Nghiên cứu tình hình kháng kháng sinh của các chủng vi khuẩn lậu đã phân lập tại bệnh viện da liễu trung ương

Theo ước tính của Tổ chức Y tế Thế giới WHO năm 2011 hằng năm trên toàn thế giới có khoảng 448 triệu người mới mắc các bệnh LTQĐTD trong đó người mắc bệnh lậu là 87,8 triệu người [16] Th

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI

LUẬN VĂN THẠC SĨ

NGHIÊN CứU TÌNH HÌNH KHÁNG KHÁNG SINH CủA CÁC CHủNG

VI KHUẩN LậU ĐÃ PHÂN LậP TạI BệNH VIệN

DA LIễU TRUNG ƯƠNG

VŨ TÙNG ĐIỆP

Hà Nội 2017

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI

-

LUẬN VĂN THẠC SĨ Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học

Mã ngành : 60420201 NGHIÊN CứU TÌNH HÌNH KHÁNG KHÁNG SINH CủA CÁC CHủNG

VI KHUẩN LậU ĐÃ PHÂN LậP TạI BệNH VIệN DA LIễU TRUNG

ƯƠNG

HƯỚNG DẪN KHOA HỌC : TS LÊ VĂN HƯNG HỌC VIÊN THỰC HIỆN : VŨ TÙNG ĐIỆP

Hà Nội 2017

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin chân thành cảm ơn

Ban giám hiệu, Phòng đào tạo sau đại học trường Viện đại học Mở Hà Nội đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong thời gian nghiên cứu

Tôi xin bày tỏ long kính trọng và biết ơn sâu sắc tới:

Ban giám đốc, cán bộ nhân viên Khóa Vi sinh – Nấm – Ký sinh trùng Bệnh viện Da liễu Trung ương luôn quan tâm tạo điều kiện tốt cho tôi học tập

và thực hiện luận văn này

Tiến sĩ Lê Văn Hưng, Trưởng khoa Vi sinh – Nấm – Ký sinh trùng, Phó trưởng khóa kỹ thuật Y học trường Đại học Y Hà Nội, phó trưởng Bộ môn Vi sinh – Ký sinh trùng – Lâm sang trường Đại học Y Hà Nội người thầy đã trực tiếp dạy bảo, hưỡng dẫn tôi trong suốt quá trình nghiên cứu

Cuối cùng tôi xin cảm ơn bạn bè đồng nghiệp, những người trong gia

đình đã luôn chăm lo động viên giúp tôi yên tâm học tập nghiên cứu

Hà nội, ngày 28 tháng 12 năm 2016

Tác giả

Vũ Tùng Điệp

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là đề tài nghiên cứu của tôi, tất cả các số liệu kết quả trong luận văn là trung thực và chưa từng được công bố trong đề tài nào khác

Hà nội, ngày 28 tháng 12 năm 2016

Tác giả

Vũ Tùng Điệp

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1.Bệnh lậu 3

1.1.1.Lịch sử bệnh lậu 3

1.1.2.Tình hình bệnh lậu trên thế giới 4

1.1.3.Tình hình bệnh lậu ở Việt Nam 4

1.2 Đặc điểm sinh học của vi khuẩn lậu 5

1.2.1.Hình thể và cấu trúc 5

1.2.2.Tính chất nuôi cấy 6

1.2.3.Tính chất sinh vật hóa học 7

1.2.4.Khả năng gây bệnh của vi khuẩn lậu 8

1.2.5.Chẩn đoán vi khuẩn lậu trong phòng xét nghiệm 11

1.3.Tình hình kháng kháng sinh của vi khuẩn lậu 12

1.4.Cơ chế kháng kháng sinh của vi khuẩn lậu 16

1.4.1.Cơ chế chung 16

1.4.2.Cơ chế kháng thuốc của vi khuẩn lậu 17

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

2.1.Đối tượng nghiên cứu 20

2.2 Phương pháp nghiên cứu 20

2.2.1 Mẫu nghiên cứu 20

2.2.2 Thiết kế nghiên cứu 21

2.3.Vật liệu nghiên cứu 21

2.4 Các bước tiến hành 23

2.4.1 Kỹ thuật lấy bệnh phẩm 23

2.4.2.Kỹ thuật nhuộm soi 24

2.4.3.Kỹ thuật nuôi cấy 25

2.4.4.Các tiêu chuẩn chẩn đoán xác định vi khuẩn lậu 28

2.4.5.Kỹ thuật làm kháng sinh đồ 29

2.4.6 Kỹ thuật xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) 30

2.5 Xử lý số liệu 32

2.6 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 32

2.7 Đạo đức trong nghiên cứu 32

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 33

3.1.Tỉ lệ bệnh nhân mắc bệnh lậu trong tổng số bệnh nhân có HCTDNĐ 33

3.1.1 Tỉ lệ bệnh nhân nhiễm lậu 33

3.1.2.Những yếu tố liên quan tới tỷ lệ nhiễm: 34

3.1.2.1 Phân bố theo độ tuổi 34

3.1.2.2 Phân bố theo gới tính 35

3.1.2.3 Phân bố theo nghè nghiệp 36

3.1.2.4 Phân bố theo trình độ học vấn 37

3.1.2.5 Phân bố theo địa dư 38

3.1.2.6 Phân bố theo tình trạng hôn nhân 39

3.1.2.7 Số lượng bạn tình 40

3.1.2.8 Tiền sử mắc bệnh lậu 41

3.1.2.9 Hành vi tìm kiếm dịch vụ y tế 42

3.1.2.10 Phan bố theo nguồn lây 42

3.1.2.11 Phân bố theo đường quan hệ tình dục 43

3.2.Kết quả đề kháng kháng sinh của vi khuẩn lậu 44

CHƯƠNG 4 BÀN LUẬN 47

4.1.Đặc điểm lâm sang, một số yếu tố liên quan của bệnh lậu 47

4.1.1.Tình hình bệnh lậu 47

4.1.2 Một số yếu tố liên quan của bệnh lậu 48

4.2.Mức độ kháng kháng sinh của các chủng vi khuẩn lậu 54

4.2.1.Với kháng sinh nhóm chính 54

4.2.2.Với các kháng sinh nhóm bổ sung 57

4.2.3.Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) 57

KẾT LUẬN 59

KIẾN NGHỊ 60 TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Tình hình bệnh lậu từ 2006 đến 2010 5

Bảng 2.1: Các khoanh giấy kháng sinh thuộc nhón chính 22

Bảng 2.2: Các khoanh giấy kháng sinh thuộc nhón bổ sung 23

Bảng 2.3: Bảng chuẩn kháng sinh đồ 30

Bảng 3.1: Tỉ lệ bênh nhân nhiễm lậu trên tổng số bệnh nhân HCTDNĐ 33

Bảng 3.2: Phân bố bệnh nhân theo tuổi 34

Bảng 3.3: Phân bố bệnh nhân theo nghề nghiệp (n=106) 36

Bảng 3.4: Phân bố bệnh nhân theo trình độ học vấn 37

Bảng 3.5: Phân bố theo tình trạng hôn nhân 39

Bảng 3.6 Số bạn tình của bệnh nhân 40

Bảng 3.7: Tiền sử mắc bệnh lậu 41

Bảng 3.8: Hành vi tìm kiếm dịch vụ khám chữa bệnh 42

Bảng 3.9: Phân bố bệnh nhân theo nguồn lây 42

Bảng 3.10: Phân bố bệnh nhân theo đường quan hệ tình dục 43

Bảng 3.11: Sự đề kháng với các kháng sinh nhóm chính 44

Bảng 3.12: Sự đề kháng với các kháng sinh nhóm bổ sung: 45

Bảng 3.13: Kết quả MIC của một số kháng sinh với vi khuẩn lậu 46

DANH MỤC HÌNH

Hình1.1: Khuẩn lạc vi khuẩn lậu sau nuôi cấy 24 giờ 7

Hình1.2: Thử tính chất lên men đường của Neisseria gonorrhea 7

Hình 2.1: Hình ảnh vi khuẩn lậu nhuộm Gram và soi trên kính hiển vi 25

Hình 2.2: Vi khuẩn lậu trên môi trường Thayer - Martin 26

Hình 2.3: Remel BactiCard Neisseria 28

Hình 3.1: Phân bố bệnh nhân theo thời gian 33

Hình 3.2: Phân bố bệnh nhân theo tuổi 34

Hình 3.3: Phân bố bệnh nhân theo giới tính 35

Hình 3.4: Phân bố bệnh nhân theo nghề nghiệp 36

Hình 3.5: Phân bố bệnh nhân theo trình độ học vấn 37

Hình 3.6: Phân bố bệnh nhân theo địa dư 38

Hình 3.7: Tình trạng hôn nhân của bệnh nhân nhiễm vi khuẩn lậu 39

Hình 3.8: Phân bố theo số lượng bạn tình 40

Hình 3.9: Tỷ lệ người nhiễm mới 41

Hình 3.10: Tỷ lệ kháng kháng sinh của vi khuẩn lậu với kháng sinh

nhóm chính 44

Hình 3.11: Tỷ lệ kháng kháng sinh của vi khuẩn lậu với nhóm bổ xung 45

ĐẶT VẤN ĐỀ

Bênh lậu là một trong những bênh lây truyền qua đường tình dục phổ biến hay gặp ở nước ta và nhiều nước trên thế giới Bênh không gây tử vong, nhưng điều trị không kịp thời, không đúng phác đồ sẽ để lại nhiều biến chứng

và di chứng làm ảnh hưởng đến xã hội, kinh tế, gia đình và giống nòi Tác

nhân gây bênh là song cầu khuẩn Gram âm, có tên khoa học là Neisseria

gonorrhoeae, được Neisser mô tả năm 1879, Leistikow và Loeffler nuôi cấy lần đầu trên môi trường nhân tạo năm 1882

Những năm gần đây bệnh lậu có xu hướng tăng Theo ước tính của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) năm 2011 hằng năm trên toàn thế giới có khoảng

448 triệu người mới mắc các bệnh LTQĐTD trong đó người mắc bệnh lậu là 87,8 triệu người [16]

Theo thông báo của WHO (2012): chương trình giám sát tính kháng kháng sinh của vi khuẩn lậu ở khu vực châu Á - Thái Bình Dương đã phân lập được 9.744 chủng tại 19 quốc gia và vùng lãnh thổ Tỷ lệ các chủng vi khuẩn lậu kháng kháng sinh thuộc nhóm quinolon vẫn ở mức độ cao: Trung Quốc là 89,4%, Hồng Kông 96,7%, Hàn Quốc 92,7%, Nhật Bản 72,5%, Brunei 81,7%, Philippines 96,9% [17] Ở Việt nam, theo Phạm Thị Lan năm 2011,

tỷ lệ kháng của vi khuẩn lậu với ciprofloxacin là 98%, tetracyclin là 28%[18]

Ở Việt Nam theo ước tính của Bệnh viện Da liễu Trung Ương hàng năm có khoảng 300.000 người mắc bệnh LTQĐTD, trong đó bệnh lậu chiếm 21,7% Nhưng trên thực tế con số này có thể còn lớn hơn nhiều nữa Do nhiều nguyên nhân mà phần lớn bệnh nhân tự tìm đến các phòng khám tư nhân không chuyên khoa, hoặc tự mua thuốc uống Điều này không những gây khó khăn cho việc quản lý bệnh mà còn làm gia tăng sự lan rộng và xuất hiện các biến chứng nguy hiểm của bệnh

Viêc giám sát sự kháng kháng sinh của vi khuẩn lậu là rất cần thiết vì không những giúp cho các chương trình giám sát tính kháng kháng sinh cấp Quốc gia và Quốc tế theo dõi mức độ kháng thuốc của vi khuẩn lậu, mà còn giúp bác sĩ lâm sàng xây dựng mô hình điều trị bằng kháng sinh hợp lý nhằm giảm chi phí, giảm thời gian điều trị cho bênh nhân, giảm thiểu nguồn lây cho cộng đồng

Xuất phát từ lý do trên chúng tôi tiến hành đề tài:

“Nghiên cứu tình hình kháng kháng sinh của các chủng vi khuẩn lậu đã phân lập tại bệnh viện Da liễu Trung ương”

Nhằm 2 mục tiêu:

1 Xác định tỷ lệ nhiễm vi khuẩn lậu trên bệnh nhân mắc hội chứng tiết dịch niệu đạo, âm đạo đến khám bệnh tại bệnh viện Da liễu Trung ương từ ngày 1/3/2016 đến ngày 30/12/2016

2 Đánh giá mức độ đề kháng kháng sinh của các chủng vi khuẩn lậu đã phân lập tại Bệnh viện Da liễu Trung ương

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1.Bệnh lậu

1.1.1.Lịch sử bệnh lậu

Bệnh lậu được người Ai Cập cổ đại mô tả từ năm 1550 trước công nguyên Vào thế kỷ XIII, bệnh được biết đến là bệnh lây do quan hệ tình dục với người bị bệnh lậu

Vào thế kỷ IV-V tước công nguyên Hippocrates đã viết rất nhiều về bệnh lậu, gọi lậu cấp là “chứng đái són đau” và mô tả: “ đây là bệnh của những người ăn chơi trác táng, chìm đắm trong lạc thú của thần vệ nữ” Ông cũng đề cập tới các cách khác nhau để điều trị bệnh lậu gồm kiêng quan hệ tình dục với người mắc bệnh

Bệnh lậu được Galen đặt tên là Gonorrheae vì ông nghĩ rằng mủ trong bệnh lậu chính là dòng tinh dịch chảy ra: gonos=seed, rhoea=flow

Năm 1879: Neisser mô tả vi khuẩn lậu là căn nguyên gây nên bệnh lậu

Năm 1882: Leistikow và Loeffler nuôi cấy được vi khuẩn lậu lần đầu

tiên trên môi trường nhân tạo

Việc điều trị bệnh lậu cũng có những bước phát triển trong lịch sử Lúc đầu người ta dùng dung dịch sát khuẩn (dung dịch bạc nitrat, thuốc tím) bơm

rửa niệu đạo Đến năm 1930 bắt đầu dùng các sulfamid để điều trị bệnh

Năm 1940-1944, A.Fleming tìm ra penicillin Kháng sinh này được sử dụng rộng rãi và có hiệu quả trong điều trị bệnh lậu Gần đây có nhiều loại

thuốc dùng liều duy nhất và có hiệu quả cao

Năm 1962, môi trường Thayer-Martin ra đời tạo điều kiện thuận lợi

chẩn đoán bệnh lậu và tăng tỷ lệ phát hiện bệnh lậu bằng môi trường nuôi cấy

Năm 1963, Kellog và cộng sự cho rằng có những khác biệt trong độc tính của vi khuẩn lậu với những hình thái khuẩn lạc khác nhau giúp hiểu rõ cơ

chế gây bệnh của vi khuẩn lậu

1.1.2.Tình hình bệnh lậu trên thế giới

Theo ước tính của WHO năm 2011, hàng năm trên thế giới có khoảng 88 triệu ca mắc bệnh lậu mới mỗi năm [16].Tuy nhiên, tỷ lệ bệnh lậu rất khác nhau ở mỗi nước

Năm 2005 ở Anh có khoảng 196/100.000 nam giới trong độ tuổi 20-24

và 153/100.000 nữ giới tuổi từ 16-19 được chẩn đoán mắc bệnh lậu

Tại Hoa Kỳ, bệnh lậu xếp thứ 2 trong số các bệnh LTQĐTD Năm

2013, Mỹ ước chừng có khoảng trên 820.000 ca mắc bệnh mới mỗi năm, tỷ lệ phụ nữ có thai nhiễm vi khuẩn lậu là 6% [19]

Ở Brazin, tỷ lệ mắc bệnh LTQĐTD ở người 20 tuổi trở lên là 13,5%

Ở Hy Lạp, trong giai đoạn 1990-1996, theo thống kê cứ 1064 người mắc bệnh LTQĐTD thì có 369 người mắc bệnh lậu, chiếm 34,6%

Ở châu Phi, tỷ lệ viêm kết mạc mắt ở trẻ sơ sinh do vi khuẩn lậu là 10/1000 trẻ sơ sinh sống, trong khi đó ở Mỹ tỷ lệ này là 0,1-0,16/1000 trẻ sơ sinh sống

5-Theo Radebe và cộng sự , ở Nam Phi tỷ lệ bệnh lậu chiếm 1,3-2,6% trên số ca bệnh LTQĐTD

1.1.3.Tình hình bệnh lậu ở Việt Nam

Sau ngày giải phóng miền Nam, tệ nạn xã hội gia tăng, đặc biệt số lượng gái mại dâm tăng lên đáng báo động Các bệnh LTQĐTD nói chung và bệnh lậu nói riêng tăng lên Theo Phạm Văn Hiển trong giai đoạn 1995-1998, lậu cấp chiếm 54,47% - 70,22% trong tổng số các bệnh LTQĐTD [2] Theo Nguyễn Hữu Sáu, kết quả thống kê của phòng khám Bệnh viện da liễu Trung Ương trong 5 năm từ 2006-2010 cho thấy tình hình mắc bệnh lậu như sau [1]:

Một nghiên cứu khác tại 5 tỉnh Hà nội, Hải Phòng, Quảng Ninh, Đà Nẵng và thành phố Hồ Chí Minh năm 2003 cho thấy tỷ lệ nhiễm bệnh LTQĐTD do lậu là 1,6%

1.2 Đặc điểm sinh học của vi khuẩn lậu

1.2.1.Hình thể và cấu trúc

Lậu cầu khuẩn có tên khoa học là Neisseria gonorrhoea do Neisser tìm

ra năm 1879, thuộc lớp Betaproteobacteria, họ Neisseriacea, chi Nesseria Trong chi Neisseria có loài gây bệnh, có loài hoại sinh, chúng khác biệt nhau

về một số tính chất sinh vật hóa học Dựa vào tính chất này phân biệt vi khuẩn

lậu với Neisseria hoại sinh khác

Trên tiêu bản bệnh phẩm lấy từ bệnh nhân bị bệnh lậu và nhuộm soi Gram thấy vi khuẩn lậu bắt màu Gram âm, hình hạt cà phê, có trục dài song song nhau, đứng thành đôi quay mặt dẹt vào nhau, có kích thước 0,6µm x 0,8µm

Vi khuẩn lậu là vi khuẩn độc chiếm tế bào (khi ở trong bạch cầu đa nhân trung tính thì không có vi khuẩn nào khác sống trong tế bào) Vi khuẩn lậu không di động, không tạo nha bào

Trong trường hợp lậu cấp, vi khuẩn lậu đứng thành đôi trong bạch cầu đa nhân trung tính thoái hóa Lậu mạn, vi khuẩn lậu đứng chủ yếu ngoài bạch cầu và rất ít trong tế bào

Quan sát vi khuẩn lậu cắt ngang dưới kính hiển vi điện tử dẫn truyền thấy có một màng ngoài điển hình của vi khuẩn Gram âm phủ lên lớp peptidoglycan tương đối mỏng và màng tế bào chất

Lậu cầu chỉ gây bệnh ở người và lây truyền qua đường quan hệ tình dục không an toàn

1.2.2.Tính chất nuôi cấy

Vi khuẩn lậu khó nuôi cấy, chúng đòi hỏi môi trường nhiều chất dinh dưỡng như máu, huyết thanh và các dưỡng chất khác Nhiệt độ sinh trưởng là 35-36 độ C, độ ẩm trên 70%, khí CO2 từ 3 đến 10%, pH 7,3 Các môi trường thường được dùng để nuôi cấy vi khuẩn là môi trường Thayer - Martin có chất tăng sinh Isovitalex là chất bao gồm nhiều acid amin kích thích sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn, kèm theo chất ức chế là V-C-N (Vancomycin, Colistin, Nystatin) để ức chế sự phát triển của nấm và các cầu khuẩn Gram dương, trực khuẩn Gram âm, không ảnh hưởng đến sự phát triển

vi khuẩn lậu

Sau 24h được nuôi cấy trong môi trường thích hợp khuẩn lạc sẽ mọc với đặc điểm: đường kính 0,5- 1mm, tròn lồi, bờ khuẩn lạc đều, nhày, có màu hơi xám, óng ánh như giọt sương Sau 48-72h, khuẩn lạc có thể mọc tới 3mm nhưng sau 72h nuôi cấy vi khuẩn thường tự dung giải

Hình1.1: Khuẩn lạc vi khuẩn lậu sau nuôi cấy 24 giờ

Có 5 dạng khuẩn lạc là T1, T2, T3, T4, T5 trong đó T1, T2 có kích thước nhỏ dạng S, vi khuẩn có pili Khuẩn lạc dạng T3, T4, T5 thường to phẳng, không có lấp lánh, không có pili

1.2.3.Tính chất sinh vật hóa học

- Test Oxidase: dương tính

- Test lên men đường glucose, không lên men đường: lactose, maltose và sucrose

Hình1.2: Thử tính chất lên men đường của Neisseria gonorrhea

1.2.4.Khả năng gây bệnh của vi khuẩn lậu

Cầu khuẩn lậu chỉ có vật chủ duy nhất là người Bệnh liên quan chặt chẽ với hoạt động tình dục

Bệnh lậu ở nam giới

Lậu cấp: Thời gian ủ bệnh từ 1-14 ngày nhưng có khi lên tới 30 ngày Trung bình là 2-5 ngày Xuất hiện đái buốt, thậm chí rất đau khiến bệnh nhân sợ đi đái Ra mủ ở đầu miệng sáo, mủ vàng, xanh hoặc trắng số lượng thường nhiều

Khám miệng sáo thấy đỏ, phù nề Có thể sưng đau mào tinh hoàn, tinh hoàn

Toàn thân có thể sốt, mệt mỏi

Lậu mạn: thường do lậu cấp không được điều trị hoặc điều trị không đúng Biểu hiện lâm sang khó nhận biết: bệnh nhân cảm giác nóng rát dọc niệu đạo, đái dắt, hoặc có giọt mủ buổi sáng, có thể có biến chứng như viêm tinh hoàn, túi tinh, tiền liệt tuyến

Một số trường hợp triệu chứng không điển hình: ra dịch niệu đạo không nhiều, màu trắng trong hoặc không có triệu chứng nhưng vẫn có khả năng lây bệnh cho cộng đồng

Bệnh lậu ở nữ giới

Triệu chứng thường kín đáo, khó phát hiện Thời gian ủ bệnh khoảng 10 ngày sau đó biểu hiện: khí hư nhiều, tiểu khó, ra máu giữa kỳ kinh, rong kinh

Khám thấy: Cổ tử cung ra mủ hoặc mủ nhầy, đỏ phù nề vùng ngoài cổ

tử cung và khi chạm vào dễ chảy máu Mủ ở lỗ niệu đạo, các tuyến quanh lỗ niệu đạo Có thể viêm tuyến Bartholin, tuyến Skène

Bệnh nhân có thể có đơn độc một triệu chứng hoặc có nhiều triệu chứng Các triệu chứng có thể rất nhẹ hoặc rầm rộ

Bệnh lậu ở trẻ nhỏ

Viêm âm hộ do lậu ở trẻ em gái: do bị lạm dụng tình dục, hoặc dùng chung khăn, chậu bị nhiễm lậu để vệ sinh bộ phận sinh dục Biểu hiện: Âm hộ viêm đỏ, có mủ vàng hoặc xanh kèm theo đái buốt

Lậu mắt ở trẻ sơ sinh: Bệnh xuất hiện sau đẻ 1-3 ngày Bệnh ở một hoặc hai bên mắt, với biểu hiện: mắt sưng nề không mở ra được Có rất nhiều

mủ từ mắt chảy ra hoặc ấn vào mắt thấy có mủ chảy ra Kết mạc, giác mạc viêm đỏ có thể loét

Bệnh lậu ngoài vùng sinh dục

Nhiễm trùng hậu môn trực tràng do lậu: hay gặp ở phụ nữ có quan hệ đường hậu môn hoặc người quan hệ đồng giới nam Xuất hiện ngứa hậu môn, chảy dịch mủ nhầy ở hậu môn Có thể có chảy máu trực tràng, đi ngoài ra mủ hoặc chất nhày Khám thấy hậu môn đỏ, có mủ nhầy, phù nề, niêm mạc dễ chảy máu

Nhiễm trùng hầu họng: Gặp trong những trường hợp quan hệ tình dục miệng sinh dục (oral sex) biểu hiện viêm hầu họng, viêm amidan cấp, có thể

có sốt, sưng hạch vùng cổ

Nhiễm trùng da tiên phát do lậu: Biểu hiện thường là vết loét ở sinh dục, tầng sinh môn, đùi, ngón tay

Nhiễm lậu cầu lan toả:

Bệnh thường gặp ở những người bị bệnh lậu nhưng không được điều trị, hầu hết bệnh gặp ở phụ nữ Biểu hiện của bệnh: viêm khớp, viêm gan, viêm màng não, viêm cơ tim, viêm nội mạc viêm màng não, nhiễm vi khuẩn lậu trên da [15]

Xâm nhập

Nghiên cứu mảnh sinh thiết từ bệnh nhân bị bệnh lậu cho thấy, vi khuẩn lậu chui một phần vào trong bề mặt tế bào Cũng có thể thấy vi khuẩn

lậu trong các tế bào biểu mô, đôi khi bị bao quanh bởi màng tế bào Shaw và Falkow đã sử dụng kỹ thuật nuôi cấy liên tực một tế bào ung thư biểu mô nội mạc tử cung của người để nghiên cứu những biến cố ảnh hưởng tới sự xâm

nhập của vi khuẩn lậu trên in vitro và thấy rằng, sự xâm nhập tăng lên khi vi

khuẩn lậu được nuôi cấy trong môi trường có bổ sung sắt [57] Nghiên cứu trên ống dẫn trứng của người trong nuôi cấy nội tạng đã góp phần đáng kể vào việc tìm hiểu cơ chế của sự bán dính và xâm nhập Vi khuẩn lậu bám dính chọn lọc vào tế bào tiết nhày không có nhung mao của ống dẫn trứng và dần dần được nhấn chìm vào tế bào biểu mô biểu mô theo cơ chế ẩm bào Vi khuẩn lậu nhân lên và phân chia trong tế bào, mặc dù chúng không xâm nhập giữa các tế bào [58] Cuối cùng, một số vi khuẩn lậu đi ra từ bề mặt đáy cảu

tế bào nhờ một quá trình gọi là xuất bào ra khỏi tế bào Khi đã ở trong tế bào biểu mô, vi khuẩn lậu không bị tấn công của kháng thể, bổ thể, bạch cầu trung tính; khả năng sống sót ở một mức độ nhất định trong tế bào biểu mô cho thấy

có thể xem chúng như những “ký sinh nội bào tùy ý”

Các hệ thống thực nghiệm

Các nghiên cứu về sự phát sinh bệnh trở nên phức tạp bởi không có mô hình động vật phù hợp Nhiều mô hình động vật khác nhau đã được triển khai, mỗi mô hình đều có ứng dụng nhất định, nhưng không có mô hình động vật nào tái tạo đầy đủ hình ảnh bệnh mắc phải tự nhiên ở người Người ta đã thu được những bằng chứng đáng kể về sự thay đổi kháng nguyên và các tương tác với bạch cầu trung tính khi chủng dưới da ở chuột lang hoặc các động vật khác Tế bào nuôi cấy cũng là một cách để nghiên cứu sự bám dính và xâm

nhập Mô hình tốt nhật cho nhiều nghiên cứu in vitro là nuôi cấy mô của

người, nhất là hệ thống ống dẫn trứng đã được McGee và cộng sự sử dụng thành công [58]

1.2.5.Chẩn đoán vi khuẩn lậu trong phòng xét nghiệm

Chủ yếu dựa vào phương pháp xét ngiệm nhuộm soi và nuôi cấy tìm vi khuẩn lậu

Kỹ thuật nhuộm soi

Lấy mủ hoặc dịch tiết của bệnh nhân, dàn tiêu bản, nhuộm Gram, để khô, soi kính hiển vi và nhận định kết quả

Ưu điểm: dễ làm, đọc kết quả nhanh sau 15-20 phút, không cần trang thiết

bị đắt tiền

Nhược điểm: dễ nhầm với các loài thuộc họ Neisseriacea khác, độ nhạy và

độ đặc hiệu thấp, với trường hợp lậu biến chứng hoặc lậu ngoài đường sinh dục ít có giá trị

Ứng dụng: là kỹ thuật áp dụng rộng rãi cho tuyết cơ sở, nới không có điều

kiện nuôi cấy và các kỹ thuật hiện đại khác

Kỹ thuật nuôi cấy:

Lấy mủ hoặc dịch tiết của bệnh nhân, cấy trên mội trường thạch Thayer – Martin ở nhiệt độ 35-36 độ C, độ ẩm trên 70%, khí CO2 từ 3 đến 10%, để 18-24 giờ

Ưu điển: kết quả chính xác, là một trong những tiêu chuẩn chẩn đoán xác

định bệnh lậu, cho biết sự kháng kháng sinh của vi khuẩn lậu, tư đó giúp bác

sĩ lâm sàng trong quá trình điều trị, mặt khác góp phần đắc lực giám sát kháng kháng sinh của chủng vi khuẩn lậu

Nhược điển: kết quá chậm, yêu cầu kỹ thuật viên có trình độ kỹ thuật cáo, sinh phẩm, hóa chất trang thiết bị đắt tiền

Ứng dụng: áp dụng ở các tuyến trung ương

Chuẩn đoán huyết thanh:

Các xét nghiệm huyết thanh được triển khai để phát hiện kháng thể

kháng Neisseria gonorrhoeae hoặc các thành phần của nó thông qua phản ứng

kết hợp bổ thể

Ưu điểm: thực hiện một lúc số lượng lớn các xét nghiệm, kết quả nhanh

Nhược điểm: cần nhiều thiết bị và sinh phẩm đắt tiền, tốn kém cho bệnh nhân độ nhạy và độ đặc hiệu không cao

Ứng dụng: Ít dùng trong thực tế, thường áp dụng trong nghiên cứu

Kỹ thuật sinh học phân tử:

Thường là phản ứng PCR dựa vào nguyên lý sao chép DNA trong tế bào Phản ứng khuếch đại chuỗi (PCR) Nguyên lý của phản ứng PCR hoàn toàn dựa vào sự sao chép của DNA trong tế bào, trong đó DNA được nhân lên theo cơ chế bán bảo tồn từ một phân tử DNA chuỗi kép ban đầu, chúng được tách ra thành hai chuỗi đơn, một chuỗi đơn này làm khuôn mẫu cho việc tổng hợp sợi DNA mới Kỹ thuật này thược hiện với cặp mồi đặc hiệu có khả năng bắt cặp bổ xung vào hai đầu của hai sợi DNA Mỗi chu kỳ gồm 3 gai đoạn: + Giai đoạn biến tính: ở nhiệt độ 94-95ºC, đoạn DNA duỗi xoắn và tách hoàn toàn thành 2 sợi đơn

+ Giai đoạn gắn mỗi: nhiệt độ hạ 50-65ºC, các nucleotide tren mỗi đoạn mồi xuôi và ngược sẽ gắn theo nguyên tắ bổ xung với nucleotide ở hai đoạn đầu của đoạn gen cần tổng hợp

+ Giai đoạn kéo dài mồi: thực hiện ở 72ºC

Ưu điểm: thực hiện được số lượng lớn xét nghiệm cùng lúc, kết quả nhanh,

chính xác, độ nhạy cao, độ đặc hiệu cao

Nhược điểm: kỹ thuật viên phải có trình độ cao, chi phí cao, không giám sát được kháng kháng sinh của vi khuẩn lậu

Ứng dụng: trong các labo chẩn đoán tuyến tỉnh và trung ương

1.3.Tình hình kháng kháng sinh của vi khuẩn lậu

Trên thế giới

Theo WHO, năm 2011 có khoảng 88 triệu ca mắc bệnh lậu trong tổng số

448 triệu các nhiễm trùng LTQĐTD Vi khuẩn lậu có lịch sử kháng kháng

sinh trong nhiều năm đối với penicillin, sulfonamide, tetracylin và gần đây là quinolon và macrolid (gồm cả azithromycin) Việc giảm nhạy cảm với kháng sinh và kháng lại kháng sinh cephalosporin thế hệ đầu là một vấn đề lớn trong điều trị vi khuẩn lậu

Tại Thượng Hải, một nghiên cứu trên 384 bệnh nhân mắc bệnh lậu trong giai đoạn 2004 – 2005 và 2008 – 2009 cho thấy tỷ lệ kháng lại ciprofloxacin

là 98% [20]

Nghiên cứu của Olsen (2005) ở Thuỵ Điển thấy khi phân lập 180 chủng thì 100% các chủng nhạy cảm với ceftriaxone và spectinomycin; kháng azithromycin 2%, ciprofloxacin 50% và ampicillin 75% [21]

Azithromycin là một Macrolid mới xuất hiện, tuy nhiên tỉ lệ vi khuẩn lậu kháng lại kháng sinh này đang ngày càng tăng cao Năm 2001 ở Brazil đã báo báo có 23/81 chủng vi khuẩn lậu giảm tính nhạy cảm với azithromycin, tất cả các chủng này đều còn nhạy cảm với ceftriaxon và spectinomycin [25] Năm

2003 ở Cuba có 43 chủng vi khuẩn lậu giảm tính nhạy cảm với azithromycin [24] Đến năm 2011 ở Anh và Pháp đã xuất hiện chủng kháng lại azithromycin với tỉ lệ cao [22] [23]

Cứ mỗi lần một kháng sinh mới được đưa vào điều trị vi khuẩn lậu lại nhanh chóng phát triển khả năng kháng thuốc và phát triển rộng chủng kháng thuốc trên phạm vi toàn cầu chỉ sau 10 - 20 năm Vi khuẩn lậu tận dụng mọi

cơ chế kháng lại kháng sinh như bất hoạt thuốc, thay đổi mục tiêu tác động của thuốc, tăng cường đào thải và giảm hấp thu thuốc

Trong những thập kỷ gần đây các chủng lậu đã giảm nhạy cảm với kháng sinh cefixim và kháng đa kháng sinh ở Nhật Bản và lây lan sang các nước khác Năm 2001 Nhật Bản báo cáo 1 trường hợp sống ở Hawai đã điều trị VNĐ do lậu bằng Cefixim 400mg liều duy nhất bị thất bại Đến năm 2002 tiếp tục có 4 trường hợp được báo cáo điều trị VNĐ do lậu bằng Cefixim

không khỏi Nhật bản đã khuyến cáo nên sử dụng ceftriaxone hoặc spectinomycin như điều trị chính cho bệnh lậu thay vì cephalosporin uống [26] Năm 2009 Nhật Bản bắt đầu xuất hiện chủng vi khuẩn lậu ở họng kháng lại ceftriaxone [27] Năm 2010 VNĐ do lậu điều trị thất bại bằng cefixim đã được báo cáo ở Na Uy [28], sau đó là ở Úc, Anh, Pháp [22] [29] [18] Điều trị lậu ở hầu họng bằng ceftriaxon thất bại lan rộng sang Úc, Thụy Điển, Slovenia [31] [32] [33]

Một nghiên cứu từ năm 2011 – 2013 ở Hàn Quốc đã chỉ ra vi khuẩn lậu kháng lại nhiều loại kháng sinh mới như cefixim, azithromycin, cefpodoxim với tỷ lệ tương ứng 3%, 5%, 8%, 9% Tuy nhiên tất cả các trường hợp phân lập được đều còn nhậy cảm với Spectinomycin [34] Tương tự ở Ba Lan và Trung Quốc báo cáo đến năm 2013 chưa có trường hợp nào kháng lại Spectinomycin [35] [36] [37]

Các chủng lậu kháng lại cefixim đã lây lan khắp thế giới và đây sẽ là một thách thức nghiêm trọng về y tế công cộng làn tăng tỷ lệ mắc bệnh và cc biến chứng nguy hiểm gây ra bởi vi khuẩn lậu không thể điều trị [38] [39] [40] Theo chương trình giám sát vi khuẩn lậu ở châu Âu, 17 quốc gia thành viên của EU năm 2009 cho thấy 5% mẫu phân lập giảm nhạy cảm với cefixim, 65% kháng lại ciprofloxacin và 13% kháng lại azithromycin [41]

Tại Việt Nam

Các bệnh LTQĐTD ngày càng phổ biến ở Việt Nam trong đó có bệnh lậu Tuy nhiên, bệnh nhân thường giấu bệnh hoặc tự ra hiệu thuốc mua thuốc

về uống hoặc chữa bệnh ở các phòng khám tư nhân không chuyên khoa dẫn đến việc điều trị không đúng thuốc, không đủ liều càng làm gia tăng tỷ lệ kháng lại kháng sinh của vi khuẩn lậu

Ở Việt Nam, đã có nhiều công trình nghiên cứu về độ nhạy cảm của vi khuẩn lậu với kháng sinh

Theo nghiên cứu của Lê thị Phương và cộng sự tại viện Da Liễu Quốc Gia :

- Năm 1996- 2000 tỷ lệ vi khuẩn lậu kháng lại penicillin là 65,46%; nalidixic acid là 41,75%; tetracylin 40,50%; erythromycin 2,06%; ciprofloxacin 35,60%

- Năm 2001 tỷ lệ kháng penicillin là 47,47%; tetracyclin 44,52%; ciprofloxacin 42,67%; spectinomycin là 0,64%

- Năm 2002 tỷ lệ kháng penicillin là 30,05%; tetracyclin 26,29%; ciprofloxacin 46%[4]

- Năm 2003, tỷ lệ kháng ciprofloxacin 60,87%, penicillin là 27.39%; tetracyclin 23%; erythromycin 13,48%; spectinomycin 3,93%

Năm 2005, tỷ lệ kháng ciprofloxacin 59,62%, tetracyclin 40,50%; erythromycin 2,06%; ciprofloxacin 35,60%

Năm 2006, tỷ lệ kháng penicillin là 31,1%; ciprofloxacin là 56,6%; tetracyclin 16,5% erythromycin là 3,8%; giảm nhạy cảm với azithromycin 1,9% và cefotaxim 0,9%

Nghiên cứu của tác giả Lê Hồng Hinh nghiên cứu tại Hà Nội trong 3 năm 2001, 2002, 2003 với 80 chủng vi khuẩn lậu cho thấy tỷ lệ kháng các kháng sinh Penicillin, Ciprofloxacin, Tetracyclin còn cao, cụ thể lần lượt như sau [5]:

Theo tác giả Lê Văn Hưng nghiên cứu tại Viện Da liễu Trung Ương trong 3 năm 2005, 2006, 2007 tỷ lệ vi khuẩn lậu kháng lại các kháng sinh penicillin, tetracillin, ciprofloxacin còn cao tương tự các nghiên cứu trước Đã xuất hiện các chủng kháng lại azithromycin với tỷ lệ 5,6% (2005), 1,9% (2006), 0,8% (2007) và kháng lại cefotaxime với tỷ lệ 1,2% (2005), 0,9% (2006), 3,1% (2007) Và không có trường hợp nào kháng lại spectinomycin

1.4.Cơ chế kháng kháng sinh của vi khuẩn lậu

1.4.1.Cơ chế chung

- Sinh ra các enzyme như β-lactamase làm mất tác dụng của thuốc

- Thay đổi đích tác dụng của kháng sinh làm cho thuốc không có điểm đến để phát huy tác dụng

- Thay đổi tính thấm của thành tế bào vi khuẩn làm cho nồng độ kháng sinh xâm nhập vào tế bào không đủ để tiêu diệt vi khuẩn

- Các kiểu kháng thuốc quan trọng là do thay đổi gen hoặc do đột biến của nhiễm sắc thể hoặc là thu nhập qua plasmid hoặc transposon

+ Kháng qua trung gian nhiễm sắc thể : kiểu dề kháng này do đột biến gen đã được mã hóa ở đích tác dụng của thuốc hoặc ở hệ vận động thu nhập thuốc qua màng tế bào

+ Kháng qua trung gian plasmid: xảy ra ở nhiều chủng vi khuẩn, đặc biệt là trực khuẩn Gram âm, kháng với nhiều loại thuốc, có khả năng lây truyền từ vi khuẩn này sang vi khuẩn khác bằng hình thức tiếp hợp

Các plasmid kháng thuốc là các phân tử DNA ngoài nhiễm sắc thể mang gen

mã hóa enzyme làm bất hoạt kháng sinh và thay đổi hệ thống vận chuyển qua màng tế bào có thể sao chép độc lập với nhiễm sắc thể của vi khuẩn trên tế bào, có thể chứa nhiều sao chép không chỉ cho tế bào cùng loài mà còn khác loại khác chủng

+ Kháng qua trung gian transposon: transposon là một đoạn gen được truyền trong nội tại DNA hoặc giữa các DNA như các plasmid, nhiễm sắc thể của vi khuẩn

- Đề kháng không trên cơ sở của gen kháng thuốc: làm cho kháng sinh không ức chế hoặc không giết chết được vi khuẩn

+ Vi khuẩn nằm trong ổ ap xe mà thuốc không thấm vào được, khi đó cần phải dẫn lưu ổ áp xe

+ Vi khuẩn ở trạng thái nghỉ do đó không nhạy cảm với các kháng sinh

ức chế tổng hợp thành tế bào vi khuẩn như penicillin và cephalossporin

+ Trong một số trường hợp đặc biệt, vi khuẩn trút bỏ thành tế bào mà vẫn sống được như một thể nguyễn sinh khi đó nó cũng không nhạy cảm với các thuốc tác động lên thành tế bào , đến lúc nào đó nó tái tổng hợp lại vách tế bào thì nó lại nhạy cảm với thuốc [5] [8]

1.4.2.Cơ chế kháng thuốc của vi khuẩn lậu

- Penicillin và cephalosporin: vi khuẩn sinh ra men β-tactamase bao gồm penicillinase và cephalosporinase có khả năng thủy phân các kháng sinh nhóm penicillin và cephalosporin

Vi khuẩn lậu để kháng penicillin do chúng làm giảm tác dụng của phức hợp giữa penicillin và protein (PBP) làm tăng gắn kháng sinh vào PBP do đó làm giảm tính thấm của kháng sinh qua màng tế bào vi khuẩn

Với cephalosporin: vi khuẩn lậu làm biến đổi enzzyme thảy đổi tính thấm của màng tế bào vi khuẩn lậu với kháng sinh và đồng thời cũng làm giảm hoạt tính của protein gắn kháng sinh

- Aminoglucosid có 3 cơ chế kháng:

+ Biến đổi thuốc bằng quá trình phosphoryl hóa, adenyl hóa được mã hóa bởi plasmid và acetyl hóa các enzyme làm thay đổi thuốc

+ Đột biến nhiễm sắc thể

+ Giảm tính thấm của thành tế bào vi khuẩn đối với thuốc

- Tetracyclin: giảm khả năng tiếp nhận thuốc vào vi khuẩn hoặc tăng khả năng loại thải thuốc ra khỏi vi khuẩn làm giảm nồng độ thuốc trong tế bào

vi khuẩn, do đó vi khuẩn kháng lại thuốc

- Cloramphenicol: vi khuẩn sinh ra enzzyme acetyl transferase được

mã hóa ở plasmid làm actyl hóa thuốc từ đó làm bất hoạt thuốc

Erythromycin: vi khuẩn sinh ra enzyme được mã hóa ở plasmid có tác dụng metyl hóa 23 – s – RNA, ngăn chặn hiện tượng gắn thuốc vào vi khuẩn

- Sulfonamid có 2 cơ chế như sau:

+ Hệ thống vận chuyển được mã hóa ở plasmid gây ra chủ động dẩy thuốc ra khỏi tế bào

+ Đột biến nhiễm sắc thể ở gen mã hóa các enzyme đích tác dụng làm giảm áp lực gắn thuốc vào vi khuẩn

- Quinolon : vi khuẩn kháng thuốc là do đột biến làm thay đổi DNA gynase của vi khuẩn, kháng thuốc cũng có thể do thay đổi protein màng ngoài của vi khuẩn làm giảm thu nhận thuốc trong vi khuẩn [5][8]

CHƯƠNG 2

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1.Đối tượng nghiên cứu

Là 2154 bệnh nhân được chẩn đoán mắc hội chứng tiết dịch niệu đạo,

âm đạo, bằng kỹ thuật nuôi cấy phát hiện 106 bệnh nhân nhiễm lậu cầu tại bệnh viện Da liễu Trung ương từ tháng 3/2016 đến tháng 12/2016

Tiêu chuẩn chọn bệnh nhân

- Bệnh nhân có hội chứng tiết dịch niệu đạo

- Bệnh nhân đồng ý tham gia nghiên cứu

Tiêu chuẩn loại trừ:

- Bệnh nhân đang dung thuốc ( trong vòng 5-7 ngày trước)

- Bệnh nhân bị bệnh AIDS

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Mẫu nghiên cứu

Nghiên cứu của tôi được thực hiện trên tất cả những bệnh nhân có hội chứng tiết dịch niệu đạo, âm đạo đến khám tại Bệnh viện Da liễu Trung ương

- Thước đo đường kính vòng vô khuẩn trong làm kháng sinh đồ

- Tủ nuôi cấy: điều chỉnh được nống độ CO2 của hãng Sannyo

Đánh giá tỷ

lệ kháng thuốc ở vi khuẩn lậu

- Môi trường phân lập vi khuẩn Thayer – Martin

+ Thạch GC chứa 10% hemoglobin powder

+ Chất tăng sinh ( Isovitalex) thành phần bao gồm:

Diphosphopyridin nucleotid (coenzym) Carboxylase

p Aminobenzoic acid Thiamin – HCl

Vitamin B12

L – Glutamin

L – cystin – 2HCL

L – cystin – HCL – 2H2O Adenine

+ Môi trường đường phân hủy nhanh: Neissevia 4H

+ Các khoanh giấy kháng sinh

+ Các thanh giấy E-test dùng để xác định nồng độ ức chế tối thiểu của kháng sinh đối với vi khuẩn lậu

+ Chủng vi khuẩn lậu: Neisseria – Gonorrhoeae

Bảng 2.1: Các khoanh giấy kháng sinh thuộc nhón chính

Tên kháng sinh Kí hiệu Lượng kháng sinh/ khoanh

Bảng 2.2: Các khoanh giấy kháng sinh thuộc nhón bổ sung

Tên kháng sinh Kí hiệu Lượng kháng sinh/ khoanh

+ Cổ tử cung: làm ẩm mỏ vịt bằng nước cất vô trùng đặt mỏ vịt làm

bộc lộ cổ tử cung, dùng tăm bông vô trùng đưa sâu vào trong cổ tử cung 2 – 3

cm, để 5 -10 giây cho dịch thấm vào tăm bông dàn mỏng trên tiêu bản

+ 2 bên tuyến Skène

+ 2 bên tuyến Bartholin

+ Niệu đạo: dùng que cấy hoặc tăm bông vô trùng loại nhỏ đưa vào

niệu đạo khoảng 1.5 đến 2 cm rồi xoay nhẹ tăm bông, để khoảng 5-10 giây rồi rút tăm bông nhẹ nhàng và dàn mỏng bệnh phẩm lên tiêu bản

Ở nam giới

+ Lậu cấp tính: Bệnh nhân nhịn tiểu 2-3 giờ trước khi lấy bệnh phẩm,

hưỡng dẫn bệnh nhân để lộ bộ phận sinh dục, lau bỏ phần mủ ngoài trước khi lấy bệnh phẩm, dùng tăm bông thấp nước muối sinh lý 0,9% đưa sâu vào niệu đạo 1,5- 2 cm, xoay tròn để tăm bông 5-10 giây cho dịch thấm vào tăm bông rồi rút nhẹ tăm bông, dàn mỏng trên tiêu bản

+ Lậu mạn tính: Nhất thiết phải hưỡng đãn bệnh nhân nhịn tiểu ít nhất

2-3 giờ trước khi thực hiện xét nghiệm Các bước tiến hành lấy bệnh phẩm tương tự lậu cấp

Dịch rỉ mắt ở trẻ sơ sinh

Đeo gang tay vô trùng, dùng ngón tay trỏ ấn nhẹ vào mi mắt trẻ, mủ ở kết mạc chảy ra, dùng tăm bông vô trùng để lấy bệnh phẩm: để 5-10 giây cho

mủ thấm vào tăm bông, dàn đều bệnh phẩm trên tiêu bản để khô tự nhiên và

cố định bệnh phẩm bằng cách hơ nhẹ trên ngọn lửa đèn cồn rồi tiến hành nhuộm Gram

Đối với phụ nữ cắt bỏ tử cung: lấy bệnh phẩm ở phần âm đạo

Đối với nữ giới chưa quan hệ tình dục: lấy bệnh phẩm âm đạo không

dùng mỏ vịt

Đối với bệnh nhân bị ở hậu môn: Dùng tăm bông lau sạch hậ môn, lấy

que tăm bông đưa sâu 3 cm , dàn bệnh phẩm trên tiêu bản như bệnh phẩm ở niệu đạo

2.4.2.Kỹ thuật nhuộm soi

Sau khi phết bệnh phẩm lên lam kính, để khô tự nhiên, cố định trên ngon lửa đèn cồn với sức nóng vừa phải Su đó tiến hành nhuộm Gram

Nhuộm Gram:

+ Phủ tiêu bản bằng dung dịch tím Gentian trong thời gian 1 phút

+ Rửa dưới vòi nước chảy nhẹ

+ Phủ tiêu bản bằng dung dịch Lugol để thời gian 60 giây

Nhận định kết quả: Quan sát dưới kính hiển vi ta thấy vi khuẩn có hình hạt cà phê, đứng thành cặp, 2 mặt dẹp úp vào nhau, bắt màu Gram âm nằm trong hoặc ngoài bạch cầu đa nhân trung tính thoái hóa, hướng tới vi khuẩn lậu

Hình 2.1: Hình ảnh vi khuẩn lậu nhuộm Gram và soi trên kính hiển vi

2.4.3.Kỹ thuật nuôi cấy

- Kỹ thuật nuôi cấy: lấy bệnh phẩm như với kỹ thuật nhuộm soi trực tiếp Bệnh phẩm được ria trên môi trường Thayer - Martin bằng những đường zich zắc hoặc kỹ thuật cấy phân vùng Để đĩa thạch cấy vào tử ấm nhiệt độ 35- 36ºC , với nồng độ CO2 từ 3- 10%, độ ẩm > 70% Sau 18-24 giờ quan sát khuẩn lạc Nếu chưa thấy vi khuẩn mọc để thêm 24 giờ nữa

Hình 2.2: Vi khuẩn lậu trên môi trường Thayer - Martin

- Test oxydase :

+ Thử trên dải giấy thấm Whatman: dùng đầu pepette pasteur uốn cong trên ngọn lửa đèn cồn, lấy khuẩn lạc nghi ngờ phết lên dải giấy thấm Whatman No1 kích thước 2,5x0,5 cm đã được làm ẩm bằng 2-3 giọt thuốc thử tetramethyl p – phenylendiamin hydroclord 1%

+ Test oxidase làm trực tiếp trên khuẩn lạc của đĩa thạch nuôi cấy

Phản ứng dương tính: trong vòng 5 giây khuẩn lạc từ màu đỏ chuyển sang màu tím đậm vì có những vi khuẩn có men oxidase khi tiếp xúc thuốc thử tetramythyl - p –phenul endiamin hydroclorid 1% sự có mặt của oxy ngoài không khí sẽ chuyển màu

- Test enzyme Remel BactiCard Neisseria

Nguyên lý: remel BactiCard Neisseria Sử dụng hệ thống các enzyme,

để xác định các loài Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Neisseria

lactamica và Moraxella catarrhalis Vật liệu dùng để xác định gồm một thanh

có 4 vòng tròn thử nghiệm, thanh giếng được tẩm các chất tạo màu với

indoxyl butyrate esterase (IB), prolyl aminopeptidase (PRO), glutamyl aminopeptidase (GLUT), và beta-galactosidase (BGAL)

gamma-Các chất tạo màu cho phép định danh các vi khuẩn tương ứng

M.catarrhalis, N.gonorrhoeae, N.meningitidis, và N.lactamica Enzym BGAL

(của N.lactamica) thủy phân 5-bromo-4- chloro-3indolyl-β-D galactoside và

IB (của M.catarrhalis) thủy phân 5-bromo- 4-chloro- 3-indolyl butyrate trong điều kiện có oxy để tạo thành phức hợp màu xanh lá cây GLUT (của N.meningitidis) thủy phân gamma-glutamyl-β-naphthylamide và PRO (của N.gonorrhoeae) thủy phân L-proline-β-naphthylamide để tạo thành màu đỏ Kết quả định danh bằng BactiCard Neisseria cho 558 chủng phân lập, được đối chiếu với kết quả định danh bằng phương pháp thông thường trong một thử nghiệm mù Các BactiCard Neisseria xác định đúng 254/254 chủng Neisseria gonorrhoeae (đạt 100%), 125/125 chủng Neisseria meningitides (đạt 100%), 53/54 chủng Neisseria lactamica (đạt 98,2%), và 123/125 Moraxella catarrhalis (đạt 98,4%)

Đây là một test được thực hiện nhanh chóng và cho kết quả chính xác

để xác định các vi sinh vật trong phòng thí nghiệm

+ Chuẩn bị: thẻ test BactiCard Neisseria gồm thành phần các chất phản ứng:

- 5-bromo-4- chloro-3 indolyl-β-D-galactoside (BGAL)

- 5-bromo- 4-chloro- 3-indolylbutyrate (IB)

- Gamma-glutamyl-β-naphthylamide (GLUT)

- L-proline-β-naphthylamide (PRO)

- Rehydrating fluid (1lọ, 6ml) có chứa cất bảo quản

- Chất tạo màu (1 lọ, 6ml) có thành phần 0,02% dimethylaminocinnamaldehyde

p-+ Các bước tiến hành (theo đúng thường quy của hướng dẫn kit)

Tiến hành nhỏ vào mỗi vòng tròn test một giọt rehydrating fluid được cung cấp trong bộ kit Phết khuẩn lạc phân lập được lên mỗi vòng tròn test Ủ

ở nhiệt độ phòng trong 2 phút

Quan sát vòng tròn IB nếu cho kết quả màu xanh lá cây là dương tính Nếu IB âm tính, tiếp tục ủ ở nhiệt độ phòng thêm 13 phút (tổng thời gian kiểm tra là 15 phút)

Quan sát vòng tròn BGAL nếu cho màu xanh lá cây là kết quả dương tính Nếu BGAL âm tính, nhỏ một giọt chất tạo màu vào vòng tròn PRO và GLUT Quan sát sự chuyển màu hồng sang màu đỏ là dương tính

Hình 2.3: Remel BactiCard Neisseria

2.4.4.Các tiêu chuẩn chẩn đoán xác định vi khuẩn lậu

Nhuộm soi: có song cầu khuẩn Gram âm hình hạt cà phê nằm trong và ngoài bạch cầu đa nhân trung tính

Nuôi cấy: Thấy khuẩn lạc dạng S lấp lánh như giọt sương và có màu hơi xám Lấy khuẩn lạc nhuộm Gram thấy song cầu hình hạt cà phê bắt màu Gram âm đa dạng

Test oxidase dương tính

Test enzyme Remel BactiCard Neisseria dương tính

Như vậy đủ tiêu chuẩn để kết luận Neisseria gonorrhoeae dương tính

- Dùng pipette hút canh khuẩn láng đều trên bề mặt đĩa thạch có đường kính 9cm với độ dày 4mm Hút bỏ bớt canh khuẩn thừa trên đĩa thạch Để khô mặt thạch ở nhiệt độ phòng

- Đặt các khoanh giấy kháng sinh lên mặt đĩa thạch( đường kính 9cm đặt 6 khoanh) khoanh giấy cách thành đĩa thạch 2 cm để khoảng 10 phút để kháng sinh khuếch tán đều

- Ủ trong tủ ấm ở nhiệt độ 35-37ºC, nồng độ CO2: 3-10%, độ ẩm trên 70%

Đọc kết quả sau đó 18 đến 24 giờ Đo đường kính vòng vô khuẩn tính bằng mm, so sánh với bảng tiêu chuẩn

Đánh giá kết quả: đo đường kính vòng vô khuẩn bằng thước tính bằng mm

+ Nếu vòng vô khuẩn rõ ràng thì đo đường kính tính ra mm

+ Nếu mép vòng vô khuẩn không rõ ràng: Đọc 80% đường kính vòng

vô khuẩn

+ Nếu trong vùng ức chế có một vài khuẩn lạc thì lấy khuẩn lạc đó ra nhuộm Gram, nếu là vi khuẩn lậu thì lấy khuẩn lạc ra làm kháng sinh đồ, vẫn

đo đường kính vùng ức chế như bình thường

+ Nếu vòng vô khuẩn không tròn đều thì chọn rìa nào tròn nhất để đo đường kính

2.4.6 Kỹ thuật xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC)

Chúng tôi dùng kỹ thuật E-test để xác định MIC với các kháng sinh của vi khuẩn lậu

Nguyên lý: kháng sinh được tẩm lên băng giấy vơi nồng độ loãng dẫn khuếch tán trên môi trường, vi khuẩn không phát triển ở nơi có nồng độ cao tạo thánh vùng vô khuẩn (hình elip) Nồng độ kháng sinh thấp nhất trên băng

giấy ứng với ranh giới giữa nơi vi khuẩn phát triển và không phát triển được gọi là nồng độ ức chế tối thiểu của kháng sinh với vi khuẩn (MIC)

Các bước tiến hành:

• Dùng que cấy vô trùng lấy khuẩn lạc vi khuẩn lậu nuôi cấy 18-24 giờ

• Hòa đều vi khuẩn với NaCl 0,9%

• So sánh độ đục tiêu chuẩn của Mc,Farland 0,5

• Dùng tăm bông vô khuẩn nhúng vào huyền dịch: ép tăm bông trong thành trong của ống canh khuẩn, loại bỏ canh khuẩn thừa

• Ria tăm bông lên bề mặt môi trường sao cho các đường ria liền nhau

• Để khô mặt thạch ở nhiệt độ phòng khoảng 10 phút

• Đặt các thanh giấy kháng sinh E-test, để khoảng 10 phút ở nhiệt độ phòng cho kháng sinh ở các thanh giấy khuếch tán đều

• Để vào tử ấm nhiệt độ 35-36ºC, nồng độ CO2 từ 3- 10%,

độ ẩm trên 70% Sau 18-24 giờ đem ra đọc kết quả