Tình hình kháng kháng sinh của các chủng vi khuẩn lậu đã phân lập tại bệnh viện da liễu trung ương năm 2017

NGUYỄN HOA LAN Tên đề tài: TÌNH HÌNH KHÁNG KHÁNG SINH CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN LẬU ĐÃ PHÂN LẬP TẠI BỆNH VIỆN DA LIỄU TRUNG ƯƠNG NĂM 2017 Thuộc chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 604

NGUYỄN HOA LAN

NGUYỄN HOA LAN

Tên đề tài:

TÌNH HÌNH KHÁNG KHÁNG SINH CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN LẬU

ĐÃ PHÂN LẬP TẠI BỆNH VIỆN DA LIỄU TRUNG ƯƠNG

NĂM 2017

Thuộc chuyên ngành: Vi sinh vật học

Mã số: 60420107

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS Lê Văn Hưng

Tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới TS Lê Văn Hưng đã

tận tình hướng dẫn, tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn Tôi cũng xin trân trọng cảm ơn TS Phạm Đức Ngọc đã tư vấn và góp ý cho các kết quả nghiên cứu trong luận văn

Qua đây, tôi cũng xin chân thành cảm ơn các cán bộ phòng xét nghiệm Vi sinh, tập thể khoa Vi sinh – nấm – ký sinh trùng, bệnh viện Da Liễu Trung Ương

đã giúp đỡ, động viên và khích lệ tôi rất nhiều trong suốt thời gian thực hiện luận văn thạc sĩ; các thầy cô giáo trong Bộ môn Vi sinh vật học và các thầy cô thuộc Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội đã mang đến kiến thức quý báu và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi được học tập, nghiên cứu tại trường

Sau cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến gia đình, người thân và bạn bè đã luôn sát cánh động viên, khích lệ và giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn tốt nghiệp này

Tôi xin chân thành cảm ơn tất cả những sự giúp đỡ quí báu đó!

Hà Nội, ngày tháng 2 năm 2018

Học viên

Nguyễn Hoa Lan

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

HCTDNĐ/ÂĐ Hội chứng tiết dịch niệu đạo/ âm đạo

LTQĐTD Lây truyền qua đường tình dục

MIC Minimum inhibitory concentration: nồng độ ức chế

tối thiểu

PPNG Penicillinase –producingNeisseria gonorrhoeae

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2

1.1 BỆNH LẬU 2

1.1.1 Lịch sử bệnh lậu 2

1.1.2 Dịch tễ bệnh lậu 3

1.1.3 Tình hình bệnh lậu trên thế giới 3

1.1.4 Tình hình bệnh lậu ở Việt Nam 3

1.2 CÁC TRIỆU CHỨNG LÂM SÀNG BỆNH LẬU 4

1.3 ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA VI KHUẨN LẬU 7

1.3.1 Hình thái và cấu trúc 7

1.3.2 Khả năng đề kháng 8

1.3.3 Tính chất nuôi cấy 8

1.3.4 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của vi khuẩn lậu 9

1.4 XÂM NHẬP CỦA VI KHUẨN LẬU 10

1.5 CHẨN ĐOÁN VI KHUẨN LẬU TRONG PHÕNG XÉT NGHIỆM 10

1.6 TÌNH HÌNH KHÁNG KHÁNG SINH CỦA VI KHUẨN LẬU 12

1.7 CƠ CHẾ KHÁNG KHÁNG SINH CỦA VI KHUẨN LẬU 15

1.7.1 Cơ chế chung 15

1.7.2 Cơ chế kháng kháng sinh của vi khuẩn lậu 16

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 18

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

2.2.1 Mẫu nghiên cứu 18

2.2.2 Thiết kế nghiên cứu 19

2.3 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 19

2.4 CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH 21

2.4.1 Kỹ thuật lấy bệnh phẩm 21

2.4.2 Kỹ thuật nhuộm soi 22

2.4.3 Kỹ thuật nuôi cấy [16] 23

2.4.4 Các tiêu chuẩn chẩn đoán xác định vi khuẩn lậu 26

2.4.5 Kỹ thuật làm kháng sinh đồ 27

2.4.6 Kỹ thuật xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) 28

2.5 XỬ LÝ SỐ LIỆU 29

2.6 ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU 29

2.7 ĐẠO ĐỨC TRONG NGHIÊN CỨU 29

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 30

3.1 TỈ LỆ BỆNH NHÂN MẮC BỆNH LẬU TRONG TỔNG SỐ BỆNH NHÂN CÓ HCTDNĐ 30

3.1.1 Tỉ lệ bệnh nhân mắc bệnh lậu 30

3.1.2 Mô ̣t số yếu tố liên quan tới tỷ lệ nhiễm: 32

3.1.2.1 Phân bố theo giới tính 32

3.1.2.2 Phân bố theo nhóm tuổi 34

3.1.2.3 Phân bố theo nghề nghiệp 35

3.1.2.4 Phân bố theo trình độ học vấn 36

3.1.2.5 Số lượng bạn tình 37

3.1.2.6 Hành vi tìm kiếm dịch vụ y tế 38

3.1.2.7 Phân bố theo nguồn lây 40

3.1.2.8 Phân bố theo đường quan hệ tình dục 40

3.2 KẾT QUẢ ĐỀ KHÁNG KHÁNG SINH CỦA VI KHUẨN LẬU 42

KẾT LUẬN 47

KIẾN NGHỊ 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC BẢNG BIỂU, HÌNH VẼ

Bảng 1.1 Tình hình bệnh lậu trên toàn quốc từ 2012 đến 2017 4

Hình 1.1 Khuẩn lạc vi khuẩn lậu sau nuôi cấy 24 giờ 9

Hình 1.2 Thử tính chất lên men đường của Neisseria gonorrhea 9

Bảng 2.1 Các kháng sinh thuộc nhóm chính 20

Bảng 2.2 Các kháng sinh thuộc nhóm bổ sung 21

Hình 2.1 Hình ảnh vi khuẩn lậu nhuộm Gram và soi trên kính hiển vi 23

Hình 2.2 Vi khuẩn lâ ̣u trên môi trường Thayer - Martin 24

Hình 2.3 Remel BactiCard Neisseria 26

Bảng 2.3 Bảng chuẩn kháng sinh đồ 28

Bảng 3.1 Tỉ lệ bệnh nhân nhiễm lậu trên tổng số bệnh nhân HCTDNĐ 30

Hình 3.1 Tỷ lệ nhiễm vi khuẩn lậu ở bệnh nhân có hội chứng tiết dịch niệu đạo /âm đa ̣o theo tháng trong năm 30

Bảng 3.2 Phân bố bệnh nhân theo giới 32

Bảng 3.3 Kết quả phát hiện vi khuẩn lậu phân bố theo giới 33

Bảng 3.4 Phân bố bệnh nhân theo nhóm tuổi 34

Bảng 3.5 Kết quả phát hiện vi khuẩn lậu phân bố theo nhóm tuổi 34

Bảng 3.6 Kết quả phát hiện vi khuẩn lậu phân bố theo nghề nghiệp 35

Bảng 3.7 Kết quả phát hiện vi khuẩn lậu phân bố theo trình độ học vấn 36

Bảng 3.8 Kết quả phát hiện vi khuẩn lậu phân bố theo số lượng bạn tình 37

Bảng 3.9 Kết quả phát hiện vi khuẩn lậu phân bố theo hành vi tìm kiếm dịch vụ y tế 38

Bảng 3.10 Kết quả phát hiện vi khuẩn lậu phân bố theo nguồn lây 40

Bảng 3.11 Kết quả phát hiện vi khuẩn lậu phân bố đường quan hệ tình dục 40

Nhận xét bảng 3.11 40

Bảng 3.12 Sự đề kháng với các kháng sinh nhóm chính 42

Bảng 3.13 Sự đề kháng với các kháng sinh nhóm bổ sung 45

Bảng 3.14 Kết quả MIC của một số kháng sinh với vi khuẩn lậu 45

MỞ ĐẦU

Bệnh lậu là căn bệnh truyền nhiễm do vi khuẩn gây nên Đây là một trong các bệnh lây truyền qua đường tình dục (LTQĐTD) hay gặp ở Việt Nam và nhiều nước trên thế giới Bệnh lậu tuy không gây tử vong nhưng nếu không được điều trị kịp thời sẽ gây ra hậu quả nặng nề như viêm cổ tử cung, viêm phần phụ, viêm tiểu khung… có thể dẫn đến vô sinh

Bệnh lậu được điều trị bằng kháng sinh nhưng có nhiều ca bệnh ở Nhật Bản

và châu Âu vi khuẩn lậu đã kháng với các liệu pháp lựa chọn hàng đầu Chính vì vậy giám sát sự kháng kháng sinh của vi khuẩn lậu là rất cần thiết vì không những giúp cho các chương trình giám sát tính kháng kháng sinh cấp Quốc gia và Quốc tế theo dõi mức độ kháng thuốc của vi khuẩn lậu, mà còn giúp bác sĩ lâm sàng xây dựng mô hình điều trị bằng kháng sinh hợp lý nhằm giảm chi phí, giảm thời gian điều trị cho bênh nhân, giảm thiểu nguồn lây cho cộng đồng

Xuất phát từ lý do trên chúng tôi tiến hành đề tài:

“Tình hình kháng kháng sinh của các chủng vi khuẩn lậu đã phân lập tại bệnh viện Da liễu Trung ương”

Với mục tiêu:

1 Xác định tỷ lệ, sự phân bố của vi khuẩn lậu ở bệnh nhân mắc hội chứng tiết dịch niệu đạo, âm đạo đến khám bệnh tại bệnh viện Da liễu Trung Ương từ tháng 1 đến tháng 10 năm 2017

2 Mô tả mức độ kháng kháng sinh của các chủng vi khuẩn lậu được phân lập tại Bệnh viện Da liễu Trung Ương

Bệnh lậu được Galen đặt tên là Gonorrheae vì ông nghĩ rằng mủ trong bệnh lậu chính là dòng tinh dịch chảy ra: gonos=seed, rhoea=flow

Năm 1879, Neisser mô tả vi khuẩn lậu là căn nguyên gây nên bệnh lậu và

đặt tên là Neisseria Gonorrhoeae

Năm 1882, Leistikow và Loeffler nuôi cấy được vi khuẩn lậu lần đầu trên môi trường nhân tạo

Năm 1885: Burmm chứng minh vai trò gây bê ̣nh của vi khu ẩn lậu

Vào thế kỷ XX việc điều trị bệnh lậu cũng có những bước phát triển trong lịch sử Lúc đầu người ta dùng dung dịch sát khuẩn (dung dịch bạc nitrat, thuốc tím) bơm rửa niệu đạo Đến năm 1930 bắt đầu dùng các sulfamid để điều trị bệnh

Năm 1940-1944, A.Fleming tìm ra penicillin Kháng sinh này được sử dụng rộng rãi và có hiệu quả trong điều trị bệnh lậu Gần đây có nhiều loại thuốc dùng liều duy nhất và có hiệu quả cao

Năm 1962, môi trường Thayer-Martin ra đời tạo điều kiện thuận lợi chẩn

đoán bệnh lậu và tăng tỷ lệ phát hiện bệnh lậu bằng môi trường nuôi cấy

Năm 1963, Kellog và cộng sự cho rằng có những khác biệt trong độc tính của vi khuẩn lậu với những hình thái khuẩn lạc khác nhau giúp hiểu rõ cơ chế gây

1.1.2 Dịch tễ bệnh lậu

Bệnh lậu gặp ở cả 2 giới với tỷ lệ nam/nữ khoảng 1,5/1 Tuy nhiên bệnh nhân nữ thường không có triệu chứng, bệnh gặp mọi lứa tuổi, tăng cao ở lứa tuổi hoạt động tình dục mạnh và quan hệ tình dục đồng giới nam Trẻ em bị bệnh thường do lạm dụng tình dục hoặc lây từ người lớn do vệ sinh kém

Đường lây chủ yếu là người bệnh qua quan hệ tình dục hoặc lây từ mẹ sang con qua đẻ đường dưới

1.1.3 Tình hình bệnh lậu trên thế giới

Theo ước tính của WHO năm 2011, hàng năm trên thế giới có khoảng 88 triệu ca mắc bệnh lậu mới mỗi năm [58] Tại thời điểm năm 2010, mỗi năm có khoảng 900 ca tử vong do lậu gây ra [60] Tuy nhiên, tỷ lệ bệnh lậu rất khác nhau ở mỗi nước, theo thông báo của Adaskevic , đa ̣i ho ̣c Y Belarus , tỷ lệ nhi ễm

vi khuẩn lâ ̣u ở Belaru s là 18% Theo Valderpol ta ̣i Uganda thì tỷ lê ̣ nhiễm lâ ̣u là 3,4%, ở Vanuatu là 5,9%, ở Somoa là 3,4%[18]

Năm 2005 ở Anh có khoảng 196/100.000 nam giới trong độ tuổi 20-24 và 153/100.000 nữ giới tuổi từ 16-19 được chẩn đoán mắc bệnh lậu [60]

Tại Hoa Kỳ, bệnh lậu xếp thứ 2 trong số các bệnh LTQĐTD Năm 2013, Mỹ ước chừng có khoảng trên 820.000 ca mắc bệnh mới mỗi năm, tỷ lệ phụ nữ có thai nhiễm vi khuẩn lậu là 6% [55]

Ở Brazin, tỷ lệ mắc bệnh LTQĐTD ở người 20 tuổi trở lên là 13,5% Theo Radebe và cô ̣ng sự , ở Nam Phi tỷ lệ bệnh lậu chiếm 1,3 - 2,6% trên tổng số bênh LTQĐTD [11]

Ở châu Phi, tỷ lệ viêm kết mạc mắt ở trẻ sơ sinh do vi khuẩn lậu là 5-10/1000 trẻ sơ sinh sống, trong khi đó ở Mỹ tỷ lệ này là 0,1-0,16/1000 trẻ sơ sinh sống [19]

Ở Hy Lạp, trong giai đoạn 1990-1996, theo thống kê cứ 1064 người mắc bệnh LTQĐTD thì có 369 người mắc bệnh lậu, chiếm 34,6%[19]

1.1.4 Tình hình bệnh lậu ở Việt Nam

Sau ngày giải phóng miền Nam, tệ nạn xã hội gia tăng, đặc biệt số lượng gái mại dâm tăng lên đáng báo động Các bệnh LTQĐTD nói chung và bệnh lậu nói

riêng tăng lên Theo nghiên cứu của tác giả Nguyễn Thị Hải Yến (tại học viện quân

y 103 và Quân Đội 108) thống kê 10 năm từ 1987-1996 tỷ lệ mắc lậu chiếm 44,44% trên tổng số bệnh LTQĐTD vào viện điều trị [13] Theo Phạm Văn Hiển trong giai đoạn 1995-1998, lậu cấp chiếm 54,47%-70,22% trong tổng số các bệnh LTQĐTD [7] Theo trung tâm chỉ đa ̣o tuyến Bê ̣nh viê ̣n Da liễu , kết quả thống kê trong 5 năm

từ 2011-2016 cho thấy tình hình mắc bệnh lậu trên toàn quốc như sau như sau :

Bảng 1.1 Tình hình bệnh lậu trên toàn quốc từ 2012 đến 2017

Một nghiên cứu khác tại 5 tỉnh Hà nội, Hải Phòng, Quảng Ninh, Đà Nẵng và thành phố Hồ Chí Minh năm 2003 cho thấy tỷ lệ nhiễm bệnh LTQĐTD do lậu là 1,6% [9]

1.2 CÁC TRIỆU CHỨNG LÂM SÀNG BỆNH LẬU

Các triệu chứng lâm sàng, tiến triển và biến chứng của VNĐ do lậu ở nam

và nữ rất khác nhau Biểu hiện bệnh ở nam giới thường khá rõ ràng, rầm rộ còn ở

nữ giới thường kín đáo, triệu chứng không rõ hoặc không có triệu chứng

Bệnh lậu ở nam giới

Lậu cấp: Thời gian ủ bệnh từ 1-14 ngày nhưng có khi lên tới 30 ngày

Trung bình là 2-5 ngày Xuất hiện đái buốt, thậm chí rất đau khiến bệnh nhân

sợ đi đái Ra mủ ở đầu miệng sáo, mủ vàng, xanh hoặc trắng số lượng thường nhiều

Khám miệng sáo thấy đỏ, phù nề Có thể sưng đau mào tinh hoàn, tinh hoàn

Toàn thân có thể sốt, mệt mỏi

Lậu mạn: thường do lậu cấp không được điều trị hoặc điều trị không

đúng Biểu hiện lâm sang khó nhận biết: bệnh nhân cảm giác nóng rát dọc niệu đạo, đái dắt, hoặc có giọt mủ buổi sáng, có thể có biến chứng như viêm tinh hoàn, túi tinh, tiền liệt tuyến

Một số trường hợp triệu chứng không điển hình: ra dịch niệu đạo không nhiều, màu trắng trong hoặc không có triệu chứng nhưng vẫn có khả năng lây bệnh cho cộng đồng [17]

Bệnh lậu ở nữ giới

Triệu chứng thường kín đáo, khó phát hiện Thời gian ủ bệnh khoảng 10 ngày sau đó biểu hiện: khí hư nhiều, tiểu khó, ra máu giữa kỳ kinh, rong kinh

Khám thấy: cổ tử cung ra mủ hoặc mủ nhầy, đỏ phù nề vùng ngoài cổ tử

cung và khi chạm vào dễ chảy máu Mủ ở lỗ niệu đạo, tuyến Bartholin, tuyến Skène

Bệnh nhân có thể có đơn độc một triệu chứng hoặc có nhiều triệu chứng Các triệu chứng có thể rất nhẹ hoặc rầm rộ [17]

Bệnh lậu ở trẻ nhỏ

Viêm âm hộ do lậu ở trẻ em gái: do bị lạm dụng tình dục, hoặc dùng chung

khăn, chậu bị nhiễm lậu để vệ sinh bộ phận sinh dục Biểu hiện: Âm hộ viêm đỏ, có

mủ vàng hoặc xanh kèm theo đái buốt

Lậu mắt ở trẻ sơ sinh: bệnh xuất hiện sau khi sinh 1-3 ngày Bệnh ở một

hoặc hai bên mắt, với biểu hiện mắt sưng nề không mở ra được Có rất nhiều mủ từ

mắt chảy ra hoặc ấn vào mắt thấy có mủ chảy ra Kết mạc, giác mạc viêm đỏ có thể loét [17]

Bệnh lậu ngoài vùng sinh dục

Nhiễm trùng hậu môn trực tràng do lậu: hay gặp ở phụ nữ có quan hệ đường hậu môn hoặc người quan hệ đồng giới nam Xuất hiện ngứa hậu môn, chảy dịch

mủ nhầy ở hậu môn Có thể có chảy máu trực tràng, đi ngoài ra mủ hoặc chất nhày Khám thấy hậu môn đỏ, có mủ nhầy, phù nề, niêm mạc dễ chảy máu

Nhiễm trùng hầu họng: gặp trong những trường hợp quan hệ tình dục miệng sinh dục (oral sex) biểu hiện viêm hầu họng, viêm amidan cấp, có thể có sốt, sưng hạch vùng cổ

Nhiễm trùng da tiên phát do lậu: biểu hiện thường là vết loét ở sinh dục, tầng sinh môn, đùi, ngón tay

Nhiễm lậu cầu lan toả:

Bệnh thường gặp ở những người bị bệnh lậu nhưng không được điều trị, hầu hết bệnh gặp ở phụ nữ Biểu hiện của bệnh: viêm khớp, viêm gan, viêm màng não, viêm cơ tim, viêm nội mạc, viêm màng não, nhiễm vi khuẩn lậu trên da [17]

[32]

Các biến chứng bệnh lậu

Bệnh lậu nếu không được điều trị kịp thời hoặc không được điều trị đúng phác

đồ sẽ có những biến chứng nguy hiểm, có thể dẫn đến vô sinh

Ở nam giới: bệnh lậu có thể dẫn đến:

Viêm mào tinh hoàn Viêm tinh hoàn Chít hẹp niệu đạo Viêm túi tinh, viêm tiền liệt tuyến

Vô sinh

Ở nữ giới: Bệnh lậu gây viêm vòi trứng cấp, viêm tiểu khung, vô sinh, chửa ngoài dạ con, áp xe tuyến Bartholin, tuyến Skene Ở phụ nữ có thai, bệnh lậu có thể

gây sảy thai, vỡ ối sớm, đẻ non, viêm màng ối cấp, viêm kết mạc mắt ở trẻ sơ sinh, viêm hầu họng

Các biến chứng toàn thân:

Nhiễm lậu cầu toàn thân: còn gọi là viêm da khớp (hội chứng Reiter): biểu hiện đau khớp, mụn mủ, hoại tử đau trên nền da đỏ hoặc các dát sẩn, mụn mủ đơn thuần Viêm gân bao hoạt dịch ở khớp gối, khớp cổ tay, cổ chân, khớp ngón tay, ngón chân Các yếu tố thuận lợi: có thai, nhiễm lậu hầu họng

Nhiễm trùng huyết do lậu: lâm sàng thường khó xác định, nuôi cấy tỷ lệ dương tính 20-30%

Viêm màng não, viêm màng tim do lậu: ít gặp, nhưng biến chứng rất nặng nề [17]

1.3 ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA VI KHUẨN LẬU

1.3.1 Hình thái và cấu trúc

Vi khuẩn lậu có tên khoa học là Neisseria gonorrhoea do Neisser tìm ra năm

1879, thuộc lớp Betaproteobacteria, họ Neisseriacea, chi Nesseria Trong chi

Neisseria có loài gây bệnh, có loài hoại sinh, chúng khác biệt nhau về một số tính

chất sinh vật hóa học Dựa vào tính chất này phân biệt vi khuẩn lậu với Neisseria

hoại sinh khác

Trên tiêu bản bệnh phẩm lấy từ bệnh nhân bị bệnh lậu và nhuộm soi Gram thấy vi khuẩn lậu bắt màu Gram âm, hình hạt cà phê, đứng thành đôi quay mặt dẹt vào nhau, có kích thước 0,6µm x 0,8µm

Vi khuẩn lậu là vi khuẩn độc chiếm tế bào (khi ở trong bạch cầu đa nhân trung tính thì không có vi khuẩn nào khác sống trong tế bào) Vi khuẩn lậu không di động, không tạo nha bào

Trong trường hợp lậu cấp, vi khuẩn lậu đứng thành đôi trong bạch cầu đa nhân trung tính thoái hóa Lậu mạn, vi khuẩn lậu đứng chủ yếu ngoài bạch cầu và rất ít trong tế bào

Quan sát vi khuẩn lậu cắt ngang dưới kính hiển vi điện tử dẫn truyền thấy có một màng ngoài điển hình của vi khuẩn Gram âm phủ lên lớp peptidoglycan tương đối mỏng và màng tế bào chất

Vi khuẩn lậu gây bệnh ở người và lây truyền qua đường quan hệ tình dục không an toàn [9,16]

1.3.3 Tính chất nuôi cấy

Vi khuẩn lậu khó nuôi cấy, chúng đòi hỏi môi trường nhiều chất dinh dưỡng như máu, huyết thanh và các dưỡng chất khác Nhiệt độ sinh trưởng là 36-37 độ C,

độ ẩm trên 70%, khí trường CO2 từ 3 - 10%, pH 7,3 Môi trường thường được dùng

để nuôi cấy vi khuẩn lậu là môi trường Thayer - Martin có chất tăng sinh Isovitalex

là chất bao gồm nhiều acid amin kích thích sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn, kèm theo chất ức chế là V-C-N (Vancomycin, Colistin, Nystatin) để ức chế

sự phát triển của cầu khuẩn Gram dương, trực khuẩn Gram âm và nấm không ảnh hưởng đến sự phát triển vi khuẩn lậu

Sau 24h được nuôi cấy trong môi trường thích hợp khuẩn lạc sẽ mọc với đặc điểm: đường kính 0,5- 1mm, tròn lồi, bờ khuẩn lạc đều, nhày, có màu hơi xám, óng ánh như giọt sương Sau 48-72h, khuẩn lạc có thể mọc tới 3mm nhưng sau 72h nuôi cấy vi khuẩn thường tự dung giải [9,16]

Hình 1.1 Khuẩn lạc vi khuẩn lậu sau nuôi cấy 24 giờ

Có 5 dạng khuẩn lạc là T1, T2, T3, T4, T5 trong đó T1, T2 có kích thước nhỏ dạng S, vi khuẩn có pili Khuẩn lạc dạng T3, T4, T5 thường to phẳng, không có lấp lánh, không có pili

1.3.4 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của vi khuẩn lậu

- Test Oxidase: dương tính

- Test lên men đường glucose, không lên men đường: lactose, maltose và sucrose

Hình 1.2 Thử tính chất lên men đường của Neisseria gonorrhea

1.4 XÂM NHẬP CỦA VI KHUẨN LẬU

Nghiên cứu mảnh sinh thiết từ bệnh nhân bị bệnh lậu cho thấy , vi khuẩn lậu chui một phần vào trong bề mặt tế bào Cũng có thể thấy vi khuẩn lậu trong các tế bào biểu mô, đôi khi bị bao quanh bởi màng tế bào Shaw và Falkow đã sử dụng kỹ thuật nuôi cấy liên tu ̣c một tế bào ung thư biểu mô nội mạc tử cung của người để

nghiên cứu những biến cố ảnh hưởng tới sự xâm nhập của vi khuẩn lậu trên in vitro

và thấy rằng, sự xâm nhập tăng lên khi vi khuẩn lậu được nuôi cấy trong môi trường

có bổ sung sắt [38] Nghiên cứu trên ống dẫn trứng của người trong nuôi cấy nội tạng đã góp phần đáng kể vào việc tìm hiểu cơ chế của sự bán dính và xâm nhập Vi khuẩn lậu bám dính chọn lọc vào tế bào tiết nhày không có nhung mao của ống dẫn trứng và dần dần được nhấn chìm vào tế bào biểu mô biểu mô theo cơ chế ẩm bào

Vi khuẩn lậu nhân lên và phân chia trong tế bào , mặc dù chúng không xâm nhập giữa các tế bào [32] Cuối cùng, một số vi khuẩn lậu đi ra từ bề mặt đáy của tế bào nhờ một quá trình gọi là xuất bào ra khỏi tế bào Khi đã ở trong tế bào biểu mô, vi khuẩn lậu không bị tấn công của kháng thể, bổ thể, bạch cầu trung tính; khả năng sống sót ở một mức độ nhất định trong tế bào biểu mô cho thấy có thể xem chúng như những “ký sinh nội bào tùy ý”

1.5 CHẨN ĐOÁN VI KHUẨN LẬU TRONG PHÒNG XÉT NGHIỆM

Chủ yếu dựa vào phương pháp xét nghiệm nhuộm soi và nuôi cấy tìm vi khuẩn lậu

Phương pháp nhuộm soi

Lấy mủ hoặc dịch tiết của bệnh nhân, dàn tiêu bản, nhuộm Gram, để khô, soi kính hiển vi và nhận định kết quả

Ưu điểm: dễ làm, đọc kết quả nhanh sau 15-20 phút, không cần trang thiết bị đắt

tiền

Nhược điểm: dễ nhầm với các loài thuộc họ Neisseriacea khác, độ nhạy và độ

đặc hiệu thấp, với trường hợp lậu biến chứng hoặc lậu ngoài đường sinh dục ít có giá trị

Ứng dụng: là kỹ thuật áp dụng rộng rãi cho tuyến cơ sở, nới không có điều kiện

nuôi cấy và các kỹ thuật hiện đại khác [9]

Phương pháp nuôi cấy

Lấy mủ hoặc dịch tiết của bệnh nhân, cấy trên mội trường thạch Thayer – Martin ở nhiệt

độ 36-37 độ C, độ ẩm trên 70%, khí trường CO2 từ 3 - 10%, để 18-24 giờ

Ưu điển: kết quả chính xác, là một trong những tiêu chuẩn chẩn đoán xác định

bệnh lậu, cho biết sự kháng kháng sinh của vi khuẩn lậu , từ đó giúp bác sĩ lâm sàng trong quá trình điều trị, mặt khác góp phần đắc lực giám sát kháng kháng sinh của chủng vi khuẩn lậu

Nhược điển: kết quá chậm, yêu cầu kỹ thuật viên có trình độ kỹ thuật cao, sinh

phẩm, hóa chất trang thiết bị đắt tiền

Ứng dụng: áp dụng ở các tuyến trung ương [9]

Phương pháp huyết thanh

Các xét nghiệm huyết thanh được triển khai để phát hiện kháng thể kháng

Neisseria gonorrhoeae hoặc các thành phần của nó thông qua phản ứng kết hợp bổ

thể

Ưu điểm: thực hiện một lúc số lượng lớn các xét nghiệm, kết quả nhanh

Nhược điểm: cần nhiều thiết bị và sinh phẩm đắt tiền, tốn kém cho bệnh nhân

độ nhạy và độ đặc hiệu không cao

Ứng dụng: ít dùng trong thực tế, thường áp dụng trong nghiên cứu [9]

Phương pháp sinh học phân tử

Thường là phản ứng PCR dựa vào nguyên lý sao chép DNA trong tế bào

Phản ứng khuếch đại chuỗi (PCR) Nguyên lý của phản ứng PCR hoàn toàn dựa vào sự sao chép của DNA trong tế bào, trong đó DNA được nhân lên theo cơ chế bán bảo tồn từ một phân tử DNA chuỗi kép ban đầu, chúng được tách ra thành hai chuỗi đơn, một chuỗi đơn này làm khuôn mẫu cho việc tổng hợp sợi DNA mới Kỹ thuật này thược hiện với cặp mồi đặc hiệu có khả năng bắt cặp bổ xung vào hai đầu của hai sợi DNA Mỗi chu kỳ gồm 3 gai đoạn:

+ Giai đoạn biến tính: ở nhiệt độ 94-95ºC, đoạn DNA duỗi xoắn và tách hoàn toàn thành 2 sợi đơn

+ Giai đoạn gắn mỗi: nhiệt độ hạ 50-65ºC, các nucleotide trên mỗi đoạn mồi xuôi và ngƣợc sẽ gắn theo nguyên tắc bổ xung với nucleotide ở hai đoạn đầu của đoạn gen cần tổng hợp

+ Giai đoạn kéo dài mồi: thực hiện ở 72ºC

Ưu điểm: thực hiện đƣợc số lƣợng lớn xét nghiệm cùng lúc, kết quả nhanh,

chính xác, độ nhạy cao, độ đặc hiệu cao

Nhược điểm: kỹ thuật viên phải có trình độ cao, chi phí cao, không giám sát

đƣợc kháng kháng sinh của vi khuẩn lậu

Ứng dụng: trong các labo chẩn đoán tuyến tỉnh và trung ƣơng [11]

1.6 TÌNH HÌNH KHÁNG KHÁNG SINH CỦA VI KHUẨN LẬU

Trên thế giới

Theo WHO, năm 2011 có khoảng 88 triệu ca mắc bệnh lậu trong tổng số 448 triệu các nhiễm trùng LTQĐTD Vi khuẩn lậu có lịch sử kháng kháng sinh trong nhiều năm đối với penicillin, sulfonamide, tetracylin và gần đây là quinolon và macrolid (gồm cả azithromycin) Việc giảm nhạy cảm với kháng sinh và kháng lại kháng sinh cephalosporin thế hệ đầu là một vấn đề lớn trong điều trị vi khuẩn lậu Tại Thƣợng Hải, một nghiên cứu trên 384 bệnh nhân mắc bệnh lậu trong giai đoạn 2004 – 2005 và 2008 – 2009 cho thấy tỷ lệ kháng lại ciprofloxacin là 98% [43]

Nghiên cứu của Olsen (2005) ở Thuỵ Điển thấy khi phân lập 180 chủng thì 100% các chủng nhạy cảm với ceftriaxone và spectinomycin; kháng azithromycin 2%, ciprofloxacin 50% và ampicillin 75% [35]

Azithromycin là một Macrolid mới xuất hiện, tuy nhiên tỉ lệ vi khuẩn lậu kháng lại kháng sinh này đang ngày càng tăng cao Năm 2001 ở Brazil đã báo báo

có 23/81 chủng vi khuẩn lậu giảm tính nhạy cảm với azithromycin, tất cả các chủng này đều còn nhạy cảm với ceftriaxon và spectinomycin [26] Năm 2003 ở Cuba có

43 chủng vi khuẩn lậu giảm tính nhạy cảm với azithromycin [39] Đến năm 2011 ở Anh và Pháp đã xuất hiện chủng kháng lại azithromycin với tỉ lệ cao [23,28]

Cứ mỗi lần một kháng sinh mới được đưa vào điều trị vi khuẩn lậu lại nhanh chóng phát triển khả năng kháng thuốc và phát triển rộng chủng kháng thuốc trên phạm vi toàn cầu chỉ sau 10 - 20 năm Vi khuẩn lậu tận dụng mọi cơ chế kháng lại kháng sinh như bất hoạt thuốc, thay đổi mục tiêu tác động của thuốc, tăng cường đào thải và giảm hấp thu thuốc

Trong những thập kỷ gần đây các chủng vi khuẩn lậu đã giảm nhạy cảm với kháng sinh cefixim và kháng đa kháng sinh ở Nhật Bản và lây lan sang các nước khác Năm 2001 Nhật Bản báo cáo 1 trường hợp sống ở Hawai đã điều trị VNĐ do lậu bằng Cefixim 400mg liều duy nhất bị thất bại Đến năm 2002 tiếp tục có 4 trường hợp được báo cáo điều trị VNĐ do lậu bằng Cefixime không khỏi Nhật bản

đã khuyến cáo nên sử dụng ceftriaxone hoặc spectinomycin như điều trị chính cho bệnh lậu thay vì cephalosporin uống [53] Năm 2009 Nhật Bản bắt đầu xuất hiện chủng vi khuẩn lậu ở họng kháng lại ceftriaxone [31] Năm 2010 VNĐ do lậu điều trị thất bại bằng cefixime đã được báo cáo ở Na Uy [45], sau đó là ở Öc, Anh, Pháp [28,47,22] Điều trị lậu ở hầu họng bằng ceftriaxone thất bại lan rộng sang Öc, Thụy Điển, Slovenia [42,46,50]

Một nghiên cứu từ năm 2011 – 2013 ở Hàn Quốc đã chỉ ra vi khuẩn lậu kháng lại nhiều loại kháng sinh mới như cefixime, azithromycin, cefpodoxim với tỷ lệ tương ứng 3%, 5%, 8% Tuy nhiên tất cả các trường hợp phân lập được đều còn nhậy cảm với Spectinomycin [34] Tương tự ở Ba Lan và Trung Quốc báo cáo đến năm 2013 chưa có trường hợp nào kháng lại Spectinomycin [26,27,33]

Các chủng lậu kháng lại cefixime đã lây lan khắp thế giới và đây sẽ là một thách thức nghiêm trọng về y tế công cộng làm tăng tỷ lệ mắc bệnh và biến chứng nguy hiểm gây ra bởi vi khuẩn lậu không thể điều trị [21,36,48]

Theo chương trình giám sát vi khuẩn lậu ở châu Âu, 17 quốc gia thành viên của EU năm 2009 cho thấy 5% mẫu phân lập giảm nhạy cảm với cefixime, 65% kháng lại ciprofloxacin và 13% kháng lại azithromycin [25]

Tại Việt Nam

Các bệnh LTQĐTD ngày càng phổ biến ở Việt Nam trong đó có bệnh lậu Tuy nhiên, bệnh nhân thường giấu bệnh hoặc tự ra hiệu thuốc mua thuốc về uống hoặc chữa bệnh ở các phòng khám tư nhân không chuyên khoa dẫn đến việc điều trị không đúng thuốc, không đủ liều càng làm gia tăng tỷ lệ kháng lại kháng sinh của vi khuẩn lậu

Ở Việt Nam, đã có nhiều công trình nghiên cứu về độ nhạy cảm của vi khuẩn lậu với kháng sinh

Theo nghiên cứu của Lê Thị Phương và cộng sự tại viện Da Liễu Quốc Gia :

- Năm 2003, tỷ lệ kháng ciprofloxacin 60,87%, penicillin là 27.39%; tetracycline 23%; erythromycin 13,48%; spectinomycin 3,93%

- Năm 2005, tỷ lệ kháng ciprofloxacin 59,62%, tetracycline 40,50%; erythromycin 2,06%; ciprofloxacin 35,60%

- Năm 2006, tỷ lệ kháng penicillin là 31,1%; ciprofloxacin là 56,6%; tetracycline 16,5% erythromycin là 3,8%; giảm nhạy cảm với azithromycin 1,9%

và cefotaxime 0,9%

Nghiên cứu của tác giả Lê Hồng Hinh nghiên cứu tại Hà Nội trong 3 năm

2001, 2002, 2003 với 80 chủng vi khuẩn lậu cho thấy tỷ lệ kháng các kháng sinh Penicillin, Ciprofloxacin, Tetracycline còn cao, cụ thể lần lượt như sau [9]:

Không có trường hợp nào kháng lại Ceftriaxone

Theo tác giả Lê Văn Hưng nghiên cứu tại Viện Da liễu Trung Ương trong 3 năm 2005, 2006, 2007 tỷ lệ vi khuẩn lậu kháng lại các kháng sinh penicillin,

chủng kháng lại azithromycin với tỷ lệ 5,6% (2005), 1,9% (2006), 0,8% (2007) và kháng lại cefotaxime với tỷ lệ 1,2% (2005), 0,9% (2006), 3,1% (2007) Và không

có trường hợp nào kháng lại spectinomycin và ceftriaxone [11]

1.7 CƠ CHẾ KHÁNG KHÁNG SINH CỦA VI KHUẨN LẬU

1.7.1 Cơ chế chung

- Sinh ra các enzyme như β-lactamase làm mất tác dụng của thuốc

- Thay đổi đích tác dụng của kháng sinh làm cho thuốc không có điểm đến

+ Kháng qua trung gian plasmid: xảy ra ở nhiều chủng vi khuẩn, đặc biệt là trực khuẩn Gram âm, kháng với nhiều loại thuốc, có khả năng lây truyền từ vi khuẩn này sang vi khuẩn khác bằng hình thức tiếp hợp

Các plasmid kháng thuốc là các phân tử DNA ngoài nhiễm sắc thể mang gen

mã hóa enzyme làm bất hoạt kháng sinh và thay đổi hệ thống vận chuyển qua màng

tế bào có thể sao chép độc lập với nhiễm sắc thể của vi khuẩn trên tế bào, có thể chứa nhiều sao chép không chỉ cho tế bào cùng loài mà còn khác loại khác chủng

+ Kháng qua trung gian transposon: transposon là một đoạn gen được truyền trong nội tại DNA hoặc giữa các DNA như các plasmid, nhiễm sắc thể của vi khuẩn

- Đề kháng không trên cơ sở của gen kháng thuốc: làm cho kháng sinh không

ức chế hoặc không giết chết được vi khuẩn

- Vi khuẩn nằm trong ổ áp xe mà thuốc không thấm vào được, khi đó cần phải dẫn lưu ổ áp xe

- Vi khuẩn ở trạng thái nghỉ do đó không nhạy cảm với các kháng sinh ức chế tổng hợp thành tế bào vi khuẩn như penicillin và cephalossporin

- Trong một số trường hợp đặc biệt, vi khuẩn trút bỏ thành tế bào mà vẫn sống được như một thể nguyên sinh khi đó nó cũng không nhạy cảm với các thuốc tác động lên thành tế bào, đến lúc nào đó nó tái tổng hợp lại vách tế bào thì nó lại nhạy cảm với thuốc [6,9]

1.7.2 Cơ chế kháng kháng sinh của vi khuẩn lậu

- Penicillin và cephalosporin: vi khuẩn sinh ra men β-tactamase bao gồm penicillinase và cephalosporinase có khả năng thủy phân các kháng sinh nhóm penicillin và cephalosporin

Vi khuẩn lậu để kháng penicillin do chúng làm giảm tác dụng của phức hợp giữa penicillin và protein (PBP) làm tăng gắn kháng sinh vào PBP do đó làm giảm tính thấm của kháng sinh qua màng tế bào vi khuẩn

Với cephalosporin: vi khuẩn lậu làm biến đổi enzzyme thay đổi tính thấm của màng tế bào vi khuẩn lậu với kháng sinh và đồng thời cũng làm giảm hoạt tính của protein gắn kháng sinh

- Aminoglucosid có 3 cơ chế kháng:

+ Biến đổi thuốc bằng quá trình phosphoryl hóa, adenyl hóa đƣợc mã hóa bởi plasmid và acetyl hóa các enzyme làm thay đổi thuốc

+ Đột biến nhiễm sắc thể

+ Giảm tính thấm của thành tế bào vi khuẩn đối với thuốc

- Tetracycline: giảm khả năng tiếp nhận thuốc vào vi khuẩn hoặc tăng khả năng loại thải thuốc ra khỏi vi khuẩn làm giảm nồng độ thuốc trong tế bào vi khuẩn,

do đó vi khuẩn kháng lại thuốc

- Cloramphenicol: vi khuẩn sinh ra enzyme acetyl transferase đƣợc mã hóa

ở plasmid làm acetyl hóa thuốc từ đó làm bất hoạt thuốc

- Erythromycin: vi khuẩn sinh ra enzyme đƣợc mã hóa ở plasmid có tác dụng metyl hóa 23 – s – RNA, ngăn chặn hiện tƣợng gắn thuốc vào vi khuẩn

- Sulfonamid có 2 cơ chế nhƣ sau:

+ Hệ thống vận chuyển đƣợc mã hóa ở plasmid gây ra chủ động đẩy thuốc ra khỏi tế bào

+ Đột biến nhiễm sắc thể ở gen mã hóa các enzyme đích tác dụng làm giảm

áp lực gắn thuốc vào vi khuẩn

- Quinolon : vi khuẩn kháng thuốc là do đột biến làm thay đổi DNA gynase của vi khuẩn, kháng thuốc cũng có thể do thay đổi protein màng ngoài của vi khuẩn làm giảm thu nhận thuốc trong vi khuẩn [6,9]

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

Là 1788 bệnh nhân được chẩn đoán mắc hội chứng tiết dịch niệu đạo/ âm đạo tại Bệnh viện Da liễu Trung ương từ tháng 1/2017 đến tháng 10/2017

Tiêu chuẩn chọn bệnh nhân:

- Bệnh nhân có hội chứng tiết dịch niệu đạo

- Bệnh nhân đồng ý tham gia nghiên cứu

Tiêu chuẩn loại trừ:

- Bệnh nhân đang dùng thuốc ( trong vòng 5-7 ngày trước)

- Bệnh nhân bị bệnh AIDS

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Mẫu nghiên cứu

Nghiên cứu được thực hiện trên tất cả những bệnh nhân có hội chứng tiết dịch niệu đạo, âm đạo đến khám tại Bệnh viện Da liễu Trung ương từ tháng 1/2017 đến tháng 10/2017

Cỡ mẫu dùng cho nghiên cứu được tính theo công thức:

Trong đó:

n: là cỡ mẫu cần điều tra

Z: hê ̣ số tin câ ̣y [ = ]

p: tỉ lệ phân lập vi khuẩn dương tính là 6% ( căn cứu vào kết quả phân lập vi khuẩn của phòng xét nghiệm Bệnh viện Da liễu Trung ương)

d = 5%

Theo công thức này n= 82 nhưng trên thực tế chúng tôi nghiên cứu 140 bệnh nhân

2.2.2 Thiết kế nghiên cứu

Đánh giá tỷ lệ kháng các loa ̣i kháng sinh ở vi khuẩn lậu Xác định tỷ lệ nhiễm

- Các giá đựng ống nghiệm

- Thước đo đường kính vòng vô khuẩn trong làm kháng sinh đồ

- Tủ nuôi cấy: điều chỉnh được nống độ CO2 của hãng Sannyo

- Môi trường phân lập vi khuẩn Thayer – Martin

+ Thạch GC chứa 10% hemoglobin powder

+ Chất tăng sinh ( Isovitalex) thành phần bao gồm:

Diphosphopyridin nucleotid (coenzym) Carboxylase

p Aminobenzoic acid Thiamin – HCl

Vitamin B12

L – Glutamin

L – cystin – 2HCL

L – cystin – HCL – 2H2O Adenine

+ Test enzyme Remel BactiCard Neisseria

+ Các khoanh giấy kháng sinh

+ Các thanh giấy E-test dùng để xác định nồng độ ức chế tối thiểu của kháng sinh đối với vi khuẩn lậu

+ Chủng vi khuẩn lậu: Neisseria gonorrhoeae ATCC49226

Bảng 2.1 Các kháng sinh thuộc nhóm chính Tên kháng sinh Kí hiệu

Lượng kháng sinh/ khoanh

Hãng SX

Bảng 2.2 Các kháng sinh thuộc nhóm bổ sung

Tên kháng sinh Kí hiệu Lượng kháng sinh/ khoanh

µg

Hãng SX

2.4 CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

2.4.1 Kỹ thuật lấy bệnh phẩm

Ở nữ giới

+ Cổ tử cung: làm ẩm mỏ vịt bằng nước cất vô trùng đặt mỏ vịt làm bộc lộ

cổ tử cung, dùng tăm bông vô trùng đưa sâu vào trong cổ tử cung 2 – 3 cm, để 5 -10

giây cho dịch thấm vào tăm bông dàn mỏng trên tiêu bản

+ 2 bên tuyến Skène

+ 2 bên tuyến Bartholin

+ Niệu đạo: dùng que cấy hoặc tăm bông vô trùng loại nhỏ đưa vào niệu đạo

khoảng 1,5 đến 2 cm rồi xoay nhẹ tăm bông, để khoảng 5-10 giây rồi rút tăm bông

nhẹ nhàng và dàn mỏng bệnh phẩm lên tiêu bản

Ở nam giới

+ Lậu cấp tính: bệnh nhân nhịn tiểu 2-3 giờ trước khi lấy bệnh phẩm , hướng

dẫn bệnh nhân để lộ bộ phận sinh dục, lau bỏ phần mủ ngoài trước khi lấy bệnh

phẩm, dùng tăm bông thấm nước muối sinh lý 0,9% đưa sâu vào niệu đạo 1,5- 2

cm, xoay tròn để tăm bông 5-10 giây cho dịch thấm vào tăm bông rồi rút nhẹ tăm

bông, dàn mỏng trên tiêu bản

+ Lậu mạn tính: nhất thiết phải hướng dẫn bệnh nhân nhịn tiểu ít nhất 2-3

giờ trước khi thực hiện xét nghiệm Các bước tiến hành lấy bệnh phẩm tương tự lậu

Đối với phụ nữ cắt bỏ tử cung: lấy bệnh phẩm ở phần âm đạo

Đối với nữ giới chưa quan hệ tình dục: lấy bệnh phẩm âm đạo không dùng

mỏ vịt

Đối với bệnh nhân bị ở hậu môn: dùng tăm bông lau sạch hậu môn, lấy que

tăm bông đưa sâu 3 cm , dàn bệnh phẩm trên tiêu bản như bệnh phẩm ở niệu đạo

2.4.2 Kỹ thuật nhuộm soi

Sau khi phết bệnh phẩm lên lam kính, để khô tự nhiên, cố định trên ngon lửa đèn cồn với sức nóng vừa phải Su đó tiến hành nhuộm Gram

Nhuộm Gram:

+ Phủ tiêu bản bằng dung dịch tím Gentian trong thời gian 60 giây

+ Rửa dưới vòi nước chảy nhẹ

+ Phủ tiêu bản bằng dung dịch Lugol để thời gian 60 giây

Nhận định kết quả: quan sát dưới kính hiển vi ta thấy vi khuẩn có hình hạt cà

phê, đứng thành cặp, 2 mặt dẹp úp vào nhau, bắt màu Gram âm nằm trong hoặc ngoài bạch cầu đa nhân trung tính thoái hóa, hướng tới vi khuẩn lậu

Hình 2.1 Hình ảnh vi khuẩn lậu nhuộm Gram và soi trên kính hiển vi

2.4.3 Kỹ thuật nuôi cấy [16]

- Kỹ thuật nuôi cấy: lấy bệnh phẩm như với kỹ thuật nhuộm soi trực tiếp Bệnh

phẩm được ria trên môi trường Thayer - Martin bằng những đường zich zắc hoặc

kỹ thuật cấy phân vùng Để đĩa thạch cấy vào tử ấm nhiệt độ 36- 37ºC, khí trường

CO2 từ 3- 10%, độ ẩm trên 70% Sau 18-24 giờ quan sát khuẩn lạc Nếu chưa thấy

vi khuẩn mọc để thêm 24 giờ nữa

Hình 2.2 Vi khuẩn lâ ̣u trên môi trường Thayer - Martin

- Test oxydase:

+ Thử trên dải giấy thấm Whatman: dùng đầu pepette pasteur uốn cong trên ngọn lửa đèn cồn, lấy khuẩn lạc nghi ngờ phết lên dải giấy thấm Whatman No1 kích thước 2,5x0,5 cm đã được làm ẩm bằng 2-3 giọt thuốc thử tetramethyl p – phenylendiamin hydroclord 1%

+ Test oxidase làm trực tiếp trên khuẩn lạc của đĩa thạch nuôi cấy

Phản ứng dương tính: trong vòng 5 giây khuẩn lạc từ màu đỏ chuyển sang màu tím

đậm vì có những vi khuẩn có men oxidase khi tiếp xúc thuốc thử tetramythyl - p –phenul endiamin hydroclorid 1% sự có mặt của oxy ngoài không khí sẽ chuyển màu

- Test enzyme Remel BactiCard Neisseria

Nguyên lý: sử dụng hệ thống các enzyme, để xác định các loài Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Neisseria lactamica và Moraxella catarrhalis

Vật liệu dùng để xác định gồm một thanh có 4 vòng tròn thử nghiệm, thanh giếng được tẩm các chất tạo màu với indoxyl butyrate esterase (IB), prolyl