Nghiên cứu mối liên hệ giữa sự đa kháng với tỷ lệ phát hiện gen kháng cephalosporin của vi khuẩn escherichia coli phân lập được từ chất thải của lợn

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM PHẠM LÊ MINH NGHIÊN CỨU MỐI LIÊN HỆ GIỮA SỰ ĐA KHÁNG VƠI TỶ LỆ PHÁT HIỆN GEN KHÁNG CEPHALOSPORIN CỦA VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI PHÂN LẬP ĐƯỢC TỪ CHẤT THẢI CỦA LỢN Ngành: Thú y Mã số: 60 64 01 01 Người hướng dẫn khoa học: TS Đặng Thị Thanh Sơn PGS.TS Huỳnh Thị Mỹ Lệ NHÀ XUẤT BẢN HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP - 2018 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan số liệu kết nghiên cứu luận văn trung thực chưa sử dụng công bố tài liệu Tôi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực luận văn cảm ơn thơng tin trích dẫn luận văn rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày tháng năm 2017 Tác giả luận văn Phạm Lê Minh i LỜI CẢM ƠN Trong thời gian thực tập hoàn thành luận văn tốt nghiệp, bên cạnh cố gắng thân, nhận nhiều giúp đỡ, lời động viên khuyến khích chia sẻ chân thành cácThày Cô đồng nghiệp Lời đầu tiên, xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới TS Đặng Thị Thanh Sơn – Phó trưởng Bộ mơn Vệ Sinh Thú y, Viện Thú y PGS.TS Huỳnh Thị Mỹ Lệ – Trưởng Bộ môn Vi sinh vật Truyền nhiễm, Khoa Thú Y, Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam tận tình, tâm huyết hướng dẫn tơi suốt thời gian thực tập làm luận văn tốt nghiệp Tôi biết ơn tập thể Thày Cô giáo Khoa Thú y- Học viện NN giảng dạy giúp đỡ tơi hồn thành mơn học chương trình Thạc sĩ Tôi gửi lời cảm ơn tập thể cán bộ, nhân viên Bộ môn Vệ sinh Thú Y- Viện Thú Y tạo điều kiện giúp đỡ, hỗ trợ suốt thời gian thực tập Bộ môn Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè đồng nghiệp ln động viên tơi suốt thời gian học tập hồn thành luận văn Hà Nội, ngày tháng năm 2017 Tác giả luận văn Phạm Lê Minh ii MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục chữ viết tắt v Danh mục bảng vi Danh mục hình ảnh vii Trích yếu luận văn viii Thesis abstact ix Phần Mở đầu 1.1 Tính cấp thiết đề tài 1.2 Ý nghĩa đề tài Phần Tổng quan tài liệu 2.1 Vi khuẩn Escherichia coli (E Coli) 2.2 Một số nhóm kháng sinh 2.3 Khả kháng kháng sinh vi khuẩn 2.3.1 Bản chất di truyền tính đề kháng phương thức chuyển tải gene 2.3.2 Cơ chế kháng thuốc nhóm Cephalosporia vi khuẩn E Coli 2.4 Các kiểu gen ESBL 2.4.1 Kiểu gen TEM - ESBL 2.4.2 Kiểu gen SHV- ESBL 10 2.4.3 Kiểu gen CTX-M ESBL 10 2.5 Phân bố dịch tễ ESBL 11 2.6 Chất thải chăn nuôi- nguồn lưu cữu vi khuản mang gen kháng thuốc 16 2.7 Một số nghiên cứu tượng kháng thuốc vi khuẩn 17 2.7.1 Tình hình nghiên cứu ngồi nước 17 2.7.2 Tình hình nghiên cứu nước 17 Phần Đối tượng, nội dung, nguyên liệu, phương pháp nghiên cứu 19 3.1 Vật liệu nghiên cứu 19 3.2 Nội dung nghiên cứu 19 3.3 Địa điểm nghiên cứu số mẫu nghiên cứu 19 iii 3.4 Phương pháp nghiên cứu 19 3.4.1 Phương pháp thu thập mẫu phân lợn chuồng nuôi 19 3.4.2 Phương pháp phân lập vi khuẩn E.coli kháng cefotaxime 20 3.4.3 Phương pháp kiểm tra tính mẫn cảm kháng sinh chủng vi khuẩn E Coli kháng cefotaxime phân lập 21 3.4.4 Phương pháp khoanh giấy đôi (Doulble-disks test)phát chủng E.coli sản sinh ESBL 22 3.4.5 Phương pháp PCR phát gen kháng cephalosporin (TEM, CTX, SHV) chủng E Coli sản sinh ESBL (Hasman et al., 2005, Olesen et al., 2004) 23 3.4.6 Phương pháp điện di kiểm tra kết 24 3.4.7 Phương pháp sử lý số liệu 24 Phần Kết thảo luận 25 4.1 Kết thu thập thông tin sử dụng kháng sinh cho lợn Thái Bình Sóc Sơn 25 4.2 Kết thu thập mẫu 26 4.3 Kết phân lập vi khuẩn E Coli kháng cefotaxime 27 4.4 Kết giám định đặc tính sinh hóa chủng E Coli phân lập 27 4.5 Kết xác định mức độ mẫn cảm tỷ lệ đa kháng với số kháng sinh nhóm Cephalosporin chủng E Coli phân lập 30 4.6 Kết phát mối liên quan khả sản sinh men ESBL tỷ lệ mẫn cảm với kháng sinh nhóm Cephalosporin E Coli 33 4.7 Kết phát gene kháng Cephalosporin chủng E Coli sản sinh men ESBL phân lập 37 Phần Kết luận đề nghị 39 5.1 Kết luận 39 5.2 Đề nghị 39 Tài liệu tham khảo 41 iv DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Nghĩa tiếng Việt MH: Muller Hinton PCA: Plate count agar E coli: Escherichia coli ESBL: Men beta-lactamase phổ rộng VP, MR: VOGES- PROSKAUER , METHYL RED ST: Stable toxin VK: Vi khuẩn PAB: Para- amino benzoic Cs, et al Cộng PSW: Penton saline water AMC: Amoxicillin/clavulanic NA: Nutrient agar Cf: Cefoperazone Cx: Ceftriaxone Cz: Ceftazidime Cu: Cefuroxime v DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Một số kháng sinh thuộc nhóm Cephalosporin Bảng 3.1 Bảng đánh giá đường kính vịng vô khuẩn 22 Bảng 3.2 Chu trình nhiệt phản ứng PCR 23 Bảng 3.3 Các cặp gen mồi để phát gen kháng kháng sinh TEM, SHV and CTX-M (Hasman et al 2005) 24 Bảng 4.1 Một số loại thuốc kháng sinh phòng trị bệnh cho lợn hộ chăn nuôi thuộc tỉnh Thái Bình 25 Bảng 4.2 Một số loại thuốc kháng sinh phòng trị bệnh cho lợn hộ chăn ni thuộc huyện Sóc Sơn 26 Bảng 4.3 Số lượng mẫu phân chuồng lợn thu thập 27 Bảng 4.4 Kết phân lập vi khuẩn E coli kháng cefotaxime 27 Bảng 4.5 Kết kiểm tra sinh hóa số chủng vi khuẩn E coli phân lập Thái Bình Sóc Sơn 28 Bảng 4.6 Tỷ lệ đa kháng thuốc nhóm Cephalosporin chủng E Coli kiểm tra tính mẫn cảm kháng sinh 31 Bảng 4.7 Mối tương quan khả đa kháng kháng sinh nhóm cephalosporin tỷ lệ sản sinh men ESBL vi khuẩn E coli phân lập 33 Bảng 4.8 Khả sản sinh ESBLcủa chủng vi khuẩn E.coli phân lập tỷ lệ vớikhả mẫn cảm kháng sinh cephalosporin 35 Bảng 4.9 Tỷ lệ phát chủng E.coli mang hai genes (CTX, TEM) kháng cephalosporin 37 vi DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 2.1 Hình ảnh vi khuẩn E.coli kính hiển vi điện tử Hình 2.2 Cơ chế kháng thuốc vi khuẩn Hình 2.3 Vị trí tác động enzyme beta-lactamse Hình 2.4 Cấu trúc xoắn số dẫn chất kiểu gen TEM 10 Hình 2.5 Phân bố vi khuẩn mang gen ESBL giới Nam Trung Mỹ 12 Hình 4.1 Tỷ lệ phát chủng E coli đa kháng cephalosporin phân lợn 33 Hình 4.2 Mối tương quan khả đa kháng kháng sinh nhóm cephalosporin tỷ lệ sản sinh men ESBL vi khuẩn E coli phân lập 34 Hình 4.3 Khả sản sinh ESBLcủa chủng vi khuẩn E.coli phân lập tỷ lệ với khả mẫn cảm kháng sinh cephalosporin 35 Hình 4.4 Tỷ lệ gen kháng cephalosporin phát từ chủng E coli sản sinh ESBL 41 vii TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả : Phạm Lê Minh Tên luận văn: Nghiên cứu mối liên hệ đa kháng với tỷ lệ phát gen nhóm Cephalosporin vi khuẩn Escherichia coli phân lập đươck từ chất thải lợn Ngành : Thú y Mã số : 60 64 01 01 Tên sở đào tạo: Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam Mục đích nghiên cứu: Kết nghiên cứu đề tài bước làm rõ mối tương quan mức độ kháng kháng sinh nhóm cephalosporin- kháng sinh thường sử dụng điều trị bệnh đường tiêu hóa tiết niệu vi khuẩn E coli khả sản sinh men beta- lactamase chủng phân lập Từ đánh giá nguy mang gen kháng thuốc E.coli phân lập từ chất thải lợn thực tế chăn nuôi lợn Phương pháp nghiên cứu: - Phương pháp thu thập mẫu phân lợn chuồng nuôi - Phương pháp phân lập vi khuẩn E.coli kháng cefotaxime - Phương pháp kiểm tra tính mẫn cảm kháng sinh chủng vi khuẩn E coli kháng cefotaxime phân lập - Phương pháp khoanh giấy đôi (Doulble-disks test)phát chủng E coli sản sinh ESBL - Phương pháp PCR phát gen kháng cephalosporin (TEM, CTX, SHV) chủng E coli sản sinh ESBL - Phương pháp xử lý số liệu Kết kết luận Tỷ lệ nhiễm E.coli kháng cefotaxime chất thải lợn thu thập chuồng 82% tương đương địa phương Thái Bình Sóc Sơn Tỷ lệ vi khuẩn E coli mẫn cảm với loại kháng sinh nhóm cephalosporin kiểm tra 11,4% Tỷ lệ E coli kháng cefotaxime tiếp tục kháng với 1,2,3,4,5 loại kháng sinh khác nhóm cephalosporin có chiều hướng tăng, 7,7%, 6,8%, 19,5%, 34,1%, 20,5% Tỷ lệ vi khuẩn E Coli phân lập từ phân chuồng lợn kháng với nhât loại cephalosporin khác cefotaxime, có khả sản sinh men ESBL 80.5% Nghiên cứu xác định 100% chủng kháng với loại kháng sinh viii cephalosporin hệ có khả sinh ESBL 97.3% chủng kháng loại hệ có khả sản sinh ESBL Tỷ lệ vi khuẩn E coli mang gen CTX TEM chủng E.coli sản sinh ESBL nghiên cứu 68.8% 19.8% Trong đó, 61.2% số chủng E coli sản sinh ESBL mang gen CTX, 12.1% số chủng mang gen TEM, 7.7% số chủng mang đồng thời gen CTX TEM Tại nghiên cứu không phát chủng E coli mang gen SHV Vi khuẩn E coli kháng với loại (cefoperazone, ceftriaxone, cefuroxime, ceftazidime, cefamandole mang hai genes (CTX, TEM) Trong đó, chủng kháng với ceftriaxone cefuroxime thường mang gen CTX, chủng E coli kháng với cefuroxime chủng mang gen TEM, chủng kháng với cefamandole cefuroxime chủng thường mang gen CTX TEM ix Bảng 4.6 Tỷ lệ đa kháng thuốc nhóm Cephalosporin chủng E Coli kiểm tra tính mẫn cảm kháng sinh Số lượng tên kháng sinh CFP+CRO+CXM+CAZ+MA CFP+CRO+CXM+MA CRO+CXM+CAZ+MA CFP+CRO+CAZ+MA CFP+CXM+CAZ+MA CRO+CXM+MA CRO+CAZ+MA CXM+CAZ+MA CAZ+MA CRO+MA CXM+MA CRO+CXM CAZ MA TỔNG Số chủng Kháng nhóm KS/ 220 chủng 45 68 28 14 1 16 195/220 Khả đa kháng kháng sinh Tổng số chủng Tỷ lệ kháng từ 1-5 (%) loại KS 20.5 75 34.1 43 19.5 15 6.8 7.7 88.6 Hình 4.5 Tỷ lệ phát chủng E coli đa kháng cephalosporin phân lợn 31 So sánh với kết nghiên cứu công bố năm 2008 tác giả Hoàng Hoài Phương cs (2008), 61.5% chủng vi khuẩn E.coli phân lập từ thực phẩm kháng từ loại kháng sinh hay kết nghiên cứu công bố năm 2014 Trần Thị Thùy Giang cs.- 65% chủng vi khuẩn E coli phân lập từ thực phẩm kháng với -7 loại kháng sinh tỷ lệ đa kháng kháng sinh E.coli nghiên cứu cao Điều lý giải nhóm vi khuẩn E coli lựa chọn thử kháng sinh đồ nghiên cứu theo quy trình phân lập từ đầu chung E coli kháng cefotaxime Bên cạnh đó, thực tế chăn ni việc kiểm sốt kháng sinh sử dụng để phòng trị bệnh cho lợn chưa kiểm soát tốt, nguy tăng sức kháng vi khuẩn gây bệnh hữu Tỷ lệ đa kháng kháng sinh vi khuẩn E coli phổ biến mức cao tiếp tục gây khó khăn cho cơng tác phịng trị bệnh vật ni người nước ta Vì vậy, việc tiến tới kiểm sốt vi khuẩn khảng thuốc nước ta cần trọng thực đồng nhằm hạn chế tối đa thiệt hại kinh tế đảm bảo sức khỏe người vật nuôi Trong thực tế, thuốc kháng sinh đưa vào thể vật ni nhiều đường khác Kết khảo sát thông tin sử dụng kháng sinh cho đàn lợn từ hộ cho thấy, 100% hộ chăn nuôi sử dụng kháng sinh với mục đích điều trịbệnh cho đàn lợn nuôi thời điểm khảo sát Thuốc kháng sinh hộ chăn nuôi sử dụng rộng rãi, nhiều thuốc kháng sinh thuộc nhóm β-lactam (ampicillin, amoxicillin, penicillin) thuốc kháng sinh thuộc nhóm aminoglycosid (gentamycin, streptomycin, neomycin) Tiếp theo nhóm thuốc kháng sinh tetracyclin (Doxycycline), nhóm Quinolon (enrofloxac), nhóm kháng sinh Macrolid (lincomycin, tylosin) Nhóm kháng sinh sử dụng nhóm Polypeptide (colistin) Nhiều kháng sinh chủ hộ sử dụng với liều tăng từ 0,5- lần so với liều quy định nhận thấy thuốc khơng cịn tác dụng chữa bệnh cho lợn dùng liều cho phép Bên cạnh đó, 9/100 hộ chăn nuôi sử dụng kháng sinh bổ sung vào thức ăn, nước uống cho lợn nhằm phịng bệnh kích thích tăng trưởng cho đàn lợn Đây nguy gây lên tượng kháng thuốc phổ biến vi khuẩn gây bệnh Vi khuẩn kháng thuốc không ảnh hưởng tới hiệu chữa bệnh vật ni mà cịn ảnh hưởng tới sức khỏe người bị lây nhiễm vi khuẩn từ vật nuôi, từ môi trường Tại nghiên cứu này, chúng tơi chưa tìm thấy mối liên quan việc dùng kháng sinh cho lợn tỷ lệ nhiễm vi khuẩn E coli kháng cefotaxime phân lợn Trong trình thực điều tra trạng sử dụng kháng sinh cho lợn, hầu hết chủ hộ không nhớ hết tên thuốc kháng sinh sử dụng hộ 32 Hoặc kháng sinh sản xuất với tên thương mại khác thành phần hóa học giống mà chủ hộ khơng ghi chép lại 4.2.2 Kết phát mối liên hệ khả sản sinh men ESBL tỷ lệ mẫn cảm với kháng sinh nhóm cephalosporin vi khuẩn E coli Theo Vanessa Blanc et al (2006) diện vi khuẩn sinh ESBL vật nuôi lan truyền plasmid có chứa gen kháng thuốc chủng loài loài vi khuẩn khác Ngoài tác giả cho biết việc sử dụng kháng sinh nhóm beta-lactam chăn nuôi tạo áp lực chọn lọc lên vi khuẩn khiến vi khuẩn tăng khả đề kháng với kháng sinh Việc xét nghiệm phát tỷ lệ vi khuẩn E coli có khả sản sinh men ESBL tiêu chí để đánh giá mức độ kháng thuốc vi khuẩn gây bệnh Bảng 4.7 Mối tương quan khả đa kháng kháng sinh nhóm cephalosporin tỷ lệ sản sinh men ESBL vi khuẩn E coli phân lập Tỷ lệ sản sinh men ESBL Số lượng tên kháng sinh Số chủng (+)/ Số chủng thử Tỷ lệ (%) CFP+CRO+CXM+CAZ+MA 45/45 100 CFP+CRO+CXM+MA 68/68 100 CRO+CXM+CAZ+MA 3/4 75 CFP+CRO+CAZ+MA 2/2 100 CFP+CXM+CAZ+MA 0/1 CRO+CXM+MA 26/28 92.9 CRO+CAZ+MA 3/14 21.4 CXM+CAZ+MA 0/1 CAZ+MA 5/8 62.5 CRO+MA 0/5 CXM+MA 0/1 CRO+CXM 1/1 100 CAZ 0/1 MA 4/16 25 157/195 80.5 TỔNG CFP: cefoperazone, CRO: ceftriaxone, CXM: cefuroxime, CAZ: ceftazidime, MA: cefamandole 33 Kết nghiên cứu cho thấy, tổng số 195 chủng vi khuẩn E Colitừ phân chuồng lợn kháng với kháng sinh thuộc nhóm cephalosporin, có 157 chủng có khả sản sinh men ESBL, chiểm 80.5% (bảng 4.7 hình 4.6) 35 Tỷ lệ (%) 30 Tỷ lệ (%) 25 20 15 10 MA CAZ CRO… CXM… CRO… CAZ+… CXM… CRO… CRO… CFP+… CFP+… CRO… CFP+… CFP+… Hình 4.6 Mối tương quan khả đa kháng kháng sinh nhóm cephalosporin tỷ lệ sản sinh men ESBL vi khuẩn E coli phân lập Kết nghiên cứu cho thấy chủng vi khuẩn E coli kháng đồng thời với nhiều loại kháng sinh cephalosporin khả sinh men ESBL cao Ngoài để khẳng định rõ việc có chủng vi khuẩn E coli kháng với loại kháng sinh cephalosporin có khả sản sinh ESBL, 25 chủng mẫn cảm với tất kháng sinh kiểm tra khả sản sinh ESBL Kết cho thấy 25 chủng khôngsản sinh ESBL (bảng 4.8) Hơn nữa, chủng E.coli kháng với kháng sinh cephalosporin hệ tỷ lệ sản sinh ESBL mức độ cao (86%), chủng kháng với cephalosporin hệ có khả sản sinh ESBL mức thấp, 4/17 chủng (chiếm 23.6%) Tỷ lệ phát vi khuẩn E coli sản sinh ESBL nghiên cứu 71.4% (bảng 4.8 hình 4.7) Kết nghiên cứu chúng tơi phù hợp với kết nghiên cứu giới, theo nghiên cứu MacKenzie et al (2002), 91% chủng E.coli kháng với cefoperazone, cefamandole, cefpodoxime cefpirome có khả sản sinh 34 ESBL Nghiên cứu Dahms(2015) cho thấy 70.6% chủng E.coli phân lập từ trang trại lợn gà có khả sản sinh ESBL Bảng 4.8 Khả sản sinh ESBLcủa chủng vi khuẩn E.coli phân lập tỷ lệ vớikhả mẫn cảm kháng sinh cephalosporin Chủng sinh ESBL/ số chủng thử Tỷ lệ (%) Mẫn cảm với tất kháng sinh Cephalosporin sử dụng nghiên cứu (cefoperazone, ceftriaxone, cefuroxime, ceftazidime, cefamandole) 0/25 Không mẫn cảm với cephalosporin hệ 2(Cefuroxime, Cefamandole) 4/17 23.6 Kháng với loại kháng sinh cephalosporin hệ 3(cefoperazone, ceftriaxone, ceftazidime) 153/178 Kháng với loại kháng sinh cephalosporin (cefoperazone, ceftriaxone, cefuroxime, ceftazidime, cefamandole) 195/220 Loại kháng sinh cephalosporin 86 80.6 Theo kết nghiên cứu chúng tôi, cho thấy tỷ lệ phát chủng có khả sản sinh ESBL liên quan trực tiếp đến mức độ mẫn cảm kháng với loại kháng sinh thuộc nhóm cephalosporin nghiên cứu (bảng 4.8) Tỷ lệ (%) 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 Tỷ lệ (%) Hình 4.7 Khả sản sinh ESBLcủa chủng vi khuẩn E.coli phân lập tỷ lệ với khả mẫn cảm kháng sinh cephalosporin 35 Trong nhân y, nhiều nghiên cứu tiến hành gần Việt Nam giới cho thấy vi khuẩn Gram âm, tỷ lệ mức độ kháng thuốc, đặc biệt đề kháng với kháng sinh cephalosporin hệ (những kháng sinh ưu tiên lựa chọn điều trị nhiễm khuẩn) có gia tăng đáng kể so với nhóm vi khuẩn loại không sinh ESBL Tỷ lệ đề kháng cephalosporin nhóm vi khuẩn ESBL (+) tìm thấy có tang mạnh nghiên cứu tác giả Hoàng Thị Phương Dung cs (2010); Võ Thị Chi Mai Ngô Thị Quỳnh Hoa (2010); Mai Văn Tuấn cs (2006) Với mức độ đề kháng cao vi khuẩn Gram âm Hiện nay, số khuyến cáo trình điều trị bệnh vật nuôi người cần sử dụng kết kháng sinh đồ, công cụ hữu hiệu để lựa chọn kháng sinh điều trị hiệu góp phần nâng cao hiệu chương trình kiểm sốt chủng vi khuẩn đa kháng thuốc Kết khảo sát kháng kháng sinh E coli sản sinh ESBL nghiên cứu chúng tơi cho thấy có mối liên quan rõ rệt mức độ đề kháng với kháng sinh cephalosporin khả sinh ESBL-enzyme có khả phân hủy cấu trúc vịng beta-lactam kháng sinh chủng vi khuẩn Tuy số lượng vi khuẩn E coli kiểm tra hạn chế, từ thực tế kết thu phần cho thấy mức độ kháng nhiều loại kháng sinh nhóm cephalosporin khả sinh men ESBL có nguy mang gen kháng thuốc chủng E coli Kết nghiên cứu kháng kháng sinh E colisản sinh ESBL nghiên cứu chúng tơi cho thấy có mối liên quan rõ rệt mức độ đề kháng với kháng sinh cephalosporin khả sinh ESBL-enzyme có khả phân hủy cấu trúc vòng beta-lactam kháng sinh chủng vi khuẩn Tuy số lựợng chủng vi khuẩn E coli kiểm tra chưa nhiều, từ thực tế kết thu phần cho thấy mức độ đề kháng kháng sinh chủng vi khuẩn có tương đương với vi khuẩn loại tiến hành công bố từ số nghiên khác Việt Nam thời gian gần 36 4.3 KẾT QUẢ PHÁT HIỆN GENE KHÁNG CEPHALOSPORIN Ở CÁC 70 60 50 40 30 20 10 CTX TEM CTX + TEM CHỦNG E COLI SẢN SINH MEN ESBL PHÂN LẬP ĐƯỢC Từ 195 chủng kháng với loại kháng sinh nhóm cephalosporin kiểm tra khả sản sinh men ESBL, 157 chủng cho kết dương tính Tại Hình số 4.8, có 108/157 chủng phát mang gen CTX, chiếm 68,8% 31/157 chủng mang gen TEM, chiếm 19.8% (Hình 4.8) Hơn kết nghiên cứu bảng cho thấy có 96/157 (61.2%) chủng E coli sản sinh ESBL mang gen CTX, 19/157 (12.1%) chủng mang gen TEM 12/157 (7.7%) chủng mang đồng thời gen CTX TEM Tại nghiên cứu không phát chủng E coli mang gen SHV (Hình 4.8 bảng 4.9) Bảng 4.9 Tỷ lệ phát chủng E.coli mang hai genes (CTX, TEM) kháng cephalosporin Số chủng kiểm tra Số chủng mang gen phát Tỷ lệ % CTX 157 96 61.2 TEM 157 19 12.1 CTX + TEM 157 12 7.7 Tổng 157 127 80.9 Gen kháng cephalosporin 37 Kết nghiên cứu chúng tơi cho thấy, nhóm kháng sinh cephalosporin nghiên cứu, vi khuẩn E coli cần kháng với loại (cefoperazone, ceftriaxone, cefuroxime, ceftazidime, cefamandole) mang hai genes (CTX, TEM).Trong đó, chủng kháng với ceftriaxone cefuroxime thường mang gen CTX, chủng E colikháng với cefuroxime chủng mang gen TEM, chủng kháng với cefamandole cefuroxime chủng thường mang gen CTX TEM Đây nhận xét ban đầu xuất gen kháng thuốc, cần có nghiên cứu với dung lượng mẫu lớn để khẳng định mối liên hệ mức độ kháng thuốc khả mang gen kháng vi khuẩn E.coli Kết nghiên phát gen kháng thuốc vi khuẩn E coli phân lập từ phân chuồng lợn thấp so với kết nghiên cứu gà Bùi Thị Lê Minh cs (2016) Trà Vinh Tác giả phát chủng E coli phân lập từ phân gà có mang gen với tỷ lệ cao, gen CTX (93.3%), TEM (90%), nhóm nghiên cứu phát gen SHV (16.7%) 90% chủng mang đồng thời gen CTX TEM Theo nghiên cứu Dahms et al (2015) tiến hành phân lập vi khuẩn E.colitrong mẫu phân lợn kiểm tra có 32 chủng mang gen CTX -M, 11 chủng mang gen TEM, có 10 chủng mang đồng thời gen CTX –M TEM Theo nghiên cứu tác giả Schmiedel et al (2014), 49,3% Enterobacteriaceae phân lập từ mẫu động vật cảnh (chó mèo) Đứcmang gen CTX 46,4% vi khuẩn Enterobacteriaceae phân lập từ chất thải mang gen TEM, ,trong 74% chủng vi khuẩn tìm thấy làE.coli Kết nghiên cứu tương tự với nghiên cứu Dahms et al (2015) Overdevest et al (2011) Hà Lan phát gen CTX gen có diện với tỷ lệ cao chủng E coli sinh men ESBL phân lập 38 PHẦN KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 KẾT LUẬN Tỷ lệ nhiễm E.coli kháng cefotaxime chất thải lợn thu thập chuồng 82% tương đương địa phương Thái Bình Sóc Sơn Tỷ lệ vi khuẩn E colimẫn cảm với loại kháng sinh nhóm cephalosporin kiểm tra 11,4% Tỷ lệ E coli kháng cefotaxime tiếp tục kháng với 1,2,3,4,5 loại kháng sinh khác nhóm cephalosporin có chiều hướng tăng, 7,7%, 6,8%, 19,5%, 34,1%, 20,5% Tỷ lệ vi khuẩn E coliphân lập từ phân chuồng lợn kháng với nhât loại cephalosporin khác cefotaxime, có khả sản sinh men ESBL 80.5% Nghiên cứu xác định 100% chủng kháng với loại kháng sinh cephalosporin hệ có khả sinh ESBL 97.3% chủng kháng loại hệ có khả sản sinh ESBL 4.Tỷ lệ vi khuẩn E coli mang gen CTX TEM chủng E.coli sản sinh ESBL nghiên cứu 68.8% 19.8% Trong đó, 61.2% số chủng E coli sản sinh ESBL mang gen CTX, 12.1% số chủng mang gen TEM, 7.7% số chủng mang đồng thời gen CTX TEM Tại nghiên cứu không phát chủng E coli mang gen SHV Vi khuẩn E coli kháng với loại (cefoperazone, ceftriaxone, cefuroxime, ceftazidime, cefamandole) nhóm kháng sinh cephalosporin mang hai genes (CTX, TEM) Trong đó, chủng kháng với ceftriaxone cefuroxime thường mang gen CTX, chủng E coli kháng với cefuroxime chủng mang gen TEM, chủng kháng với cefamandole cefuroxime chủng thường mang gen CTX TEM 5.2 ĐỀ NGHỊ Từ việc khảo sát thực tế chăn nuôi kết điều tra trạng ô nhiễm vi khuẩn kháng kháng sinh chăn nuôi tỉnh Thái Bình huyện Sóc Sơn, chúng tơi có số khuyến cáo đề nghị sau: - Cần thiết phải nâng cao nhận thức cách thường xuyên tổ chức hình thức tuyên truyền khác (tổ chức lớp tập huấn, tờ rơi, thông qua kênh truyền thông,…) cho người chăn nuôi sử dụng kháng sinh an tồn hợp lý cho vật ni 39 - Cần thiết áp dụng quy trình chăn ni an tồn sinh học chăn nuôi từ giống, thức ăn, chuồng trại, sử dụng chế phẩm sinh học thay kháng sinh, áp dụng phòng bệnh vaccin đầy đủ để giảm thiểu việc sử dụng kháng sinh cho đàn lợn - Tiếp tục xây dựng nghiên cứu sinh học phân tử sâu thực trạng ô nhiễm vi khuẩn mang gene kháng kháng sinh chăn nuôi gia súc, gia cầm Từ làm rõ chế truyền lây gene kháng kháng sinh lợn lồi vật ni khác vàxây dựng đồ kiểm sốt vi khuẩn kháng thuốc Việt Nam 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt: Bùi Thị Minh Lê, Lưu Hữu Mãnh, Nguyễn Nhựt Xuân Dung 2016 Khảo sát diện gen CTX-M, TEM SHV Escherichia coli sinh β–Lactamase phổ rộng phân lập từ gà Trà Vinh Tạp chí khoa học trường Đại học Cần Thơ.42b tr 1-6 Báo cáo Bộ Y tế Việt Nam phối hợp với dự án Hợp tác toàn cầu kháng kháng sinh GARP- Việt Nam Đơn vị Nghiên cứu Lâm sàng ĐH Oxford, tháng 10 – 2010 Báo cáo sử dụng kháng sinh kháng kháng sinh 15 bệnh viện Việt Nam năm 2008 – 2009” Võ Thị Chi Mai, Ngô Thị Quỳnh Hoa, Huỳnh Cơng Lý, Lê Kim Ngọc Giao Hồng Thị Phương Dung,2010,” Trực khuẩn đường ruột tiết β-lactamase phổ rộng (ESBL) gây nhiễm khuẩn chiếm đường ruột phân lập bệnh viện Chợ Rẫy” Tạp chí y học thành phố Hồ Chí Minh 14 (2) Trần Thị Thùy Giang, Nguyễn Thị Nguyệt, Nguyễn Văn Trí, Nguyễn Thị Lệ Hồ, cs, 1-6/2014 Khảo sát độ nhiễm khuẩn khả kháng kháng sinh E.coli phân lập từ thực phẩm Viện Pasteur, TP Hồ Chí Minh” Tạp chí khoa học ĐHSP TP Hồ Chí Minh (61) Trung, N Đ 2013 Phát gene blaTEM blaCTX-M chủng E coli K Pneumoniae phản ứng multiplex-PCR Tạp chí Y- Dược học quân (9) Mai Văn Tuấn., Nguyễn Thanh Bảo (2006), "Khảo sát trực khuẩn gram âm sinh men beta lactamase phổ rộng phân lập Bệnh viện Trung ƣơng Huế", Tạp chí Y học TP Hồ Chí Minh, 12 (1), pp 150 - 156 Mai, V.T.C., Cường, N.T., Hải, N.M., Giao, L.K.N 2006 Study for monitoring antimicrobial resistance trends, (SMART) bệnh viện Chợ Rẫy năm 2005 Báo cáo kết nghiên cứu bệnh viện Chợ Rẫy năm 2006 Nguyễn Tuấn Minh (2008), "Nghiên cứu vi khuẩn sinh men beta-lactamase phổ rộng gây nhiễm khuẩn hô hấp bệnh nhân thở máy", Luận văn Thạc sĩ y khoa Học viện Quân Y, Hà Nội Mai Văn Tuấn Nguyễn Thanh Bảo,2008 Khảo sát trực khuẩn gram âm sinh men – lactamase phổ mở rộng phân lập bệnh viện Trung ương Huế Tạp chí y học thành phố Hồ Chí Minh 12 (1) 41 10 Võ Thị Chi Mai., Ngô Thị Quỳnh Hoa., (2010), "Trực khuẩn đƣờng ruột tiết beta lactamase phổ rộng (ESBL) gây nhiễm chiếm cƣ đƣờng ruột phân lập Bệnh viện Chợ Rẩy", Tạp chí Y học TP Hồ Chí Minh 14 (2) 11 Mai Văn Tuấn Nguyễn Thanh Bảo,2008 Khảo sát trực khuẩn gram âm sinh men – lactamase phổ mở rộng phân lập bệnh viện Trung ương Huế Tạp chí y học thành phố Hồ Chí Minh 12 (1) Tài liệu Tiếng Anh: 12 Been, M.D, Val F., Lanza.2014 Dissemination of Cephalosporin resistance genes between Escherichia coli strains form farm animals and humans by specific plasmid lineages Published: December 18, 2014 http://dx.doi.org/10.1371/journal.pgen.1004776 13 Dahms.C, Hübner N, Kossow, A., Mellmann, A., Dittmann, K and Kramer, A 2015 Occurrence of ESBL-Producing Escherichia coli in livestock and farm workers in Mecklenburg-Western Pomerania, Germany Nov 25 doi: 10.1371/journal.pone.0143326 14 David M.L and Derek F.J.B 2001 Detection of B - lactamase - mediated resistance J antimicrobial chemotherapy 48, Suppl.Sl,59-64 15 Davies,J and Davies, D 2010 Origins and evolution of antibiotic resistance Microbiol Mol Biol Rev.;74(3): 417 – 433 16 Hasman, H., Mevius, D., Veldman, K., Olesen, I., and Frank M Aarestrup, F.M 2005 Beta-Lactamases among extended-spectrum b-lactamase (ESBL)-resistant Salmonella from poultry, poultry products and human patients in The Netherlands J of Antimicrob Chemother 56, 115–121 17 Hansen, K H., Damborg P., Andreasen M., Nielsen S.S., Guardabassi L.2013 Carriage and feacal counts of cefotaxime M-producing E Coli in pigs: A longitudinal study Applied and Environmental Microbiology 79 (3), 794–798 18 George A J , 2009 AmpC β-Lactamases, clin Microbiol Rev 22(1): 161-182 19 Leverstein-van Hall, M.A., Dierikx, C.M., Cohen-Stuart, J., Voets, G.M van den Munckhof, M.P., van Essen-Zandbergen, A., Platteel, T., Fluit, A.C., van de SandeBruinsma, N., Scharinga, J., Bonten, M.J., Mevius, D.J 2011 National ESBL surveillance group"Dutch patients, retail chicken meat and poultry share the same ESBL genes, plasmids and strains", Clin Microbiol Infect 17(6):873-80 42 20 MacKenzie, F M., Miller, F M., Gould, I M 2002 Comparison of screening methods for TEM and SHV derived ESBL detection Clin Microbiol Infect 8, 715-724 21 Schmiedel,J., Falgenhauer,L., Domann, E., Bauerfeind,R., Prenger-Berninghoff, E., Imirzalioglu, C and Chakraborty, T 2014 Multiresistant extwnded – spectrum β-lactamase – producing Enterobacteriaceae from humans, companion animals and horses in central Hesse, Germany BMC micromiedel 2014 14:187 22 Vanessa B, Mesa R, Saco M, Lavilla S, et al., 2006 ESBL – and plasmidic class C β- lactamase – producing E.coli strains isolated from poultry, pig and rabbit farms Veterinary Microbiology 118, pp 299-304 23 Knother H., Shah P., Kremery V., Antal M., Mitsuhashi S (1983), “Transferable resitance to cefotaxime, cefoxitin, cefamandole and cefuroxime in clinical isolates of Klebsiella pneumoniae and Seratia marcescen”, Infection, 11, pp 315-317 24 Lartigue, Marie-Frédérique, Poirel L., Nordmann P (2004), "Diversity of genetic environment of blaCTX-M genes", FEMS Microbiology Letters, 234(2), pp 201-207 25 Lautenbach E., Patel J.B., Bilker W.B., Edelstein P.H., Fishman N.O (2001), "Extended-spectrum β-lactamase-producing Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae: risk factors for infection and impact of resistance on outcomes", Clinical Infectious Diseases, 32(8), pp 1162-1171 26 Li X Z., Mehrotra M., Ghimire S., Adewoye L (2007), “β-Lactam resistance and β-lactamases in bacteria of animal origin”, Vet Microbiol, 121, pp 197–214 27 Martins L R, Pina S M, Simões R L, de Matos A J., Rodrigues P., da Costa P M (2013) “Common phenotypic and genotypic antimicrobial resistance patterns found in a case study of multiresistant E coli from cohabitant pets, humans, and household surfaces”, J Environ Health, 75(6), pp 74-81 28 Matsumoto Y., Ikeda F., Kamimura T., Yolota Y., Mine Y., (1988), “Novel plasmid-mediated β-lactamase from Escherichia coli that inactivates oxyiminocephalosporins”,Antimicrob Agents Chemother,32, pp 1243–1246 29 Melzer, M and Petersen, I 2007 Mortality following bacteraemic infection caused by extended spectrum beta-lactamase (ESBL) producing E coli compared to non-ESBL producing E coli J Infect 2007 55, 254–259 43 30 Mroczkowska, Joanna E., and Miriam Barlow "Fitness trade-offs in blaTEM evolution." Antimicrobial agents and chemotherapy 52.7 (2008): 2340-2345 31 Paterson D L, Bonomo R A (2005), “Extended-Spectrum ß–lactamases: a Clinical Update”, Clin Microbio Rev, 18, pp 657-686 32 Paterson, David L (2006), "Resistance in gram-negative bacteria: Enterobacteriaceae", The American journal of medicine, 119(6), pp S20-S28 33 Pitout J D., Laupland K B (2008), “Extended-spectrum beta-lactamaseproducing Enterobacteriaceae: an emerging public-health concern”, Lancet Infect Dis, 8, pp 159–166 34 Sambrook J., Fritsch E F., Maniatis T (1989), “Molecular cloning old spring harbor laboratory press” 2, pp 14-9 35 Schmitt, Joachim, Jacobs E., Schmidt H., (2007), "Molecular characterization of extended-spectrum beta-lactamases in Enterobacteriaceae from patients of two hospitals in Saxony, Germany", Journal of medical microbiology 56(2), pp 241-249 36 Son, T.T D, Dung, V T., Madsen, H., and Dalsgaard, A 2011 Survival of fecal indicator bacteria in treated pig manure stored in clay-covered heaps in Vietnam Veterinary Microbiology 152, 374-378 37 Son, T T D., Petersen, A., Dung,V.T, Huong, T.T.C., and Dalsgaard, A 2011 Impact of medicated feed on the development of antimicrobial resistant bacteria in integrated pig-fish farms in Vietnam Applied Environmental Microbiology 77, 4494-4498 38 Su, Su Z., Dai X., Chen J., Kong F., Wang H., Li Y., Peng S., Wang S., Shao Q., Lv L., Xu H (2008), "The blaCTX-M-1 gene located in a novel complex class I integron bearing an ISCR1 element in Escherichia coli isolates from Zhenjiang, China" Journal of antimicrobial chemotherapy 62(5), pp 1150-1151 39 Trang, Nguyen Hoang Thu, et al "The characterization of ESBL genes in Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae causing nosocomial infections in Vietnam." The Journal of Infection in Developing Countries 7.12 (2013): 922-928 40 Tzelepi, E., Gaikkoupi, P., Sofianou, D., Loukova, V., Kemeroglou, A., Tsakris ,A 2000 Detection of extended spectrum β-lactamases in clinical isolates of Enterobacter Cloacaeand Enterobacter aerogenes J Clin Microbiol 38(2), 542-546 41 WHO (2002), Use of antimicrobials outside human medicine and resultant antimicrobial resistance in humans, Geneva 44 PHỤ LỤC Hình ảnh kết phản ứng PCR phát gen CTX vi khuẩn E coli 1000b 964bp (Mẫu 44, 45,47, 48, 50 chủng E coli phân lập lợn Thái Bình Mẫu 46, 49 chủng E coli phân lập người Thái Bình Mẫu 52, 53, 55, 57 chủng E coli phân lập lợn Sóc Sơn Mẫu 51, 54, 56, 58 chủng E coli phân lập Sóc Sơn) Kết phát gen TEM số chủng E coli phản ứng PCR 593bp 500bp (Các mẫu 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158 chủng E coli phân lập lợn Sóc Sơn) 45 ... văn: Nghiên cứu mối liên hệ đa kháng với tỷ lệ phát gen nhóm Cephalosporin vi khuẩn Escherichia coli phân lập đươck từ chất thải lợn Ngành : Thú y Mã số : 60 64 01 01 Tên sở đào tạo: Học Vi? ??n... vi khuẩn E coli có khả sản sinh men ESBL Vi? ??t Nam thực số sở y tế Đề tài: " Nghiên cứu mối liên hệ đa kháng với tỷ lệ phát gen nhóm Cephalosporin vi khuẩn Escherichia coli phân lập đươck từ chất. .. để khẳng định mối liên hệ mức độ kháng thuốc khả mang gen kháng vi khuẩn E .coli Kết nghiên phát gen kháng thuốc vi khuẩn E coli phân lập từ phân chuồng lợn thấp so với kết nghiên cứu gà Bùi Thị