aminobenzonic acid R Resistant S Susceptible RNA Ribonucleic acid TCCS Tiêu chuẩn sở ∑ Tổng số vii TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Nguyễn Hồng Thái Tên luận văn: Tình hình kháng kháng sinh vi khuẩn Escherichia coli phân lập từ trứng gà số trang trại địa bàn Hà Nội vùng phụ cận” Chuyên ngành: Thú y Mã số: 8640101 Cơ sở đào tạo: Học viện nông nghiệp Việt Nam Mục đích nghiên cứu - Đánh giá mức kháng kháng sinh vi khuẩn E coli phân lập từ trứng thu thập từ trang trại địa bàn Hà nội vùng phụ cận Phương pháp nghiên cứu - Khảo sát trạng sử dụng thuốc kháng sinh chăn nuôi gà đẻ - Phương pháp thu thập trứng - Phương pháp phân lập giám định vi khuẩn E coli - Thử tính kháng kháng sinh vi khuẩn E coli phân lập - Phương pháp xử lý số liệu phần mềm Microsoft Excel Kết nghiên cứu Kết điều tra tình hình sử dụng kháng sinh Trong tổng số 14 loại kháng sinh điều tra có loại sử dụng q trình chăn ni gà, số loại thấy dùng phổ biến nhất, ví dụ như: Amoxicillin (62,1%), Doxycyclin (58,6%), Trimethoprim/sulfamethoxazole (51,7%) Người chăn nuôi dùng kháng sinh chủ yếu dựa vào kinh nghiệm chăn nuôi làm theo hướng dẫn nhà sản xuất Về mục đích sử dụng kháng sinh, phần lớn kháng sinh dùng để phòng bệnh Kết phân lập giám định vi khuẩn E.coli Nghiên cứu thu thập mẫu 29 đàn gà nuôi Hà Nội, Hưng Yên Hịa Bình Có 10 đàn gà khơng sử dụng kháng sinh 19 đàn gà dùng kháng sinh trình ni Kết xác định tỷ lệ nhiễm E coli kể cho biết vỏ trứng nguồn lây nhiễm vi khuẩn E coli từ trang trại tới bàn ăn Mặt khác, tỷ lệ nhiễm E coli lòng trứng thấp (1,6%) nên nghiên cứu tập trung phân lập E coli vỏ trứng dùng cho nghiên cứu khả kháng kháng sinh Các phần tổng hợp kết phân lập E coli vỏ trứng theo địa phương theo tình trạng sử dụng viii kháng sinh q trình ni 3.Tính kháng kháng sinh vi khuẩn E.coli phân lập 3.1.Đặc điểm kháng kháng sinh vi khuẩn E.coli phân lập Nghiên cứu đặc điểm kháng kháng sinh E coli, có khoảng 16 loại kháng sinh thường dùng nhiên có loại kháng sinh thử, bao gồm: Tetracyclin, Trimethoprim/Sufamethoxazole, Vancomycin, Ciprofloxacin, Erythromycin, Gentamicin, Nitrofurantoin, Colistin Amoxicillin-clavulanic acid Các chủng E coli hình thành vịng vơ khuẩn với đường kính vịng vơ khuẩn khác Đối với loại kháng sinh vi khuẩn Gram âm khơng mẫn cảm Vancomycin Erythromycin, 100% số chủng E coli thử khơng hình thành hình thành vịng vơ khuẩn với đường kính nhỏ (< cm) 3.2.Đặc điểm di truyền E.coli đa kháng kháng sinh Nghiên cứu làm rõ đặc điểm kiểu hình kháng kháng sinh E coli phân lập từ trứng Do tính trạng kháng kháng sinh gen quy định, nên nghiên cứu tiếp tục tìm hiểu đặc điểm gen E coli đa kháng kháng sinh Hiện có hai hướng tiếp cận nghiên cứu gen kháng kháng sinh E coli, là: (1) dùng mồi đặc hiệu phát gen kháng kháng sinh (Nguyen et al., 2016; Trương Quý Dương cs., 2017), (2) giải trình tự phân tích trình tự genome vi khuẩn để xác định gen mã hóa yếu tố độc lực gen kháng kháng sinh (Rumore et al., 2018) Trong phạm vi nghiên cứu này, chọn cách tiếp cận giải trình tự genome E coli để làm rõ tất gen độc lực gen kháng kháng sinh E coli, chọn 01 chủng E coli đại diện (VB104) để giải trình tự genome hệ thống Illumina HiSeq 2000 (Cơng ty BGI, Hồng Kơng) ix Hình 4.8 Kết thử tính mẫn cảm với Gentamycin, Trimethoprim/sulfamethoxazole, Tetracycline Nitrofurantoin Ghi chú: kết tổng hợp 68 chủng E coli, chia thành nhóm khơng sử dụng kháng sinh nhóm có sử dụng kháng sinh Trục Oy biểu thị tỷ lệ % số chủng thử kháng sinh đồ đường kính (cm) vịng vơ khuẩn tương ứng (trục Ox) Với loại kháng sinh, vùng màu xám đánh dấu vùng kháng kháng sinh Tỷ lệ % vùng màu xám biểu thị mức phổ biến tượng kháng thuốc kháng sinh Hình 4.7 hình 4.8 giúp đưa nhận xét sau: ln có tỷ lệ kháng loại kháng sinh chủng vi khuẩn E coli phân lập từ mẫu trứng đàn gà sử dụng khơng sử dụng kháng sinh q trình nuôi Tỷ lệ kháng khác loại kháng sinh Vi khuẩn E coli phân lập từ vỏ trứng kháng nhiều (95,6% - 92,6% - 88,2%) loại kháng sinh Tetracycline, Trimethoprim/Sufamethoxazole Colistin Ngược lại, có từ 14,7% đến 20,6% số chủng E coli phân lập kháng với Amoxicillin-clavulanic 36 acid Nitrofurantoin Tại nghiên cứu tình hình kháng kháng sinh E coli phân lập từ gia cầm, tác giả xác nhận E coli có tỷ lệ kháng cao Tetracycline (78,3%), Trimethoprim (58,7%) (Trương Hà Thái cs., 2017); Ciprofloxacin (73,3%), Gentamicin (42,2%) (Nguyen et al., 2016) Về khía cạnh này, kết thu nghiên cứu thời phù hợp kết luận mức kháng phổ biến Tetracycline, Trimethoprim Ciprofloxacin 4.3.1.2 Đặc điểm mẫn cảm theo tình hình sử dụng kháng sinh Kết thử tính mẫn cảm với kháng sinh tiếp tục phân tích để làm rõ khác biệt tính mẫn cảm kháng với loại kháng sinh vi khuẩn phân lập từ nhóm gà (khơng sử dụng, có sử dụng kháng sinh), hình 4.9 Hình 4.9 So sánh tính mẫn cảm E coli phân lập từ vỏ trứng nhóm khơng sử dụng có sử dụng kháng sinh Mặc dù E coli phân lập từ đàn gà có sử dụng kháng sinh khơng sử dụng kháng sinh kháng với loại thuốc kháng sinh định, số chủng kháng thuốc thấp nhóm khơng sử dụng kháng sinh Một số kháng sinh Colistin, Tetracycline E coli phân lập từ đàn gà có dùng kháng sinh kháng 100% có tỷ lệ nhỏ số chủng phân lập từ đàn gà khơng sử dụng kháng sinh cịn mẫn cảm (8,3% Tetracycline 22,2% 37 Colistin) Kết cho thấy việc sử dụng kháng sinh vật ni có ảnh hưởng đến tính mẫn cảm kháng vi khuẩn E coli Kết nghiên cứu tương đồng với kết luận công bố năm 2015 (Nguyen et al., 2015) tìm thấy mối liên hệ tỷ lệ kháng kháng sinh E coli phân lập trang trại gà vùng đồng sông Mekong với việc sử dụng kháng sinh Về tình hình sử dụng kháng sinh chăn nuôi Việt Nam, nhiều kết điều tra cho biết kháng sinh sử dụng không với mục đích điều trị mà cịn dùng với để dự phòng bệnh (45,2%) (Pham et al., 2012) Bên cạnh đó, số loại hóa dược (Monensin, Salinomycin, Maduramycin) cịn bổ sung với mục đích kích thích sinh trưởng (Pham et al., 2012) Tình sử dụng kháng sinh phức tạp với lưu hành hàng chục loại kháng sinh, phổ biến Norfloxacin, Tylosin, Gentamicin, Doxycycline, Tiamulin, Colistin Enrofloxacin Thêm lý đáng quan ngại người chăn nuôi không tuân thủ thời gian ngưng sử dụng thuốc trước xuất bán (Duong and Nguyen, 2015) Chính ngun nhân nêu trên, việc kiểm sốt kháng kháng sinh ngày khó khăn, làm gia tăng kháng kháng sinh vi khuẩn, có vi khuẩn E coli phân lập gia cầm (Cao Thuấn and Lý Thị Liên Khai, 2018; Nguyễn Hồng Sang cs., 2017) 4.3.1.3 Tính đa kháng kháng sinh vi khuẩn E.coli phân lập Ở Việt Nam, nghiên cứu tính kháng kháng sinh E coli quan tâm từ sớm (Bùi Thị Tho, 1996), vi khuẩn E coli kháng thuốc phát phổ biến động vật nuôi gà, vịt lợn (Cao Thuấn and Lý Thị Liên Khai, 2018; Dang cs.,2018; Dang and Nguyen, 2016; Lê Văn Lê Anh and Lý Thị Liên Khai, 2017; Trương Hà Thái cs.,2017) Để tìm hiểu đặc điểm đa kháng kháng sinh chủng E coli phân lập từ trứng nghiên cứu này, kết thử tính mẫn cảm với kháng sinh tổng hợp theo số loại kháng sinh bị kháng (bảng 4.4) Dựa vào số loại kháng sinh mà E coli mẫn cảm, thấy hầu hết số chủng phân lập (67/ 68 chủng) kháng với nhóm kháng sinh khác trở lên Trong đó, chiếm tỷ lệ cao (39,7%) kháng với loại kháng sinh Về kiểu hình đa kháng, 67 chủng E coli đa kháng kháng sinh nghiên cứu có kiểu hình đa dạng, với kết hợp kiểu hình kháng chủ yếu với loại kháng sinh Tetracyclin, Trimethoprim/Sufamethoxazole Colistin (hình 4.7 4.8, bảng 4.4) 38 Bảng 4.4 Kết kiểm tra tính đa kháng kháng sinh Số loại kháng sinh bị kháng Kiểu hình đa kháng Số lượng chủng Tỷ lệ (%) CIP, AMC, CT, CN, SXT, TE, F 4,4 CIP, AMC, CT, SXT, TE, F CIP, AMC, CT, CN, SXT, TE CIP, CT, CN, SXT, TE, F 1 10,3 AMC, CT, CN, SXT, TE CIP, CT, CN, TE, F CIP, AMC, CT, SXT, TE CIP, CT, CN, SXT, TE 1 10 20,6 10 CT, SXT, TE, F AMC, CT, SXT, TE 1 11 12 13 14 CIP, AMC, CT, F CT, CN, TE, F CIP, CT, SXT, TE CT, CN, SXT, TE 1 15 16 CIP, CT, SXT, TE CIP, CT, SXT, TE 12 17 18 19 20 21 22 CN, SXT, TE CIP, CN, SXT CT, SXT, F CIP, CT, TE CIP, SXT, TE CT, SXT, TE 1 1 17,6 23 24 CT, TE SXT, TE 5,9 Tổng cộng 67 TT 39,7 Ghi chú: Ciprofloxacin (CIP), Amoxicillin-clavulanic acid (AMC), Colistin (CT), Gentamicin (CN), Trimethoprim/ Sufamethoxazole (SXT), Tetracyclin (TE), Nitrofurantoin (F) Kết nghiên cứu kể phù hợp với kết luận rút nhiều nghiên cứu từ Bắc vào Nam, E coli đa kháng với nhiều loại kháng sinh (Cao Thuấn and Lý Thị Liên Khai, 2018; Lê Văn Lê Anh and Lý Thị Liên Khai, 2017; Nguyễn Hồng Sang cs., 2017; Trương Hà Thái cs., 2017) So sánh tỷ lệ đa kháng kháng sinh E coli phân lập Việt Nam công 39 bố mốc thời gian khác cho thấy: (1) vi khuẩn kháng với 6- loại kháng sinh mô tả từ năm 1990 (Bùi Thị Tho, 1996); (2) đa kháng ngày gia tăng với 85,3% số chủng E coli phân lập gà nuôi vùng đồng sông Mekong đa kháng kháng sinh (Nguyen et al., 2015) 4.3.2 Xác định gen kháng kháng sinh chủng vi khuẩn phân lập Các kết trình bày mục 4.3 làm rõ đặc điểm kiểu hình kháng kháng sinh E coli phân lập từ trứng Do tính trạng kháng kháng sinh gen quy định, nên nghiên cứu tiếp tục tìm hiểu đặc điểm gen E coli đa kháng kháng sinh Hiện có hai hướng tiếp cận nghiên cứu gen kháng kháng sinh E coli, là: (1) dùng mồi đặc hiệu phát gen kháng kháng sinh (Nguyen et al., 2016; Trương Quý Dương cs., 2017), (2) giải trình tự phân tích trình tự genome vi khuẩn để xác định gen mã hóa yếu tố độc lực gen kháng kháng sinh (Rumore et al., 2018) Trong phạm vi nghiên cứu này, chọn cách tiếp cận giải trình tự genome E coli để làm rõ tất gen độc lực gen kháng kháng sinh E coli, chọn 01 chủng E coli đại diện (VB104) để giải trình tự genome hệ thống Illumina HiSeq 2000 (Công ty BGI, Hồng Kông) 4.3.2.1 Gen kháng kháng sinh chủng E coli VB104 Bằng công cụ ResFinder xác định 10 gen kháng kháng sinh thuộc nhóm kháng sinh mã hóa genome chủng VB104 Kết tổng hợp bảng 4.5 Bảng 4.5 Kết xác định gen kháng kháng sinh TT 10 Gen kháng kháng sinh tet(A) sul2 dfrA14 aph(3'')-Ib aph(6)-Id floR blaTEM-1B qnrS1 mdf(A) mcr-1.1 Kháng nhóm kháng sinh Tetracycline Sulphonamide Trimethoprim Aminoglycoside Aminoglycoside Phenicol Beta-lactam Quinolone Macrolide Polypeptide (Colistin) 40 Mã số GenBank tham chiếu AF534183 AY034138 KF921535 AF321551 CP000971 AF118107 AY458016 AB187515 Y08743 KP347127 Có thể thấy chủng VB104 mang gen kháng với nhiều nhóm kháng sinh Kết phù hợp với đặc điểm kiểu hình đa kháng kháng sinh chủng vi khuẩn thử tính mẫn cảm với giấy tẩm kháng sinh Kết phát gen kháng kháng sinh giải trình tự genome loại gen kháng kháng sinh E coli phát phương pháp PCR (Nhung cs., 2015; Trương Quý Dương cs., 2017) Tuy nhiên, ưu điểm phương pháp giải trình tự genome nằm khả phát nhiều gen mã hóa yếu tố độc lực khác vi khuẩn (kết khơng trình bày) cho phép phân tích biến thể (variant) gen kháng kháng sinh Trong nghiên cứu này, chúng tơi phân tích gen kháng kháng sinh quan trọng là: mcr-1.1 (kháng Colistin) 4.3.2.2 Đặc điểm biến đổi gen kháng nhóm MCR-1.1 chủng VB104 Kháng sinh thuộc nhóm polypeptide (trong có Colistin) xem dòng kháng sinh cuối điều trị vi khuẩn Gram âm kháng carbapenem Gen mã hóa protein kháng Colistin mcr-1 nằm plasmid, nên có khả truyền ngang (Wei et al., 2018) Do đó, nghiên cứu có mặt xác định xuất biến thể gen mcr-1 chủng vi khuẩn cần thiết Kết so sánh trình tự amino acid cho biết gen mcr-1 chủng VB104 gồm 541 amino acid giống hồn tồn so với trình tự tương ứng chủng E coli có mã số tham chiếu ANH55937, BAV82474 AQZ20430 (hình 4.10) Hình 4.10 So sánh trình tự amino acid protein mã hóa gen mcr-1 Ghi chú: Các vị trí có khác biệt so với chủng tham chiếu (ANH55937) đánh dấu mầu tương ứng với loại amino acid 41 Kết xây dựng phát sinh chủng loại xác định mối liên hệ gen mcr-1 chủng VB104 với chủng tham chiếu trình bày hình 5.1 Hình 4.11 Cây phát sinh chủng loại dựa vào trình tự amino acid protein mã hóa gen mcr-1 Đặc điểm phân nhánh phát sinh chủng loại (hình 4.11) cho biết gen mcr-1 chủng VB104 nằm nhóm biến thể mcr-1/2 gần với chủng tham chiếu ANH55937 AQZ20430 Plasmid yếu tố di truyền di động (mobile genetic elements) tồn độc lập với nhiễm sắc thể vi khuẩn có khả tự tái Plasmid chứa gen kháng kháng sinh, có gen mcr-1 Bằng thực nghiệm, gen mcr-1 E coli chứng minh có khả truyền ngang với tỷ lệ lên tới 54,0% (Nguyen et al., 2016) Mặt khác, chủng E coli mang gen kháng Colistin lại tương đối phổ biến gà, nhiều nước giới (Maciuca et al., 2019; Quesada et al., 2016) Kết xác định có mặt gen mcr-1 nghiên cứu nhiều nghiên cứu khác cho thấy cần thiết phải có thay đổi cách quản lý, sử dụng kháng sinh chăn nuôi, nhằm mục tiêu hạn chế/ ngăn chặn phát tán E coli kháng kháng sinh 42 PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 KẾT LUẬN 5.1.1 Về tình hình sử dụng kháng sinh trang trại Có tổng số 14 loại kháng sinh điều tra sử dụng, loại kháng sinh dùng phổ biến là: Amoxicillin (62,1%), Doxycyclin (58,6%), Trimethoprim/sulfamethoxazole (51,7%) 5.1.2 Về kết phân lập giám định vi khuẩn E coli Vi khuẩn E coli phân lập vỏ trứng nhóm: đàn gà khơng sử dụng có sử dụng kháng sinh q trình chăn ni Tỷ lệ phân lập 33,3% tổng số 204 mẫu phân lập 68 chủng Các chủng E.coli phân lập mang đầy đủ đặc tính sinh hóa tài liệu kinh điển mô tả 5.1.3 Về đặc điểm kháng kháng sinh vi khuẩn E coli - E coli phân lập từ vỏ trứng kháng cao (95,6% - 92,6% - 88,2%) với Tetracycline, Trimethoprim/Sufamethoxazole Colistin - Tỷ lệ chủng E coli kháng thuốc phân lập nhóm gà khơng sử dụng kháng sinh ln thấp nhóm khơng sử dụng kháng sinh - Có 67/ 68 chủng phân lập kháng với nhóm kháng sinh khác nhau, chiếm tỷ lệ cao (39,7%) kháng với loại kháng sinh Kiểu hình đa kháng chủ yếu Tetracyclin, Trimethoprim/Sufamethoxazole Colistin - Đặc điểm di truyền chủng vi khuẩn E coli VB104 mang đồng thời 10 gen kháng thuốc thuộc nhóm kháng sinh Trong gen mcr-1 thuộc biến thể mcr-1/2 5.2 KIẾN NGHỊ - Cần tiếp tục nghiên cứu lưu hành gen kháng kháng sinh để làm sở cho biện pháp ngăn ngừa phát tán chủng vi khuẩn mang gen kháng kháng sinh - Nghiên cứu chế hình thành gen kháng kháng sinh vi khuẩn E coli phân lập trứng gà - Nghiên cứu nguồn nguy chủng E coli kháng kháng sinh gây ô nhiễm trứng 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO I Tài liệu tiếng Việt: Võ Thị Trà An Đào Thị Phương Lan (2010) Đề kháng kháng sinh Escherichia coli phân lập từ vật nuôi diện β-Lactam phổ rộng Tạp chí KHKT thú y XVII (2) Tr.42 – 43 Võ Thị Trà An, Nguyễn Ngọc Tuân Nguyễn Như Pho (2002) Tình hình sử dụng kháng sinh dư lượng kháng sinh thịt gà thành phố Hồ Chí Minh Tạp chí KHKT thú y XVII (9) Trương Quý Dương, Phạm Thị Ngọc, Ngô Chung Thủy, Đặng Thị Thanh Sơn, Trần Thị Nhật Trương Thị Hương Giang, 2017 Mức độ kháng kháng sinh gene quy định sản sinh men beta-lactamaza (ESBL) chủng E coli sản sinh ESBL phân lập từ sở giết mổ lợn địa bàn Hà Nội Khoa học kỹ thuật thú y 24 tr 31-38 Lê Thị Ngọc Diệp (1999) Thuốc chống vi khuẩn – phân loại – chế - tác dụng – kháng thuốc ứng dụng chăn nuôi thú y Chuyên đề giảng dạy sau đại học, chuyên ngành Thú y, Đại học Nông nghiệp I Hà Nội Tr 2-37 Đậu Ngọc Hào (2010), Kháng sinh – tác dụng phụ độc tính Tạp chí KHKT thú y XVII (1) 2010 Tr 89 – 95 Hồng Tích Huyền (1997) Hướng dẫn sử dụng thuốc kháng sinh Nhà xuất Y học, Hà Nội Tr 7-20 Nguyễn Hữu Hồng Nguyễn Thị Vinh (2007) Sự đề kháng kháng sinh vi khuẩn, Hướng dẫn sử dụng kháng sinh Nhà xuất Y học Hà Nội Tr.21 - 30 Dương Thị Toan Nguyễn Văn Lưu (2015) Tình hình sử dụng kháng sinh chăn ni lợn thịt, gà thịt số trại chăn nuôi địa bàn tỉnh Bắc Giang Tạp chí Khoa học Nơng nghiệp Việt Nam (5) Tr.717 Nguyễn Như Thanh, Nguyễn Bá Hiên Trần Thị Lan Hương (1997) Giáo trình Vi sinh vật thú y NXB Nông nghiệp, Hà Nội 10 Trương Hà Thái, Nguyễn Ngọc Đức (2010) Bệnh trực khuẩn coli số giống gà công nghiệp hướng thịtvà khả kháng kháng sinh số chủng E coli Tạp chí KHKT thú y XVI (6) Tr 15 11 Trương Hà Thái, Phạm Hồng Ngân, Chu Thị Thanh Hương, Cam Thị Thu Hà, 2017 Khả kháng kháng sinh E.coli Salmonella phân lập từ trứng gia cầm bán số chợ địa bàn thành phố Hà Nội Tạp chí Khoa học Nơng nghiệp Việt Nam 15 tr 770-775 44 12 Võ Thành Thìn, Lê Đình Hải, Vũ Khắc Hùng (2010) Khả kháng kháng sinh vi khuẩn E coli phân lập từ lợn mắc bệnh tiêu chảy Tạp chí KHKT thú y XVII (6) Tr 13 Bùi Thị Tho (2010) Dược lý học thú y Chuyên đề giảng dạy sau đại học, chuyên ngành Thú y Học viện Nông nghiệp Việt Nam 14 Bùi Thị Tho, 1996 Nghiên cứu tác dụng số thuốc hóa học trị liệu phytoncid với E coli phân lập từ bệnh lợn phân trắng Luận án phó tiến sĩ khoa học Nơng nghiệp, Đại học Nơng nghiệp Hà Nội 15 Trí, N.M., 2000 Khảo sát nồng độ ức chế tối thiểu kháng sinh thường dùng loại vi khuẩn gây nhiễm trùng cộng đồng bệnh viện Chợ Rẫy từ 1/2000 đến 5/2000 II Tài liệu tiếng Anh: 16 Abellanosa I and Nichter M (1996) Antibiotic prophylaxis amongcommercial sex workers in Cebu City, Philippines Patterns of use and perceptions of efficacy Sex Transm Dis 23 pp 407 – 412 17 Alonso, J.L., Soriano, A., Carbajo, O., Amoros, I., Garelick, H (1999): Comparison and Recovery of Escherichia coli and Thermotolerant Coliforms in Water with a Chromogenic Medium Incubated at 41 and 44.5°C Appl Environ Microbiol 65 pp 3746-3749 18 Dang, S.T.T., Bortolaia, V., Tran, N.T., Le, H.Q and Dalsgaard, A., 2018 Cephalosporin-resistant Escherichia coli isolated from farm workers and pigs in northern Vietnam Tropical medicine & international health : TM & IH 23, 415-424 19 Dho-Moulin, M.and Fairbrother, J M (1999) Avian pathogenic Escherichia coli Vet Res 30 pp 299 – 379 20 Smith, J.L and Fratamico, P.M., (2006): Escherichia coli infections In: Riemann, H.P., Cliver, D.O (3rd): Food-borne infections and intoxications Florida: Elsevier Inc Academic Press pp 205-208 21 Nguyen, N.T., Nguyen, H.M., Nguyen, C.V., Nguyen, T.V., Nguyen, M.T., Thai, H.Q., Ho, M.H., Thwaites, G., Ngo, H.T., Baker, S., Carrique-Mas, J., 2016a Use of Colistin and Other Critical Antimicrobials on Pig and Chicken Farms in Southern Vietnam and Its Association with Resistance in Commensal Escherichia coli Bacteria Applied and Environmental Microbiology 82 pp 3727 22 Nguyen, V.T., Carrique-Mas, J.J., Ngo, T.H., Ho, H.M., Ha, T.T., Campbell, J.I., Nguyen, T.N., Hoang, N.N., Pham, V.M., Wagenaar, J.A., Hardon, A., Thai, Q.H., Schultsz, C., 2015 Prevalence and risk factors for carriage of antimicrobial-resistant 45 Escherichia coli on household and small-scale chicken farms in the Mekong Delta of Vietnam The Journal of antimicrobial chemotherapy 70 pp 2144-2152 23 Usui, M., Ozawa, S., Onozato, H., Kuge, R., Obata, Y., Uemae, T., Ngoc, P.T., Heriyanto, A., Chalemchaikit, T., Makita, K., Muramatsu, Y., Tamura, Y., 2014 Antimicrobial susceptibility of indicator bacteria isolated from chickens in Southeast Asian countries (Vietnam, Indonesia and Thailand) J Vet Med Sci 76 pp 685-692 24 Nhung, N.T., Cuong, N.V., Campbell, J., Hoa, N.T., Bryant, J.E., Truc, V.N., Kiet, B.T., Jombart, T., Trung, N.V., Hien, V.B., Thwaites, G., Baker, S., Carrique-Mas, J., 2015 High levels of antimicrobial resistance among escherichia coli isolates from livestock farms and synanthropic rats and shrews in the Mekong Delta of Vietnam Appl Environ Microbiol 81 pp 812-820 25 Al-Kobaisi, M.F., 2007 Jawetz, Melnick & Adelberg’s Medical Microbiology 24th Edition Sultan Qaboos University Medical Journal [SQUMJ] 7, 273-275 26 Chu, V.T., Tran, T.M.T., Vu, D.M., Pham, T.T., Khuc, T.S., Tran, T.H., Nguyen, T.L., Nguyen, T.K.C., Do, V.T., Nguyen, T.T.H., 2016 Study on residues of antibiotics and beta-agonistin fresh meat (pork, chicken meat) and pig urine at slaughterhouses in some Northern provinces, Viet Nam Veterinary Sciences and Techniques 23 pp 76-84 27 DEid, S., Nasef, S., Erfan, A., 2015 Multidrug resistant bacterial pathogens in eggs collected from backyard chickens Assiut Vet Med J Vol 61 No 144 pp 87-103 28 Hamid, S., 2016 Insight into Chicken Egg Proteins and Their Role in Chemical Defense Mechanism International Journal of Poultry Science 15 pp 76-80 29 Jonchère, V., Réhault-Godbert, S., Hennequet-Antier, C., Cabau, C., Sibut, V., Cogburn, L.A., Nys, Y., Gautron, J., 2010 Gene expression profiling to identify eggshell proteins involved in physical defense of the chicken egg BMC Genomics 11 pp 57 30 Maciuca, I.E., Cummins, M.L., Cozma, A.P., Rimbu, C.M., Guguianu, E., Panzaru, C., Licker, M., Szekely, E., Flonta, M., Djordjevic, S.P., Timofte, D., 2019 Genetic Features of mcr-1 Mediated Colistin Resistance in CMY-2-Producing Escherichia coli From Romanian Poultry Frontiers in Microbiology 10 31 Nguyen, N.T., Nguyen, H.M., Nguyen, C.V., Nguyen, T.V., Nguyen, M.T., Thai, H.Q., Ho, M.H., Thwaites, G., Ngo, H.T., Baker, S., Carrique-Mas, J., 2016 Use of Colistin and Other Critical Antimicrobials on Pig and Chicken Farms in Southern Vietnam and Its Association with Resistance in Commensal Escherichia coli Bacteria Applied and Environmental Microbiology 82 pp 3727 46 32 Nguyen, V.T., Carrique-Mas, J.J., Ngo, T.H., Ho, H.M., Ha, T.T., Campbell, J.I., Nguyen, T.N., Hoang, N.N., Pham, V.M., Wagenaar, J.A., Hardon, A., Thai, Q.H., Schultsz, C., 2015 Prevalence and risk factors for carriage of antimicrobial-resistant Escherichia coli on household and small-scale chicken farms in the Mekong Delta of Vietnam The Journal of antimicrobial chemotherapy 70 pp 2144-2152 33 Nhung, N.T., Cuong, N.V., Campbell, J., Hoa, N.T., Bryant, J.E., Truc, V.N., Kiet, B.T., Jombart, T., Trung, N.V., Hien, V.B., Thwaites, G., Baker, S., Carrique-Mas, J., 2015 High levels of antimicrobial resistance among escherichia coli isolates from livestock farms and synanthropic rats and shrews in the Mekong Delta of Vietnam Appl Environ Microbiol 81 pp 812-820 34 Okorie-Kanu, O.J., Ezenduka, E.V., Okorie-Kanu, C.O., Ugwu, L.C., Nnamani, U.J., 2016 Occurrence and antimicrobial resistance of pathogenic Escherichia coli and Salmonella spp in retail raw table eggs sold for human consumption in Enugu state, Nigeria Vet World 9, 1312-1319 35 Quesada, A., Ugarte-Ruiz, M., Iglesias, M.R., Porrero, M.C., Martínez, R., Florez-Cuadrado, D., Campos, M.J., García, M., Píriz, S., Sáez, J.L., Domínguez, L., 2016 Detection of plasmid mediated colistin resistance (MCR-1) in Escherichia coli and Salmonella enterica isolated from poultry and swine in Spain Research in Veterinary Science 105, 134-135 36 Rumore, J., Tschetter, L., Kearney, A., Kandar, R., McCormick, R., Walker, M., Peterson, C.L., Reimer, A., Nadon, C., 2018 Evaluation of whole-genome sequencing for outbreak detection of Verotoxigenic Escherichia coli O157:H7 from the Canadian perspective BMC Genomics 19, 870 37 Van, T.T., Chin, J., Chapman, T., Tran, L.T., Coloe, P.J., 2008 Safety of raw meat and shellfish in Vietnam: an analysis of Escherichia coli isolations for antibiotic resistance and virulence genes Int J Food Microbiol 124, 217-223 38 Wei, W., Srinivas, S., Lin, J., Tang, Z., Wang, S., Ullah, S., Kota, V.G., Feng, Y., 2018 Defining ICR-Mo, an intrinsic colistin resistance determinant from Moraxella osloensis PLOS Genetics 14, e1007389 39 Wellman-Labadie, O., Picman, J., Hincke, M.T., 2008 Antimicrobial activity of cuticle and outer eggshell protein extracts from three species of domestic birds Br Poult Sci 49, 133-143 40 uong, T.T., Nguyen, V.L., 2015 Survey on Antibiotics for Porker and Broiler Chicken in Commercial Farm in Bac Giang Province J Sci & Devel 13 pp 717-722 47 PHỤ LỤC Tình hình sử dụng kháng sinh chăn nuôi gia cầm địa bàn Hà Nội vùng phụ cận Tiêu chí Sử dụng kháng sinh chăn ni Có Số hộ chăn ni gia cầm (n = 50) Trang Tỷ lệ (%) trại 50 100 Mục đích sử dụng kháng sinh Trị bệnh 12 24 Phòng bệnh 23 46 Tăng trọng 0,00 Kết hợp phòng trị bệnh 15 30 Theo kinh nghiệm 10 20 Theo hướng dẫn nhà sản xuất 21 42 Theo đơn bác sĩ thú y 19 38 Quyết định liều lượng kháng sinh Theo kinh nghiệm 16 Theo hướng dẫn nhà sản xuất 24 48 Theo đơn bác sĩ thú y 18 36 Phối hợp kháng sinh Theo kinh nghiệm 10 Theo hướng dẫn nhà sản xuất 20 40 Theo đơn bác sĩ thú y 25 50 Thời gian ngừng sử dụng thuốc trước xuất chuồng Theo kinh nghiệm 28 56 Theo hướng dẫn nhà sản xuất 14 28 Theo đơn bác sĩ thú y 16 Lựa chọn kháng sinh 48 PHỤ LỤC Các loại kháng sinh sử dụng thời gian điều tra Số hộ Số hộ sử dụng điều tra kháng sinh Số lần sử dụng kháng sinh Kháng sinh sử dụng Nhóm β - lactam 50 50 78 Nhóm Aminoglycosid 6,1 Nhóm Polypeptide 1,0 Nhóm Macrolide 2,1 Nhóm Lincosamid 7,3 Nhóm Phenicol 1,0 Nhóm Quinolon 10,4 Nhóm Tetracyclin Kháng sinh hỗn hợp 49 Tần suất sử dụng (Tỷ lệ %) 8.2 9,3 54,6 PHỤ LỤC MộT Số HÌNH ảNH PHÂN LậP TạI PHỊNG THÍ NGHIệM THAO TÁC THỬ KHÁNG SINH ĐỒ 50 ... Tổng số vii TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Nguyễn Hồng Thái Tên luận văn: Tình hình kháng kháng sinh vi khuẩn Escherichia coli phân lập từ trứng gà số trang trại địa bàn Hà Nội vùng phụ cận? ??... tính kháng kháng sinh vi khuẩn E coli phân lập từ trứng thu thập từ trang trại địa bàn Hà Nội vùng phụ cận 1.3 ĐỊA ĐIỂM THỰC HIỆN ĐỀ TÀI - Mẫu thu thập số trang trại chăn nuôi gà đẻ trứng địa bàn. .. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU - Điều tra tình hình sử dụng kháng sinh chăn ni trang trại địa bàn Hà Nội vùng phụ cận - Phân lập giám định vi khuẩn E .coli phân lập từ trứng thu thập trang trại địa bàn hà