Xác định mức độ ảnh hưởng của axit boric ở các nồng độ khác nhau lên khả năng sống của tế bào gốc dây chằng nha chu người (hPDLSCs), nhằm cung cấp bằng chứng cho việc lựa chọn nồng độ axit boric thích hợp để ứng dụng trong lâm sàng.
Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số * 2018 Nghiên cứu Y học ẢNH HƯỞNG CỦA AXIT BORIC LÊN KHẢ NĂNG SỐNG CỦA TẾ BÀO GỐC DÂY CHẰNG NHA CHU NGƯỜI IN VITRO Nguyễn Thị Thu Sương*, Nguyễn Thị Ngọc Mỹ**, Phạm Anh Vũ Thụy*** TÓM TẮT Mục tiêu: Xác định mức độ ảnh hưởng axit boric nồng độ khác lên khả sống tế bào gốc dây chằng nha chu người (hPDLSCs), nhằm cung cấp chứng cho việc lựa chọn nồng độ axit boric thích hợp để ứng dụng lâm sàng Vật liệu phương pháp nghiên cứu: Axit boric chuẩn bị thành dung dịch có nồng độ 0,5%; 0,75%; 1%; 1,5%; 3% 6% Ảnh hưởng axit boric lên hPDLSCs xác định phương pháp MTT hPDLSCs ủ với boric axit 24 giờ, sau đó, ủ dung dịch MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-YL)-2,5diphenyl tetrazolium bromide) để tạo tinh thể formazan Dung dịch Ethanol/DMSO thêm vào để hòa tan tinh thể formazan tạo dung dịch màu tím hấp thu bước sóng 570 nm Mức độ độc tính axit boric đánh giá dựa theo tiêu chuẩn ISO 10993 - 5: 2009, kết hợp quan sát hình thái tế bào tỷ lệ tăng trưởng tương đối (relative growth rate - RGR) Kết quả: Quan sát hình thái tế bào sau ủ dung dịch axit boric 24 nồng độ thí nghiệm ghi nhận sau: Ở nồng độ 0,5% 0,75%, tế bào đồng nhất, bám dính trải đều, có tế bào co lại Ở nồng độ 1% 1,5%, tế bào co lại nhiều, mật độ ít, bám dính thưa thớt bề mặt đĩa ni Ở nồng độ 3% 6%, tế bào trải dài bề mặt đĩa ni, số tế bào co lại Kết nghiên cứu cho thấy nồng độ axit boric tăng dần trung bình RGR giảm tương ứng Mức độ độc tính tế bào xác định nồng độ 0,5% 0,75% cấp (75% - 99%), nồng độ 1% 1,5% cấp (50% - 74%), nồng độ 3% 6% cấp (1% - 24%) Kết luận: Như vậy, theo tiêu chuẩn ISO 10993-5:2009, kết hợp quan sát hình thái tế bào tỷ lệ tăng trưởng tương đối nghiên cứu cho thấy axit boric nồng độ 0,5% 0,75% khơng gây độc cho hPDLSCs Từ khóa: Axit boric, độc tính tế bào, tế bào gốc dây chằng nha chu người ABSTRACT IN VITRO VIABILITY OF HUMAN PERIODONTAL LIGAMENT STEM CELLS INFLUENCED BY BORIC ACID Nguyen Thi Thu Suong, Nguyen Thi Ngoc My, Pham Anh Vu Thuy * Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Vol 22 - No 5- 2018: 161 – 169 Objective: This study was conducted to determine the dose-dependent effect of boric acid on the viability of human periodontal ligament stem cells (hPDLSCs), thereby providing the basis to select appropriate boric acid concentrations for clinical application Materials and methods: Boric acid was prepared in different concentrations of 0.5%, 0.75%, 1%, 1.5%, 3% and 6% The effect of those solutions on hPDLSCs was determined by the MTT method The hPDLSCs were incubated with boric acid solutions for 24 hours, then continuously with MTT solution (3- (4.5-dimethylthiazol2-yl) -2.5-diphenyl tetrazolium bromide) for hours to promote the formation of Formosan crystals The *Khoa Răng Hàm Mặt, Đại học Y Dược TP HCM, ** Bộ môn Sinh lý học Công nghệ sinh học động vật, Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia TP HCM, *** Bộ môn Nha chu, Khoa Răng Hàm Mặt, Đại học Y Dược TP HCM Tác giả liên lạc: PGS TS Phạm Anh Vũ Thụy ĐT: 0916 810 874 Email: pavthuy@ump.edu.vn 161 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số * 2018 Ethanol/DMSO solution was then added to dissolve the Formosan crystals and generate a purple solution that was absorbed at a 570 nm wavelength The cellular toxicity grades were determined according to ISO 10993 - 5: 2009, simultaneously cell morphology and the relative growth rate (RGR) were also observed Results: Cellular morphology after incubation with boric acid solution at different concentrations for 24 hours was performed as follows: At concentrations of 0.5% and 0.75%, almost hPDLSCs were homogeneous, adherent and uniformly spread while only a handful of cells shrinkage was observed At concentrations of 1% and 1.5%, the amount of shrinkage hPDLSCs was much more, the less cellular density and sparse adhesion was also recorded on the plates surface At concentrations of 3% and 6%, these cells stretch over the cultured surface, with a few contracted cells After measuring the optical density at 570 nm and processing the data, the RGR values were classified according to the cytotoxicity grades in accordance with ISO 10993 - 5: 2009; Level and toxicity were confirmed as zero toxic to the cells The results supported that when the concentration of boric acid increases, the average growth rate decreases correspondingly Cellular toxicity was determined at level for 0.5% and 0.75% concentrations (75% - 99%), level for 1% and 1.5% concentrations (50% - 74%); level for 3% and 6% concentrations (1% - 24%) Conclusion: With the results of cellular toxicity according to ISO 10993 - 5: 2009 in combination with observed cells morphology and calculated RGR, boric acid at 0.5% and 0.75% concentrations were confirmed to be non-cytotoxic to hPDLSCs Keywords: Boric acid, cytotoxicity, human periodontal ligament stem cells số vi khuẩn liên quan đến bệnh nha chu ĐẶT VẤN ĐỀ Prevotella intermedia (Pi), Porphyromonas Viêm nha chu bệnh nhiễm khuẩn mạn gingivalis (Pg), Eubacterium nodatum (En) tính ảnh hưởng đến mô nâng đỡ gồm dây Treponema denticola (Td)(9) Nghiên cứu ứng dụng chằng nha chu xương ổ răng, có khả dẫn tính kháng khuẩn axit boric để điều trị viêm đến Lấy cao xử lý mặt chân nha chu quan tâm ngày nhiều, coi phương pháp bắt buộc nghiên cứu in vitro ảnh hưởng điều trị viêm nha chu Tuy nhiên, phương pháp tế bào mô nha chu loại bỏ hoàn toàn vi khuẩn Tế bào gốc dây chằng nha chu người trường hợp phức tạp(12) Các phương (hPDLSCs) nuôi cấy từ mô dây chằng nha pháp điều trị hỗ trợ sử dụng chu người, biểu dấu ấn (marker) phổ biến kháng sinh toàn thân hay tế bào gốc trung mô CD44, CD73, CD90 chỗ, dung dịch kháng khuẩn bơm rửa túi nha sở hữu đặc tính đa tiềm biệt chu hay súc miệng Trong sử dụng dung dịch hóa thành loại tế bào khác nguyên kháng khuẩn bơm rửa kết hợp với lấy cao bào xương, tế bào tạo mô mỡ tế bào sụn(11) xử lý bề mặt chân biện pháp thường hPDLSCs khơng có có vai trò quan trọng quy điều trị viêm nha chu Vì vậy, việc việc trì mà có khả thúc đẩy nghiên cứu dung dịch có khả kháng tái tạo mô nha chu thường lựa chọn ưu tiên khuẩn, khơng có tác dụng phụ không hàng đầu công nghệ tái tạo sửa chữa gây độc tính cho mơ nha chu điều đáng mô nha chu điều trị bệnh nha chu(1,3) quan tâm ISO liên đoàn tiêu chuẩn quốc tế nhằm Axit boric axit nguyên tố boron từ lâu nâng cao phát triển tiêu chuẩn hóa, biết chất kháng khuẩn nhẹ hoạt động trình quản lý hài hòa để sử dụng nhiều lĩnh vực khác đảm bào an toàn, chất lượng quy trình y học Những hợp chất có chứa boron gần chế tạo thiết bị y tế ISO 10993, phần đưa nghiên cứu khả kháng lại 162 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số * 2018 định quy trình đánh giá độc tính in vitro thơng qua thử nghiệm MTT MTT loại tetrazole có màu vàng MTT viết tắt 3-(4, 5Dimethylthiazol-2-YL)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide chuyển thành tinh thể formazan màu tím tế bào sống tác dụng enzym sucinate dehydrogenase, loại enzym reductase ti thể Do số lượng tế bào sống lớn tạo lượng formazan lớn làm số mật độ quang tăng(5) Thuận lợi thử nghiệm MTT ghi nhận thời gian ủ MTT ngắn (4 giờ), hình ảnh tạo tinh thể forrmazan màu tím dễ quan sát so sánh, kết đo mật độ quang nhanh chóng, đơn giản, dễ dàng thực kết đáng tin cậy(4) Mục đích nghiên cứu đánh giá độc tính in vitro axit boric khả sống hPDLSCs nghiên cứu VẬTLIỆU-PHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU Thiết kế nghiên cứu Nghiên cứu in vitro có nhóm chứng Vật liệu dòng tế bào nghiên cứu Axit boric nguyên chất mua từ công ty Merck – Đức Dung dịch axit boric 6% chuẩn bị cách hòa tan gr axit boric 100 ml môi trường ni cấy lọc qua màng lọc 0,22 µm vơ trùng Dung dịch pha loãng tiếp tục môi trường nhằm đạt nồng độ khảo sát Môi trường nuôi cấy tiêu chuẩn môi trường Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Ham 12 Medium -DMEM/F12 (Sigma, Mỹ) có bổ sung 10% Fetal bovine serum - FBS (Sigma, Mỹ) kháng sinh (100 UI/ml Penicilin, 100 µg/ml Streptomycin – Sigma, Mỹ) Dung dịch MTT mg/ml chuẩn bị cách hòa tan 50 mg MTT 10ml Phosphate Buffer Saline – PBS (Gibco, Mỹ) 1X lọc qua màng lọc 0,22 µm vơ trùng Dung dịch MTT dùng thử nghiệm MTT chuẩn bị cách pha loãng môi trường nuôi cấy với tỉ lệ 1:9 Dung dịch DMSO 20% chuẩn bị cách pha loãng ml DMSO 10 ml Nghiên cứu Y học mơi trường ni cấy, sử dụng làm nhóm chứng dương gây độc cho tế bào(2) Các hóa chất khác: Enzyme tách tế bào Trypsin (Sigma, Mỹ), thuốc nhuộm tế bào Trypan blue (Sigma, Mỹ), Ethanol (Sigma, Mỹ) Nguồn hPDLSCs cung cấp từ phòng thí nghiệm Kỹ nghệ mơ Vật liệu Y Sinh (TEBM Lab) thuộc Đại Học Khoa Học Tự Nhiên, Đại Học Quốc Gia TP Hồ Chí Minh, chứng minh biểu dấu ấn phân tử (marker) tế bào gốc trung mô CD44, CD73 CD90 sở hữu đặc tính đa tiềm biệt hóa thành loại tế bào khác nguyên bào xương tế bào tạo mỡ in vitro(11) Quy trình nghiên cứu Quy trình chuẩn bị tế bào Nguồn hPDLSCs hệ tế bào P3 nuôi tăng sinh cấy chuyền để thu nhận tế bào P4 với số lượng cần thiết cho thí nghiệm Các tế bào tăng sinh hợp dòng (đạt độ bao phủ bề mặt nuôi cấy > 80%) thu nhận để đánh giá độc tính axit boric Các bước thu nhận tế bào bao gồm: loại bỏ môi trường nuôi cấy rửa tế bào dung dịch PBS, tách tế bào bám khỏi bề mặt đĩa nuôi enzym Trypsin-EDTA 0,25% ủ 37oC, 5% CO2 phút Môi trường nuôi cấy bổ sung vào để bất hoạt Trypsin, ly tâm tốc độ 3000 vòng/phút phút để thu nhận cặn tế bào Tế bào sau thu nhận xác định mật độ cách nhuộm tế bào với trypan blue (tỉ lệ 1:1) nạp vào buồng đếm hồng cầu đếm kính hiển vi độ phóng đại 100 lần Huyền phù dịch tế bào với mật độ 105 tế bào/ml vào giếng đĩa 96 giếng nuôi tế bào 37ºC, 5% CO2 qua đêm Quy trình ủ tế bào axit boric Môi trường đĩa 96 giếng loại bỏ Các dung dịch axit boric thí nghiệm 0,5%; 0,75%; 1%; 1,5%; 3%; 6%; mơi trường nuôi cấy tiêu chuẩn (chứng âm) DMSO 20% (chứng dương) bổ sung vào giếng tế bào tiếp tục 163 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số * 2018 Nghiên cứu Y học nuôi cấy 37ºC, 5% CO2 24 Quy trình thử nghiệm MTT Sau 24 giờ, hút hết dịch giếng thay vào dung dịch MTT Sau giờ, hút hết dung dịch MTT, thay vào dung dịch DMSO/Ethanol (tỷ lệ 1:1), huyền phù giếng để hòa tan tinh thể formazan tạo thành dung dịch đồng đo độ hấp thu quang học (Optical density – OD) bước sóng 570nm Đánh giá kết Đánh giá hình thái tế bào: Hình thái tế bào sau cấy sau ủ dung dịch axit boric 24 ghi nhận hình ảnh chụp kính hiển vi đảo pha CKX53 (Olympus, Nhật) phần mềm ghi nhận hình ảnh (CellSens) so sánh với nhóm chứng Đánh giá ảnh hưởng axit boric sau thử nghiệm MTT dựa theo hướng dẫn ISO 10993, chia mức độ độc tế bào thành năm giai đoạn cách phân tích tỉ lệ tăng trưởng tương đối (RGR) xác định theo công thức(5,8): RGR (%) = x 100% OD570e: giá trị trung bình mật độ quang dung dịch axit boric đo bước sóng 570 nm OD570b: giá trị trung bình mật độ quang môi trường nuôi cấy tiêu chuẩn đo bước sóng 570 nm A RGR tóm tắt Bảng với mức độ xác định không gây độc cho tế bào(8) Số liệu xử lý thống kê kiểm định One Sample T-Test phần mềm SPSS phiên 20 Khác biệt có ý nghĩa thống kê xác nhận với trường hợp giá trị p < 0,05 Bảng Mức độ gây độc tế bào theo tiêu chuẩn ISO10993-5:2009(8) RGR (%) 100 75-99 50-74 25-49 1-24 Gây độc tế bào KẾT QUẢ Hình thái hPDLSCs dạng tế bào bám dính trải rộng, nhân lớn hình oval có nhiều bào tương, hình dạng đồng bám dính bề mặt ni cấy (Hình Mũi tên) Tế bào tăng sinh hợp dòng có dạng trải dài cuộn theo hình cung tròn Những đặc điểm hình thái trì ổn định qua hệ cấy chuyền Sau ủ hPDLSCs dung dịch axit boric nồng độ 0,5%; 0,75%; 1%; 1,5%; 3% 6% nuôi tế bào môi trường nuôi cấy tiêu chuẩn (chứng âm) DMSO 20% (chứng dương) sau 24 giờ, thu kết trình bày hình đến hình bảng B Hình Hình thái hPDLSCs quan sát kính hiển vi đảo ngược vật kính 4x (A) vật kính 10x (B) 164 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số * 2018 Nghiên cứu Y học B A Hình hPDLSCs nhóm chứng âm: mơi trường ni cấy tiêu chuẩn (A) nhóm chứng dương: dung dịch DMSO 20% (B) Ở nhóm chứng âm (n = 3), hPDLSCs có dạng đồng nhất, bám dính trải bề mặt ni cấy (Hình 2A) Ở nhóm chứng dương (n = 3), hình dạng tế bào thay đổi, đa số tế bào co tròn biến dạng, bong tách khỏi bề mặt đĩa ni cấy (Hình 2B) Quan sát hình 3, thấy tăng nồng độ axit boric lên hình thái tế bào thay đổi theo Cụ thể nồng độ 0,5% 0,75% đa số tế bào có hình dạng tương tự nhóm chứng âm, tế bào đồng nhất, bám dính phủ bề mặt ni cấy, nhiên có tế bào phản ứng thay đổi hình dạng co lại phần Ở nồng độ 0,75%, hình ảnh tế bào tương tự nồng độ 0,5% có nhiều tế bào co lại Ở nồng độ 1% 1,5%, tế bào co lại nhiều, khơng trải đều, bám dính thưa thớt bề mặt đĩa nuôi Ở nồng độ 3% 6%, tế bào không co lại mà trải dài hơn, khơng có hình dạng định, bám dính lỏng lẻo bề mặt đĩa Sau ủ với dung dịch MTT, tinh thể formazan có màu tím hình thành phản ứng enzyme sucinate dehydrogenase diện q trình hơ hấp ti thể tế bào sống với chất MTT Số lượng tế bào sống lớn lượng tinh thể formazan tạo thành nhiều Ở nhóm chứng âm (Hình 4A) ta thấy hình ảnh tinh thể formazan màu tím với mật độ cao, che phủ hầu hết bề mặt đĩa ni, tinh thể có dạng đồng tương ứng với mức độ hợp dòng tế bào Ở nhóm chứng dương (Hình 4B) số tinh thể formazan tạo nhiên chúng khơng có hình dạng nhóm chứng âm, khơng có bám dính bề mặt đĩa ni tương ứng với chết tế bào quan sát hình thái Khi tăng nồng độ axit boric hình thành tinh thể forrmazan giảm dần, kết thể đồng thời qua hình ảnh đại thể tế bào (Hình 5) kết đo RGR (Bảng 2) Cụ thể nồng độ axit boric 0,5% kết RGR = 92,03 ± 6,58% thể mức độ hình thành tinh thể formazan nhiều tất nhóm thí nghiệm gần nhóm chứng âm Ở nồng độ axit boric 0,75%, kết RGR thu 89,9 ± 5,5% cho thấy số lượng tinh thể formazan tạo thấp so với nồng độ axit boric 0,5% nhiên khác biệt khơng lớn (< 1%) Đối với nhóm thí nghiệm 1% 1,5% tương ứng có số RGR giảm dần 77,27 ± 5,02% 64,61 ± 6,36%, cho thấy số lượng tinh thể formazan hình thành so với nhóm chứng âm nhóm nồng độ 0,5% 0,75%, tinh thể formazan thưa thớt, khơng phủ kín bề mặt đĩa ni Trong đó, nồng độ 3% 6%, khơng quan sát tinh thể formazan tạo thành, tế bào bong tách hết khỏi bề mặt đĩa, hình ảnh ghi 165 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số * 2018 Nghiên cứu Y học nhận tương tự nhóm chứng dương Đồng thời, kết RGR thấp gần nhóm chứng dương (3% 14,79 ± 1,5% 6% 13,23 ± 1,58%) mức độ 2, nồng độ axit boric 3% 6%, gây độc mức độ 4, với mức độ độc tính nhóm chứng dương Với mức độ độc tính xác nhận mức không gây độc tế bào, vậy, kết luận axit boric nồng độ 0,5% 0,75% không gây độc cho hPDLSCs Kết ghi nhận theo Bảng 2, nồng độ axit boric 0,5% 0,75% mức độ độc tính mức độ 1, nồng độ axit boric 1% 1,5% độc tính Bảng Trung bình phần trăm hPDLSCs sống nồng độ dung dịch axit boric Nồng độ AB (%) TB ± Độ lệch chuẩn Giá trị p (8) Mức độ độc tính 0,5 (n=3) 92,03±6,58 0,046 0,75 (n=3) 89,9±5,5 0,042 1 (n=3) 77,27±5,02 0,515 1,5 (n=3) 64,61±6,36 0,105 (n=3) 14,79±1,5