Mục tiêu nghiên cứu nhằm khảo sát mức độ nhạy của candida spp. phân lập từ bệnh nhân nhiễm nấm tại 5 Bệnh viện ở TP. HCM. với fluconazole. Định danh các chủng candida kháng fluconazole bằng PCR.
Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 16 * Phụ Số * 2012 Nghiên cứu Y học KHẢO SÁT MỨC ĐỘ NHẠY CẢM CỦA CANDIDA SPP VỚI FLUCONAZOLE Nguyễn Thị Thúy Anh*, Trần Cát Đông**, Nguyễn Đinh Nga** TÓM TẮT Đặt vấn đề: Việc sử dụng thường xuyên fluconazole điều trị nguyên nhân gây kháng thuốc Candida albicans Candida non albicans Mục tiêu nghiên cứu: Khảo sát mức độ nhạy Candida spp phân lập từ bệnh nhân nhiễm nấm Bệnh viện TP HCM với fluconazole Định danh chủng Candida kháng fluconazole PCR Vật liệu phương pháp: Mức độ nhạy 129 chủng Candida với fluconazole thực phương pháp khuếch tán theo NCCLS M44-A Định danh chủng Candida non albicans giải trình tự vùng ITS Kết quả: 93.64% chủng Candida albicans thử nghiệm nhạy với fluconazole 5/19 chủng Candida non albicans kháng fluconazole có trình tự ITS tương đồng với trình tự ITS lồi Candida glabrata Candida tropcalis Bàn luận kết luận: Tỷ lệ Candida non albicans kháng fluconazole cao C albicans Vì cần sử dụng mơi trường thích hợp để định danh Candida thực kháng sinh đồ để chọn thuốc kháng nấm thích hợp Từ khóa: Candida albicans, Candida non albicans, fluconazole, MHA – GMB,PCR ABSTRACT SURVEY ON SUSCEPTIBILITY OF CANDIDA SPP TO FLUCONAZOLE Nguyen Thi Thuy Anh, Tran Cat Dong, Nguyen Đinh Nga * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 16 - Supplement of No - 2012: 83 - 85 Background: Over the past few decades, Candida spp are the most common of fungal pathogens and the emergence of drug resistant Candida spp become an important problem in therapy Objective: to determine the antifungal susceptibility of Candida isolates to fluconazole Material and methods: The antifungal activity against 129 trains of Candida spp of fluconazole were determined by the Disk diffusion method according to the guidline of NCCLS M44-A The PCR amplification of the internal transcribed spacers (ITS1 and ITS2) is used for species identification Outcome: 93,64% of Candida albicans were sensible to fluconazole 5/19 resistant strains are identified belong to Candida glabrata and Candida tropicalis Conclusion: Disk diffusion test are simple to set up to propose a reasonable antifungal agent for physicians Key words: Candida albicans, Candida non albicans, MIC, MHA-GMB, MHB-GMB chóng từ đầu thập niên 1990 đến nay, đặc biệt ĐẶT VẤN ĐỀ người suy giảm miễn dịch Một số báo cáo Bệnh Candida gây gia tăng nhanh nước cảnh báo việc sử dụng fluconazole Trường Đại học Khoa học tự nhiên Đại học Y Dược TP HCM Tác giả liên lạc: TS Nguyễn Đinh Nga ĐT: 0908 836969 Email: nganguyendinh@yahoo.com Chuyên Đề Ký Sinh Trùng 83 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 16 * Phụ Số * 2012 thường xuyên điều trị, cộng với tỉ lệ bệnh Candida non albicans có khuynh hướng tăng dần(1,6) nguyên nhân làm kéo dài thời gian thất bại điều trị bệnh Candida Để tìm hiểu mức độ đáp ứng Candida phân lập từ số bệnh nhân Việt Nam với fluconazole, phạm vi đề tài khảo sát mức độ nhạy Candida spp với fluconazole in vitro ĐỐI TƯỢNG -PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu 129 chủng Candida spp phân lập từ bệnh nhân nhiễm Candida bệnh viện TP Hồ Chí Minh từ tháng đến tháng năm 2011 Candida albicans ATCC 10231, sử dụng làm chủng đối chứng, nhạy với fluconazole với đường kính vòng kháng nấm từ 38-40 mm Chất kháng nấm Fluconazole USP, lô FLU-09 12 085, hàm lượng 99,41% Môi trường Mueller Hinton Broth (Merck) CzapeckDox ((Merck) Phương pháp nghiên cứu Để xác định mức độ nhạy Candida spp với fluconazolee Chúng sử phương pháp khuếch tán theo hướng dẫn NCCLS M44-A(2, 4) với điều kiện thử nghiệm sau: Đĩa giấy tẩm fluconazole 25 µg, thạch Mueller Hinton bổ sung 2% glucose xanh methylen µg/ml (MHA-GMB) Đo đường kính vòng ức chế sau 24 ủ 370C Dựa vào đường kính vòng ức chế, mức độ nhạy Candida spp với fluconazole NCCLS M44 chia thành mức, nhạy (S) đường kính vòng ức chế ≥ 19 mm; nhạy tùy thuộc liều (SDD) đường kính vòng ức chế từ 15-18 mm đề kháng (R) với đường kính vòng ức chế ≤ 14 mm 84 Định danh Candida spp Phân nhóm Candida albicans Candida non albicans: Dựa vào đặc điểm sợi nấm giả - bào tử bao dầy môi trường thạch bột ngô tạo ống mầm huyết sau 3-4 ủ 37 oC(5) Đinh danh Candida non albicans đến mức loài PCR(3): Sử dụng cặp mồi ITS1 (5’ TCC GTA GGT GAA CGT GCG G 3’) ITS4 (5' TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC 3') Phản ứng PCR thực ống eppendorf 0.2 ml với thể tích hỗn hợp 50 l có thành phần phản ứng sau: M mồi, 0,5 mM dNTP, mM MgSO4 ,1X buffer 1U Taq Polymerase Tiền biến tính DNA 950C, 10 phút, chu kỳ Chu kỳ khuếch đại gồm 30 chu kỳ: biến tính 950C, 45 giây, gắn mồi 500C, 45 giây, kéo dài 720C, phút, hoàn chỉnh 720C, 10 phút, chu kỳ Sản phẩm tinh ADN đem gửi giải trình tự cơng ty Macrogen, Hàn Quốc Kết giải trình tự nhận biết phần mềm Lasergene 7.1 công cụ BLAST (NCBI) KẾT QUẢ Phân nhóm Candida spp Trong 129 chủng Candida spp ly trích từ bệnh nhân, 110/129 chủng thuộc Candida albicans 19/129 chủng thuộc Candida non albicans Mức độ nhạy cảm Candida spp với fluconazole Kết bảng cho thấy có ba chủng C albicans phân lập từ bệnh nhân nhiễm HIV chủng C albicans từ bệnh nhân lao bệnh viện Phạm Ngọc Thạch kháng fluconazole, chiếm 3,64% Nếu tính số ca phân lập từ phết họng bệnh nhân HIV bệnh viện Nhiệt Đới, có 11.43% trường hợp C albicans nhạy với fluconazole Tỉ lệ thấp 1/2 so với báo cáo Trần Phủ Mạnh Siêu (26,67%)(6) Chuyên Đề Ký Sinh Trùng Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 16 * Phụ Số * 2012 Nghiên cứu Y học (93,64%) (2,73%) (3,64%) (73,68 (26,32%) %) Bảng Mức độ nhạy Candida spp với fluconazole Số chủng Candida spp đáp ứng với tác động fluconazole Nguồn phân C non albicans lập C albicans (n = 110) (n=19) S SDD R S R Bệnh viện Q4 15 0 0 (n=15) BV Nhiệt Đới 31 14 (n=52) BV Phạm Ngọc Thạch 23 (n=26) BV Pháp Việt 28 0 (n=30) Bệnh viện X 0 0 (n=7) Tổng cộng 104 14 Tỉ lệ Candida non albicans nhạy kháng fluconazole cao C albicans Theo Trần Phủ Mạnh Siêu(6), chủng C tropicalis phân lập từ phết họng phết lưỡi bệnh nhân HIV bệnh viện Nhiệt Đới, 25% chủng kháng fluconazole Ở nghiên cứu chúng tôi, chủng kháng fluconazole chiếm khoảng 26,32% Định danh chủng Candida non albicans giải trình tự vùng ITS Năm chủng Candida non albicans kháng fluconazole gồm PNT20, PNT31, PNT33, ND31, ND32 để giải trình tự vùng ITS Vì vùng ITS kích thước ngắn nên dùng phản ứng với mồi tương ứng cho mẫu Bảng Kết định danh chủng Candida non albicans Chủng ND31 Description Max score 1282 Total score 1282 Querry coverage 100% E value 0.0 Max ident 99% C glabrata ND32 C glabrata 1079 1079 100% 0.0 99% PNT20 C tropicalis 693 693 100% 0.0 98% PNT31 C tropicalis 800 800 97% 0.0 98% PNT33 C tropicalis 728 728 100% 0.0 99% Dựa Query coverage, Max ident cao E value thấp theo kết bảng 3: Hai chủng ND31, ND32 có gần đồng trình tự ITS với Candida glabrata Ba chủng PNT 20, PNT 31, PNT 33 có gần đồng trình tự ITS với C tropcalis Candida glabrata Candida tropcalis loài thường gây bệnh người suy giảm miễn dịch, gây khó khăn cho việc điều trị Do vậy, để điều trị cho đối tượng bệnh nhân này, cần sử dụng mơi trường thích hợp để định danh Candida thực kháng sinh đồ để chọn thuốc kháng nấm thích hợp TÀI LIỆU THAM KHẢO Infect Dis., 58: 344-348 Ernst EJ ( 2007) Methods in Molecular medicine In: Ernst EJ Rogers PD Antifungal agent - methods and protocols, Vol.188, pp 3-12 Humana Press Inc, Totowa, NJ Korabecna M (2007) The Variability in the Fungal Ribosomal DNA (ITS1, ITS2 and 5.8S rRNA Gene): its Biological Meaning and Application in Medical Mycology Communicating Current Research and Educational Topics and Trends in Applied Microbiology A Méndez – Villas (Ed) NCCLS (2004) Method for antifungal disk diffusion susceptibility testing of yeasts; approved guideline NCCLS document M44-A, NCCLS, Wayne, PA, 19087-1898 Pfaller MA, McGinnis MR (2003) The laboratory and clinical mycology In: Anaissie EJ, McGinnis MR & Pfaller M.A Clinical Mycology, p 55-74 Churchill Livingstone Trần Phủ Mạnh Siêu, Hồ Quang Thắng (2010) Tình hình nhiễm vi nấm Candida spp bệnh nhân nhập viện Bệnh viện Nhiệt Đới TP HCM năm 2009 Tạp chí Y học, phụ số 1, tập 14, tr 206-212 Capoor MR et al (2005) Emergence of Non-albicans Candida Species and antifungal resistance in a tertiary care hospital Jpn J Chuyên Đề Ký Sinh Trùng 85 ... bệnh nhân Việt Nam với fluconazole, phạm vi đề tài khảo sát mức độ nhạy Candida spp với fluconazole in vitro ĐỐI TƯỢNG -PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu 129 chủng Candida spp phân lập... Phân nhóm Candida spp Trong 129 chủng Candida spp ly trích từ bệnh nhân, 110/129 chủng thuộc Candida albicans 19/129 chủng thuộc Candida non albicans Mức độ nhạy cảm Candida spp với fluconazole. .. chế, mức độ nhạy Candida spp với fluconazole NCCLS M44 chia thành mức, nhạy (S) đường kính vòng ức chế ≥ 19 mm; nhạy tùy thuộc liều (SDD) đường kính vòng ức chế từ 15-18 mm đề kháng (R) với đường