Nghiên cứu với mục tiêu xác định tỷ lệ kiểu hình LDL nhỏ, đậm đặc ở đối tượng hội chứng mạch vành cấp (HCMVC) người Việt Nam và xác định mối liên quan kích thước trung bình hạt LDL với độ nặng của bệnh cảnh lâm sàng và các yếu tố nguy cơ bệnh động mạch vành.
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Số 6 * 2013 Nghiên cứu Y học PHÂN TÍCH KIỂU HÌNH LIPOPROTEIN TỶ TRỌNG THẤP BẰNG KỸ THUẬT ĐIỆN DI TRONG ỐNG THẠCH POLYACRYLAMIDE Ở BỆNH NHÂN HỘI CHỨNG MẠCH VÀNH CẤP Trần Thành Vinh*, Đặng Vạn Phước **, Phan Thị Danh* TĨM TẮT Mục tiêu: Xác định tỷ lệ kiểu hình LDL nhỏ, đậm đặc ở đối tượng hội chứng mạch vành cấp (HCMVC) người Việt Nam và xác định mối liên quan kích thước trung bình hạt LDL với độ nặng của bệnh cảnh lâm sàng và các yếu tố nguy cơ bệnh động mạch vành. Phương pháp và đối tượng nghiên cứu: Nghiên cứu phân tích cắt ngang bằng kỹ thuật điện di trong ống thạch polyacrylamide, phân tích dưới nhóm LDL trên 309 bệnh nhân người Việt Nam có hội chứng mạch vành cấp: 204 nam, 105 nữ, tuổi trung bình 63 13 tuổi (nhóm bệnh) và 72 người tình nguyện khơng bị hội chứng mạch vành cấp, được chọn tương đương với nhóm bệnh về độ tuổi, giới, tỷ lệ cao huyết áp và bệnh đái tháo đường (nhóm chứng). Thu thập mẫu từ tháng 1/2011 đến tháng 11/2011 tại bệnh viện Chợ Rẫy. Kết quả: Kích thước trung bình LDL trong huyết tương có phân phối chuẩn ở cả hai nhóm đối tượng và ở bệnh nhân HCMVC (257,5 14,3 Ao) nhỏ hơn có ý nghĩa so với nhóm khơng bệnh HCMVC (261,7 8,2 Ao). Bệnh cảnh lâm sàng càng nặng kích thước hạt LDL càng nhỏ: khơng bệnh HCMVC (261,7 8,2 Ao), Đau thắt ngực khơng ổn định (258,9 13 Ao), nhồi máu cơ tim khơng ST chênh lên (258,7 11,5 Ao) và nhồi máu cơ tim có ST chênh lên (257,0 14,3 Ao). Kích thước trung bình LDL liên quan đến giới tính ở nhóm có HCMVC và tình trạng béo bụng ở cả hai nhóm đối tượng; khơng liên quan tuổi, tình trạng hút thuốc lá, q cân, bệnh cao huyết áp, đái tháo đường. Kích thước trung bình LDL cũng có tương quan thuận với nồng độ HDL‐cholesterol (r = 0,26) và nghịch với nồng độ triglyceride (r=‐0,39) và cholesterol tồn phần (r =‐0,29), khơng tương quan với nồng độ LDL‐cholesterol huyết tương. Tỷ lệ kiểu hình LDL nhỏ, đậm đặc ở bệnh nhân hội chứng mạch vành cấp là 46,3 % cao hơn so với nhóm chứng 40,3% Kết luận: Kiểu hình LDL nhỏ, đậm đặc có liên quan đến hội chứng mạch vành cấp và các yếu tố nguy cơ tim mạch như giới tính, tình trạng béo bụng, nồng độ triglyceride, HDL cholesterol và cholesterol toàn phần trong huyết tương. Từ khóa: Lipoprotein tỷ trọng thấp; dưới nhóm LDL; LDL nhỏ, đậm đặc; hội chứng mạch vành cấp. ABSTRACT ANALYSIS OF LOW DENSITY LIPOPROTEIN PHENOTYPES BY POLYACRYLAMIDE TUBE GEL ELECTROPHORESIS IN PATIENTS WITH ACUTE CORONARY SYNDROME Tran Thanh Vinh, Dang Van Phuoc, Phan Thi Danh * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 17 ‐ No 6 ‐ 2013: 295 – 303 Objective: To determine the prevalence of small, dense Low Density Lipoprotein (LDL) in Vietnamese patients with Acute Coronary Syndrome (ACS). Subsequently evaluate whether there is a significant correlation between patients with clinically severe ACS, patients with associated risk factors linked to ACS and increased levels of small LDL particles. Methodology: A cross‐section analysis was undertaken using polyacrylamide gel tube electrophoresis. * Khoa Hóa Sinh – BV Chợ Rẫy ** Đại Học Y Dược TP. HCM Tác giả liên lạc: ThS. BS Trần Thành Vinh ĐT: 0908487348 Email: thanhvinhtran2002@yahoo.com Hội Nghị Khoa Học Cơng Nghệ BV. Nhân Dân Gia Định năm 2013 295 Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Số 6 * 2013 Results were derived from a patient group made up of 309 (205 males and 105 females) Vietnamese patients with ACS, aged 63 13 years. As a control, 72 (29 males and 43 females) Vietnamese volunteers were tested and matched for age, gender, hypertension rate and diabetes mellitus. All samples were taken during the period between January 2011 and November 2011 at Cho Ray Hospital. Results: There was an increased prevalence of small, dense LDL type in patients with ACS (46.3%) compared with control subjects (40.3%). The frequency distributions of mean LDL particle sizes taken from plasma samples across the patient and control groups were normal. The mean LDL particle size in plasma samples from patients with ACS (257.5 14.3 Ao) was significantly smaller than people without ACS (261.7 8.2 Ao). When comparing the mean LDL particle size across the various clinical conditions (non ACS 261.7 8.2 Ao, unstable angina 258.9 13 Ao, non ST elevation myocardial infarction 258.7 11.5 Ao and ST elevation myocardial infarction subgroup 257.0 14.3 Ao) results indicated a significant difference. Results also suggest a strong relationship between the mean LDL particle size with gender in ACS patients and waist to hip ratio in both study groups, but not with age, body mass index, smoking history or diabetes mellitus. There was a negative correlation between the mean LDL particle size and triglyceride (r =‐0.39), total cholesterol (r = ‐0.29) while a positive correlation was found in plasma samples with High Density Lipoprotein (HDL) ‐ cholesterol levels. There was no significant correlation between the mean LDL particle sizes in plasma samples with LDL‐cholesterol levels. Conclusions: Results suggest a positive relationship between the prevalence of small, dense LDL type particle size and the risk of ACS. More specifically mean LDL particle size showed an association with clinical conditions. The mean size of LDL particles was noticeably larger in males than female in ACS cases and smaller LDL particles where generally found in those with higher waist to hip ratios. There was also a correlation between LDL particle size and the levels of triglyceride, total cholesterol, HDL‐cholesterol. Key words: LDL sub fractions; LDL subclass phenotypes; small, dense LDL; polyacrylamide tube gel electrophoresis; gradient gel electrophoresis; coronary heart disease; acute coronary syndrome xơ vữa cao hơn, do đó người ta rất quan tâm đến Lipid, lipoprotein đóng vai trò quan trọng kiểu hình LDL trong chương trình kiểm sốt các trong sinh bệnh học của bệnh tim mạch, trong rối loạn lipid, lipoprotein(10), ATP III (Adult đó rối loạn lipid, lipoprotein được xem là yếu tố nguy cơ chính của bệnh mạch vành(14). Việc tầm Treatment Panel III) xem kiểu hình LDL nhỏ, soát và đánh giá kết quả điều trị các rối loạn này đậm đặc là yếu tố nguy cơ nổi bật của bệnh là quan trọng và thường quy trong cơng tác mạch vành. Các nghiên cứu đồn hệ và cắt phòng bệnh, và dựa hồn tồn vào các xét ngang trước đây đều nhận thấy kiểu hình LDL nghiệm phân tích chúng. nhỏ, đậm đặc có tính gây xơ vữa gấp 2‐3 lần so (1,5,6,9) với các LDL lớn, nhẹ Lipid được vận chuyển trong tuần hồn dưới dạng các hạt lipoprotein khơng đồng nhất Trong một thời gian dài người ta tìm cách về thành phần, kích thước và sinh bệnh học. Có phân tích LDL một cách có hiệu quả, tuy nhiên năm loại lipoprotein (Lp) theo tỷ trọng gồm các xét nghiệm chỉ đạt đến việc định lượng chylomicron, Lp tỷ trọng rất thấp (VLDL), Lp tỷ cholesterol, một lipid chiếm tỷ lệ nhiều nhất trọng trung bình (IDL), Lp tỷ trọng thấp (LDL) trong hạt LDL (40‐47%), và sau đó là LDL‐ và Lp tỷ trọng cao (HDL), trong đó LDL được cholesterol và apolipoprotein B (apo B) là thành xem là nhóm có tính sinh bệnh học cao nhất do phần cholesterol và protein có trong hạt LDL, mang đến 70‐78% cholesterol của tuần hoàn và tuy nhiên tác giả Otvos J và các cộng sự đăng có tính xâm nhập thành mạch cao. LDL là một trên tạp chí tim mạch học Hoa Kỳ năm 2002 cho nhóm các hạt khơng đồng nhất về cấu tạo, hạt thấy các xét nghiệm này là gián tiếp cho kết quả nhỏ hơn có cấu trúc đậm đặc hơn và có tính gây ước tính dưới mức nguy cơ thật sự. Trong khi 296 Hội Nghị Khoa Học Cơng Nghệ BV. Nhân Dân Gia Định năm 2013 Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Số 6 * 2013 đó, các xét nghiệm khảo sát trực tiếp LDL và các dưới nhóm của nó (LDL subclasses) chỉ có tại các viện nghiên cứu lớn do u cầu khắc khe về kỹ thuật, tốn nhiều thời gian và các trang thiết bị đắt tiền. Ngày nay nhờ tiến bộ trong kỹ thuật người ta đã có thể phân tích các thành phần Lp và các dưới nhóm khá dễ dàng trên các hệ thống tự động, điều này giải quyết hầu hết các nhược điểm nêu trên và tạo điều kiện cho việc bắt đầu ứng dụng trên lâm sàng. Có ba kỹ thuật phổ biến trên thế giới để phân tích Lp là siêu ly tâm, điện di và cộng hưởng từ hạt nhân. Kỹ thuật thích hợp nhất cho ứng dụng lâm sàng là điện di trên thạch polyacrylamide. Các nghiên cứu trước đây cho thấy kiểu rối loạn lipid, lipoprotein ở người Việt Nam không giống với các nước phát triển(13,12) và việc phân tích các Lp tại Việt Nam còn hạn chế, chưa thấy cơng bố phân tích dưới nhóm LDL. ĐỐI TƯỢNG ‐ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU * Phương pháp Phân tích cắt ngang, tiền cứu trên đối tượng bệnh nhân hội chứng mạch vành cấp và người khơng có bệnh hội chứng mạch vành cấp người Việt Nam tại bệnh viện Chợ Rẫy, thời gian từ tháng 01/2011 đến tháng 11/2011. * Đối tượng nghiên cứu ‐ Đối tượng là bệnh nhân được chẩn đoán xác định hội chứng mạch vành cấp tại khoa Nội Tim Mạch và Khoa Can Thiệp Tim Mạch bệnh viện Chợ Rẫy chưa điều trị bằng statin, tiền căn khơng dùng thuốc liên quan đến lipid như thuốc hạ lipid, ngừa thai, chẹn , lợi tiểu. Khơng mắc các bệnh cấp hay mãn tính trừ cao huyết áp và đái tháo đường là hai yếu tố nguy cơ chính của bệnh mạch vành(14). Bệnh nhân ký đồng ý tham gia nghiên cứu (hoặc người nhà ký trong trường hợp bệnh nhân không thể ký được). Loại ra khỏi nghiên cứu nếu từ chối tham gia nghiên cứu (khơng cần giải thích lý do) hoặc phát hiện có bệnh đi kèm trừ hai bệnh nêu trên. Chuyển sang nhóm chứng nếu có bằng chứng xác định hội chứng mạch vành cấp do co thắt mạch vành mà Nghiên cứu Y học khơng có tổn thương (qua kết quả chụp mạch vành trong q trình can thiệp). Đau thắt ngực khơng ổn định Là đau ngực xảy ra cả những lúc nghĩ ngơi hoặc gắng sức nhẹ, kéo dài trên 20 phút nếu không cắt cơn bằng nitroglycerin, hoặc triệu chứng đau thắt ngực nặng và mới xảy ra trong vòng 1 tháng, đau thắt ngực ổn định nhưng ngày càng nặng hơn: đau nhiều hơn, kéo dài hơn hay nhiều cơn trong ngày hơn, hay điện tâm đồ có đoạn ST chênh xuống nhưng khơng có dấu hoại tử cơ tim. Nhồi máu cơ tim Theo tổ chức Y Tế Thế Giới NMCT được chẩn đốn khi hội đủ 2 trong 3 tiêu chuẩn sau: (1) Lâm sàng có đau thắt ngực kiểu mạch vành với cường độ lớn hơn, thời gian kéo dài hơn 15‐ 30 phút và khơng giảm đau khi nghỉ ngơi hoặc ngậm dưới lưỡi nitroglycerin. (2) Điện tâm đồ: phù hợp với nhồi máu cơ tim (NMCT) hoặc thiếu máu cơ tim. (3) Tăng men tim đặc hiệu cho tổn thương cơ tim (Troponin I,T và CK‐MB). ST chênh lên ST chênh lên mới hoặc giả định là mới sau điểm J, ≥ 2 chuyển đạo liên tiếp, ≥ 1mm ở các chuyển đạo V1, V2, V3 hoặc ≥ 2mm ở các chuyển đạo khác. Bệnh nhân được chia thành 3 nhóm theo mức độ nặng lâm sàng: đau thắt ngực không ổn định (ĐTNKOĐ), nhồi máu cơ tim không ST chênh lên (NMCTKSTC) và nhồi máu cơ tim ST chênh lên (NMCTSTC). ‐ Nhóm chứng là những người tham gia khám sức khỏe định kỳ tại bệnh viện Chợ Rẫy, tình nguyện tham gia nghiên cứu. Được ghi nhận tiền căn và hiện tại khơng có dấu hiệu của bệnh mạch vành (khơng đau ngực, kết quả điện tim không dấu hiệu thiếu máu, men tim trong giới hạn bình thường). Nhóm chứng được chọn tương đồng với nhóm bệnh về các chỉ số giới, tuổi, tỷ lệ cao huyết áp và mắc bệnh đái tháo đường. Hội Nghị Khoa Học Cơng Nghệ BV. Nhân Dân Gia Định năm 2013 297 Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Số 6 * 2013 Nghiên cứu Y học Thu thập dữ liệu và lấy mẫu Các đối tượng nghiên cứu được khai thác tiền sử, bệnh sử (chú ý thời gian khởi bệnh), q trình dùng thuốc và điều tra các yếu tố nguy cơ (hút thuốc, uống rượu, bệnh mãn tính) theo mẫu soạn sẵn. Mẫu máu tĩnh mạch sau ăn 12‐14 giờ được lấy vào ống có chống đơng EDTA. Ly tâm 3000 vòng/phút trong 15 phút và chiết huyết tương để thực hiện xét nghiệm định lượng các lipid (cholesterol, triglyceride, HDL‐cholesterol), điện di phân tách dưới nhóm LDL. Mẫu huyết thanh khơng làm ngay có thể trữ 2‐8oC được 1 tuần. Cân nặng, đo chiều cao, vòng eo (VE), vòng hơng (VH). BMI {body mass index = cân nặng (Kg)/(chiều cao(m))2} được chia thành 2 mức độ: bình thường 0,9; nữ > 0,8. Tình trạng hút thuốc: có hút là đang hút hoặc đã từng hút, còn khơng hút là chưa bao giờ hút thuốc. Uống rượu: nghiện rượu là hầu như ngày nào cũng uống, ngoài ra được xem là không nghiện rượu. Cao huyết áp là theo tiêu chuẩn JNC VII ‐2003 (huyết áp tâm thu ≥ 140 mmHg và/hoặc huyết áp tâm trương ≥ 90 mmHg) hoặc đang dùng thuốc hạ áp trong 2 tuần hoặc có chẩn đốn của Bác Sỹ. Đái tháo đường được xác định theo tiêu chuẩn WHO ‐ 1997 (đường huyết khi đói ở hai lần thử khác nhau ≥ 126 mg/dL hoặc nghiệm pháp dung nạp glucose ở giờ thứ hai ≥ 200 mg/dL) hoặc đang dùng insulin hay thuốc hạ đường huyết dạng uống, có chẩn đốn của Bác Sỹ. Phương pháp xét nghiệm + Xét nghiệm định lượng cholesterol, triglycerides, high density lipoprotein‐ cholesterol (HDL‐c) tại khoa Sinh Hóa bệnh viện Chợ Rẫy bằng phương pháp enzym trên máy Hitachi 917 với thuốc thử của hãng BioLabo, nội kiểm 2 mức nồng độ (bình thường và bất thường) đi kèm mỗi đợt chạy và có tham gia ngoại kiểm (chứng nhận tham gia kiểm chuẩn số 298 159/KCXN‐GCN). Nồng độ LDL‐cholesterol áp dụng cơng thức của Friedewald (1972). + Xét nghiệm điện di dưới nhóm LDL(11) thực hiện tại phòng xét nghiệm Hoa Việt, sử dụng hệ thống điện di (số 48‐9150), bộ thuốc thử (số 48‐ 7002), chuẩn (liposure: số 48‐7060) và phần mềm vận hành, quản lý và tính tốn kết quả của hãng Quantimetrix. Đây là hệ thống điện di trong mơi trường thạch polyacrylamide có chênh lệch nồng độ trong các ống thủy tinh. Quy trình kỹ thuật cho phép tách các thành phần LDL thành 7 dưới nhóm theo tính di động trong điện trường ký hiệu Rf (LDL1: Rf 0,27‐0,32; LDL2: 0,32‐0,38; LDL3: 0,38‐0,45; LDL4: 0,45‐0,51; LDL5: 0,51‐0,56; LDL6: 0,56‐0,60; LDL7: 0,60‐0,64); LDL1 và LDL2 là các LDL lớn, nhẹ (large, buoyant LDL), LDL3 đến LDL7 là LDL nhỏ, đậm đặc (small, dense LDL), thời gian điện di 1 giờ và tùy thuộc sự phân bố của các dưới nhóm và kích thước trung bình hạt LDL mà phần mềm sẽ xếp vào kiểu hình A (LDL lớn, nhẹ chiếm ưu thế) hay non‐A (LDL nhỏ, đậm đặc chiếm ưu thế). Ngồi ra phần mềm còn giúp tính tốn thành phần phần trăm và nồng độ từng dưới nhóm. Thống kê Số liệu được nạp và lưu dưới dạng tập tin excel (Microsoft office excel 2007). Tính tốn dựa vào phần mềm SPSS for Window phiên bảng 18.0; số liệu định lượng được trình bày x ± SD. T test dùng so sánh trung bình 2 nhóm số liệu chuẩn, ANOVA đơn biến so sánh nhiều giá trị trung bình. Tương quan Pearson và hồi quy tuyến tính dùng phân tích mối tương quan, chi bình phương so sánh tỷ lệ. Tất cả phép kiểm đều dùng hai phía, thống kê có ý nghĩa với ngưỡng P = 0,05. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Đặc điểm đối tượng nghiên cứu Tổng số đối tượng chọn ban đầu 385 người (314 bệnh nhân và 70 chứng), trong đó 3 người nhóm bệnh bị loại do bệnh lý khác (2 người suy thận mãn và 1 ngưới cường giáp) và 2 người chuyển từ nhóm bệnh sang nhóm chứng do kết Hội Nghị Khoa Học Cơng Nghệ BV. Nhân Dân Gia Định năm 2013 Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Số 6 * 2013 quả chụp mạch vành xác định khơng có tổn thương. Còn lại 381 người gồm 72 người nhóm chứng và 309 bệnh nhân hội chứng mạch vành cấp được đưa vào nghiên cứu. Do chọn nhóm chứng phù hợp với nhóm bệnh về tuổi, giới, tỷ lệ bệnh đái tháo đường và cao huyết áp nên chúng tơi khơng so sánh các thơng số này (khơng có ý nghĩa). Các tỷ lệ người hút thuốc lá, tiền căn gia đình và béo bụng ở nhóm bệnh cao hơn nhóm chứng, nghiện rượu do số liệu q ít nên chúng tơi chỉ ghi nhận số liệu. Nhóm bệnh có triglyceride tăng và HDL‐c giảm so với chứng, các thơng số còn lại khác biệt khơng có ý nghĩa (bảng 1). Nghiên cứu Y học Kết quả xử lý với phần mềm chun dụng phân tích kiểu hình LDL với ngưỡng kích thước trung bình là 260 Ao, chia thành 2 nhóm hoặc A (LDL lớn, nhẹ) hoặc non‐A (LDL nhỏ, đậm đặc). Tỷ lệ kiểu hình non‐A ở nhóm bệnh là 46,3% cao hơn có ý nghĩa so với nhóm chứng 40,3% (bảng 3). Bảng 1: So sánh đặc điểm đối tượng nghiên cứu Đặc điểm Tuổi, năm Giới, % nữ Hút thuốc lá, % Nghiện rượu Cao huyết áp, % Đái tháo đường, % Tiền gia đình bệnh mạch vành, % BMI, kg/m2 Béo bụng, % Cholesterol, mg/dL HDL-c, mg/dL LDL-c, mg/dL Triglycerid, mg/dL Nhóm chứng Nhóm bệnh (n = 72) (n=309) P 62 12 Nữ 37% 39% 0% 52% 16% 63 13 Nữ 34% 49% 5% 54% 17% 0,012 (*) - 5% 15% 0,000 21,2 2,7 47% 22 3,1 57% 182 41 188 48 42 9,3 110 39 176 61 33 9,7 119 41 203 74 0,213 0,002 0,121 0,000 0,085 0,021 Phép kiểm T 2 bên được dùng so sánh hai trung bình và 2 cho các so sánh tỷ lệ. (*): Khơng thống kê do số liệu ít Phân tích dưới nhóm LDL Đặc điểm dưới nhóm LDL Kích thước trung bình có phân bố chuẩn (hình 1) và mối liên hệ với giới, tình trạng hút thuốc, quá cân, béo bụng, cao huyết áp và đái tháo đường được khảo sát (bảng 2). Đối tượng béo bụng có kích thước LDL nhỏ hơn nhóm có VE/VH bình thường ở cả hai nhóm. Nhóm bệnh, nữ giới có kích thước hạt LDL nhỏ hơn ở nam (không thấy khác biệt này ở nhóm chứng). Khơng có liên quan giữa kích thước hạt trung bình LDL với các yếu tố hút thuốc lá, q cân và cao huyết áp ở cả hai nhóm đối tượng. Hình 1: Phân phối các đối tượng theo kích thước LDL ở hai nhóm Bảng 2: Liên quan giữa kích thước trung bình LDL (Ao) với các yếu tố nguy cơ Yếu tố nguy Nhóm bệnh x ± SD (n) 259,3 13,8 (204) Nữ 254,6 14,4 (105)(++) Không 259,0 14,3(158) Hút thuốc Có 256,2 12,8(99 ) Khơng 258,1 13,9(256) Q cân/ BMI Có 256,4 11,5(53) Khơng 262,1 14,4 (133) Béo bụng Có 255,7 6,2 (176)(++) Khơng 260,1 13,9 (141) Cao huyết áp: Có 257,7 13,1 (168) Giới Nam Đái tháo Khơng đường: Có 259,6 13,1(256) 254,7 15,9 (53) Nhóm chứng x ± SD (n) 261,4 8,7 (45) 262,4 7,4 (27) 260,4 8,1 (44) 262,9 7,5(28) 261,9 9,3 (54) 261,1 7,1 (18) 263,1 7,8 (34) 259,9 8,5 (38)(+) 262,9 8,9 (35) 260,2 7,1 (37) 263,4 7,4 (60) 258,7 8,7 (12) (+): Khác biệt với P/T test