Tình hình kháng kháng sinh của vi khuẩn escherichia coli phân lập từ trứng gà tại một số trang trại trên địa bàn hà nội và vùng phụ cận

HỌC VIỆN NƠNG NGHIỆP VIỆT NAM NGUYỄN HỒNG THÁI TÌNH HÌNH KHÁNG KHÁNG SINH CỦA VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI PHÂN LẬP TỪ TRỨNG GÀ TẠI MỘT SỐ TRANG TRẠI TRÊN ĐỊA BÀN HÀ NỘI VÀ VÙNG PHỤ CẬN Chuyên ngành: Thú Y Mã số: 8640101 Người hướng dẫn khoa học: TS Chu Thị Thanh Hương NHÀ XUẤT BẢN HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP - 2019 LỜI CAM ĐOAN Dữ liệu luận văn phần đề tài “Nghiên cứu tính kháng kháng sinh vi khuẩn E.coli phân lập từ trứng phát tán chủng vi khuẩn kháng thuốc trang trại”, mã số 02/DAVB, tài trợ Dự án Việt- Bỉ thuộc chương trình hợp tác nghiên cứu khoa học Học viện Nông nghiệp Việt Nam Trường Đại học Vương quốc Bỉ, giai đoạn 2014-2019 Tôi xin cam đoan số liệu, kết nghiên cứu luận văn trung thực, xác chưa sử dụng để bảo vệ học vị Tôi xin cam đoan thơng tin trích dẫn luận văn rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày tháng năm 2019 Tác giả luận văn Nguyễn Hồng Thái i LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu hồn thành luận văn, tơi nhận hướng dẫn, bảo tận tình thầy giáo Cùng giúp đỡ, động viên bạn bè, đồng nghiệp gia đình Nhân dịp hồn thành luận văn, cho phép cảm ơn Ban Giám Đốc Học viện Nông nghiệp Việt Nam, Bộ môn Vi Sinh Vật – Truyền nhiễm, Khoa Thú y – Học viện Nông nghiệp Việt Nam, tạo điều kiện cho học tập, thực đề tài hoàn thành luận văn Đặc biệt, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới TS Chu Thị Thanh Hương khoa Thú y tận tình hướng dẫn, tạo điều kiện cho tơi suốt q trình thực đề tài hồn thành luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn hộ trang trại chăn nuôi gia cầm địa bàn Hà Nội vùng phụ cận tận tình giúp đỡ, tạo điều kiện cho tơi hồn thành đề tài nghiên cứu Cuối cùng, xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè, đồng nghiệp ln động viên khuyến khích tơi hồn thành luận văn Hà Nội, ngày tháng năm 2019 Tác giả luận văn Nguyễn Hồng Thái ii MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục bảng v Danh mục hình vi Danh mục chữ viết tắt vii Trích yếu luận văn viii Thesis abstract x Phần Mở đầu 1.1 Tính cấp thiết đề tài 1.2 Mục tiêu nghiên cứu đề tài 1.3 Địa điểm thực đề tài Phần Tổng quan tài liệu 2.1 Một số hiểu biết vi khuẩn escherichia coli 2.1.1 Khái quát vi khuẩn E.coli 2.1.2 Đặc tính sinh học 2.1.3 Đặc điểm nuôi cấy 2.1.4 Đặc tính sinh hóa 2.1.5 Đặc tính gây bệnh sức đề kháng 2.2 Tính kháng kháng sinh vi khuẩn E coli 2.2.1 Thuốc kháng sinh 2.2.2 Phân loại kháng sinh 2.2.3 Cơ chế tác dụng kháng sinh 2.2.4 Hiện tượng kháng kháng sinh vi khuẩn 2.2.5 Cơ chế kháng kháng sinh vi khuẩn 12 2.2.6 Cơ chế kháng kháng sinh vi khuẩn E coli số nghiên cứu 14 2.3 Tình hình nghiên cứu kháng kháng sinh vi khuẩn E coli 15 2.3.1 Tình hình nghiên cứu giới 15 2.3.2 Tình hình nghiên cứu Việt Nam 16 2.3.3 Tình hình kháng kháng sinh vi khuẩn E coli gà 19 iii Phần Nội dung, nguyên liệu phương pháp nghiên cứu 21 3.1 Nội dung nghiên cứu 21 3.2 Đối tượng nghiên cứu 21 3.3 Nguyên liệu nghiên cứu 21 3.3.1 Mẫu 21 3.3.2 Các môi trường chuyên dụng dùng để phân lập, giám định vi khuẩn 21 3.3.3 Các kháng sinh sử dụng đề tài 21 3.3.4 Dụng cụ thí nghiệm 21 3.4 Phương pháp nghiên cứu 22 3.4.1 Điều tra tình hình sử dụng thuốc kháng sinh chăn ni gà đẻ 22 3.4.2 Phương pháp thu thập trứng 22 3.4.3 Phương pháp xử lý mẫu 22 3.4.4 Phương pháp bảo quản mẫu 22 3.4.5 Phương pháp phân lập giám định vi khuẩn E coli 22 3.4.6 Thử tính kháng kháng sinh vi khuẩn E coli phân lập 23 3.5 Phương pháp xử lý số liệu 26 Phần Kết nghiên cứu thảo luận 27 4.1 Kết điều tra tình hình sử dụng kháng sinh 27 4.2 Kết phân lập giám định vi khuẩn E coli 28 4.2.1 Kết phân lập vi khuẩn E Coli 28 4.2.2 Kết giám định vi khuẩn E.coli 32 4.3 Kiểm tra tính kháng kháng sinh xác định gen kháng kháng sinh vi khuẩn 33 4.3.1 Đặc điểm kháng kháng sinh vi khuẩn E coli phân lập 33 4.3.2 Xác định gen kháng kháng sinh chủng vi khuẩn phân lập 40 Phần Kết luận kiến nghị 43 5.1 Kết luận 43 5.1.1 Về tình hình sử dụng kháng sinh trang trại 43 5.1.2 Về kết phân lập giám định vi khuẩn E coli 43 5.1.3 Về đặc điểm kháng kháng sinh vi khuẩn E coli 43 5.2 Kiến nghị 43 Phụ lục 48 iv DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Kết xét nghiệm vi khuẩn E coli kháng nhiều loại kháng sinh 18 Bảng 3.1 Bảng đánh giá khả mẫn cảm / kháng E coli 24 Bảng 3.2 Trình tự gen tham chiếu mcr-1 26 Bảng 4.1 Kết phân lập E coli từ trứng swab ổ nhớp 30 Bảng 4.2 Kết phân lập E coli vỏ trứng theo địa phương lấy mẫu 31 Bảng 4.3 Chỉ tiêu sinh hóa Vi khuẩn E.coli 32 Bảng 4.4 Kết kiểm tra tính đa kháng kháng sinh 39 Bảng 4.5 Kết xác định gen kháng kháng sinh 40 v DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 E coli niêm mạc ruột Hình 2.2 E coli kính hiển vi điện tử Hình 2.3 Cơ chế tác dụng kháng sinh Hình 2.4 Cơ chế kháng kháng sinh vi khuẩn 14 Hình 3.1 Tóm tắt bước phân lập bảo quản giống 23 Hình 3.2 Sơ đồ bố trí khoanh giấy kháng sinh 25 Hình 4.1 Kết điều tra tình hình sử dụng kháng sinh 27 Hình 4.2 Hình ảnh đặc trưng vi khuẩn E coli môi trường (1) MacConKey (2) TBX 29 Hình 4.3 Kết phân lập E coli thạch TBX 29 Hình 4.4 Tỷ lệ phân lập E coli vỏ trứng theo tình trạng dùng kháng sinh 32 Hình 4.6 Tính mẫn cảm kháng sinh E coli phân lập từ vỏ trứng 34 Hình 4.7 Tính mẫn cảm với Ciprofloxacin, Amoxicillin Colistin 35 Hình 4.8 Kết thử tính mẫn cảm với Gentamycin, Trimethoprim/sulfamethoxazole, Tetracycline Nitrofurantoin 36 Hình 4.9 So sánh tính mẫn cảm E coli phân lập từ vỏ trứng nhóm khơng sử dụng có sử dụng kháng sinh 37 Hình 4.10 So sánh trình tự amino acid protein mã hóa gen mcr-1 41 Hình 4.11 Cây phát sinh chủng loại dựa vào trình tự amino acid protein mã hóa gen mcr-1 42 vi DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Nghĩa tiếng Việt cs Cộng DNA Deoxyribonucleic acid E coli Escherichia coli Gr+ Gram (+) Gr- Gram (-) H High I Intermediate MIC Minimum inhibitory concentration PABA Para Aminobenzonic acid R Resistant S Susceptible RNA Ribonucleic acid TCCS Tiêu chuẩn sở ∑ Tổng số vii TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Nguyễn Hồng Thái Tên luận văn: Tình hình kháng kháng sinh vi khuẩn Escherichia coli phân lập từ trứng gà số trang trại địa bàn Hà Nội vùng phụ cận” Chuyên ngành: Thú y Mã số: 8640101 Cơ sở đào tạo: Học viện nông nghiệp Việt Nam Mục đích nghiên cứu - Đánh giá mức kháng kháng sinh vi khuẩn E coli phân lập từ trứng thu thập từ trang trại địa bàn Hà nội vùng phụ cận Phương pháp nghiên cứu - Khảo sát trạng sử dụng thuốc kháng sinh chăn nuôi gà đẻ - Phương pháp thu thập trứng - Phương pháp phân lập giám định vi khuẩn E coli - Thử tính kháng kháng sinh vi khuẩn E coli phân lập - Phương pháp xử lý số liệu phần mềm Microsoft Excel Kết nghiên cứu Kết điều tra tình hình sử dụng kháng sinh Trong tổng số 14 loại kháng sinh điều tra có loại sử dụng q trình chăn ni gà, số loại thấy dùng phổ biến nhất, ví dụ như: Amoxicillin (62,1%), Doxycyclin (58,6%), Trimethoprim/sulfamethoxazole (51,7%) Người chăn nuôi dùng kháng sinh chủ yếu dựa vào kinh nghiệm chăn nuôi làm theo hướng dẫn nhà sản xuất Về mục đích sử dụng kháng sinh, phần lớn kháng sinh dùng để phòng bệnh Kết phân lập giám định vi khuẩn E.coli Nghiên cứu thu thập mẫu 29 đàn gà nuôi Hà Nội, Hưng Yên Hịa Bình Có 10 đàn gà khơng sử dụng kháng sinh 19 đàn gà dùng kháng sinh trình ni Kết xác định tỷ lệ nhiễm E coli kể cho biết vỏ trứng nguồn lây nhiễm vi khuẩn E coli từ trang trại tới bàn ăn Mặt khác, tỷ lệ nhiễm E coli lòng trứng thấp (1,6%) nên nghiên cứu tập trung phân lập E coli vỏ trứng dùng cho nghiên cứu khả kháng kháng sinh Các phần tổng hợp kết phân lập E coli vỏ trứng theo địa phương theo tình trạng sử dụng viii kháng sinh q trình ni 3.Tính kháng kháng sinh vi khuẩn E.coli phân lập 3.1.Đặc điểm kháng kháng sinh vi khuẩn E.coli phân lập Nghiên cứu đặc điểm kháng kháng sinh E coli, có khoảng 16 loại kháng sinh thường dùng nhiên có loại kháng sinh thử, bao gồm: Tetracyclin, Trimethoprim/Sufamethoxazole, Vancomycin, Ciprofloxacin, Erythromycin, Gentamicin, Nitrofurantoin, Colistin Amoxicillin-clavulanic acid Các chủng E coli hình thành vịng vơ khuẩn với đường kính vịng vơ khuẩn khác Đối với loại kháng sinh vi khuẩn Gram âm khơng mẫn cảm Vancomycin Erythromycin, 100% số chủng E coli thử khơng hình thành hình thành vịng vơ khuẩn với đường kính nhỏ (< cm) 3.2.Đặc điểm di truyền E.coli đa kháng kháng sinh Nghiên cứu làm rõ đặc điểm kiểu hình kháng kháng sinh E coli phân lập từ trứng Do tính trạng kháng kháng sinh gen quy định, nên nghiên cứu tiếp tục tìm hiểu đặc điểm gen E coli đa kháng kháng sinh Hiện có hai hướng tiếp cận nghiên cứu gen kháng kháng sinh E coli, là: (1) dùng mồi đặc hiệu phát gen kháng kháng sinh (Nguyen et al., 2016; Trương Quý Dương cs., 2017), (2) giải trình tự phân tích trình tự genome vi khuẩn để xác định gen mã hóa yếu tố độc lực gen kháng kháng sinh (Rumore et al., 2018) Trong phạm vi nghiên cứu này, chọn cách tiếp cận giải trình tự genome E coli để làm rõ tất gen độc lực gen kháng kháng sinh E coli, chọn 01 chủng E coli đại diện (VB104) để giải trình tự genome hệ thống Illumina HiSeq 2000 (Cơng ty BGI, Hồng Kơng) ix Hình 4.8 Kết thử tính mẫn cảm với Gentamycin, Trimethoprim/sulfamethoxazole, Tetracycline Nitrofurantoin Ghi chú: kết tổng hợp 68 chủng E coli, chia thành nhóm khơng sử dụng kháng sinh nhóm có sử dụng kháng sinh Trục Oy biểu thị tỷ lệ % số chủng thử kháng sinh đồ đường kính (cm) vịng vơ khuẩn tương ứng (trục Ox) Với loại kháng sinh, vùng màu xám đánh dấu vùng kháng kháng sinh Tỷ lệ % vùng màu xám biểu thị mức phổ biến tượng kháng thuốc kháng sinh Hình 4.7 hình 4.8 giúp đưa nhận xét sau: ln có tỷ lệ kháng loại kháng sinh chủng vi khuẩn E coli phân lập từ mẫu trứng đàn gà sử dụng khơng sử dụng kháng sinh q trình nuôi Tỷ lệ kháng khác loại kháng sinh Vi khuẩn E coli phân lập từ vỏ trứng kháng nhiều (95,6% - 92,6% - 88,2%) loại kháng sinh Tetracycline, Trimethoprim/Sufamethoxazole Colistin Ngược lại, có từ 14,7% đến 20,6% số chủng E coli phân lập kháng với Amoxicillin-clavulanic 36 acid Nitrofurantoin Tại nghiên cứu tình hình kháng kháng sinh E coli phân lập từ gia cầm, tác giả xác nhận E coli có tỷ lệ kháng cao Tetracycline (78,3%), Trimethoprim (58,7%) (Trương Hà Thái cs., 2017); Ciprofloxacin (73,3%), Gentamicin (42,2%) (Nguyen et al., 2016) Về khía cạnh này, kết thu nghiên cứu thời phù hợp kết luận mức kháng phổ biến Tetracycline, Trimethoprim Ciprofloxacin 4.3.1.2 Đặc điểm mẫn cảm theo tình hình sử dụng kháng sinh Kết thử tính mẫn cảm với kháng sinh tiếp tục phân tích để làm rõ khác biệt tính mẫn cảm kháng với loại kháng sinh vi khuẩn phân lập từ nhóm gà (khơng sử dụng, có sử dụng kháng sinh), hình 4.9 37 ... tính kháng kháng sinh vi khuẩn E coli phân lập từ trứng thu thập từ trang trại địa bàn Hà Nội vùng phụ cận 1.3 ĐỊA ĐIỂM THỰC HIỆN ĐỀ TÀI - Mẫu thu thập số trang trại chăn nuôi gà đẻ trứng địa bàn. .. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU - Điều tra tình hình sử dụng kháng sinh chăn ni trang trại địa bàn Hà Nội vùng phụ cận - Phân lập giám định vi khuẩn E .coli phân lập từ trứng thu thập trang trại địa bàn hà. .. Tổng số vii TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Nguyễn Hồng Thái Tên luận văn: Tình hình kháng kháng sinh vi khuẩn Escherichia coli phân lập từ trứng gà số trang trại địa bàn Hà Nội vùng phụ cận? ??