Slide trình bày về cơ chế tự chết ở tế bào người và cơ chế dịch chiết lá Hibiscus sabdariffa điều trị ung thư tuyến tiền liệt
Dịch chiết Hibiscus sabdariffa cảm ứng chế tự chết tế bào ung thư tuyến tiền liệt người invitro invivo Nội dung Tổng quan Nguyên liệu phương pháp Kết Thảo luận Tổng quan Dược liệu Hibiscus sabdariffa Linne (Malvaceae) Tên Việt Nam: Bụp giấm Xuất xứ: Châu Phi Đài hoa: dùng làm thức uống, mứt rau Ở châu Á: điều trị cao huyết áp, sốt suy gan Dịch chiết hoa: hiệu điều trị bệnh bạch cầu u dày Dịch chiết lá: hạ đường huyết, hạ lipid máu, chống oxy hóa tác dụng giống estrogen Tổng quan Bệnh ung thư tuyến tiền liệt (CaP) Tuyến tiền liệt phần hệ sinh dục nam, sản xuất lưu trữ tinh dịch Vị trí: bao quanh niệu đạo bệnh liên quan đến tuyến tiền liệt ảnh hưởng việc tiểu xuất tinh CaP bệnh ác tính phổ biến thứ giới số bệnh ung thư nam Tế bào tuyến tiền liệt biến đổi thành tế bào ung thư, cần androgen để hoạt động dùng dược liệu có glucocorticoid hiệu giống estrogen để điều trị CaP Tổng quan Apoptosis – chết tế bào theo chương trình Tổng quan Apoptosis – chết tế bào theo chương trình Nguyên liệu phương pháp Chuẩn bị dịch chiết nghiên cứu thành phần chức Phân tích HPLC dịch chiết phân lập hợp chất phenolic Thử nghiệm in vitro dòng tế bào CaP Thử nghiệm in vivo chuột Nude Chuẩn bị dịch chiết nghiên cứu thành phần chức Chuẩn bị dịch chiết H sabdariffa 100g khô H sabdariffa Ngâm với 4000 ml nước nóng (95 oC) h Dịch chiết Bay áp suất thấp -85 oC Dịch cô (26.6 g) Làm khô lạnh, bảo quản to = -25 oC Chuẩn bị dịch chiết nghiên cứu thành phần chức Xác định nồng độ polyphenol theo phương pháp Folin-Ciocalteau 0.1 mg dịch chiết + ml nước cất + 0.5 ml TT Folin-Ciocalteau (0.5N) Trộn Sau phút + ml dd Na2CO3 2% Đo độ hấp thu bước sóng 750 nm máy quang phổ kế Hitachi (U-3210) Chất chuẩn: acid gallic Chuẩn bị dịch chiết nghiên cứu thành phần chức Xác định hàm lượng flavonoid toàn phần theo phương pháp Jia 0.5 mg dịch chiết + 1.25 ml nước cất + 75 µl dd NaNO2 2% Trộn Sau phút + 150 µl dd AlCl3.6H2O 10% Trộn Sau phút + 0.5 ml NaOH 1M 2.5 ml nước cất Đo độ hấp thu bước sóng 510 nm Chất chuẩn: rutin Chuẩn bị dịch chiết nghiên cứu thành phần chức Xác định hàm lượng anthocyanin toàn phần theo phương pháp Fuleki Francis (phương pháp pH vi sai) 10 mg dịch chiết pha loãng thành 50 ml với đệm pH 1.0 4.5 Đo độ hấp thu bước sóng 535 nm Mẫu chuẩn: nước cất Hàm lượng anthocyanin tính dựa hiệu số độ hấp thu toàn phần pH 1.0 pH 4.5 Chuẩn bị dịch chiết nghiên cứu thành phần chức Hàm lượng chất dịch chiết Polyphenolic compound Peak no Catechin Hàm lượng dịch chiết (%) 4.25 ± 1.43 Ellagic acid 28.20 ± 8.63 Polyphenol toàn phần (phương pháp FolinCiocalteau) 5.22 ± 0.06 Flavonoid toàn phần (phương pháp Jia) 20.98 ±1.65 Anthocyanin toàn phần ( phương pháp Fuleki Francin) 1.93 ± 1.24 Phân tích HPLC cho dịch chiết phân lập hợp chất phenolic • Thiết bị: Hệ thống Hewlett-Packard Vectra 436/33 N với đầu dò diode array – Cột RP-18, đường kính 4.6 × 150 mm • Dịch chiết (DC) lọc qua màng lọc có kích thước lỗ 0.45 µm • Đo sắc ký bước sóng 285 345 nm • Pha động: – Dung môi A: acid formic/nước = 10:90 – Dung môi B: acid formic/nước/acetonitril = 10:60:30 – Pha động chạy phương pháp gradient tuyến tính to phòng từ 10% đến 40% B, v = ml/ph, 25 ph • peak đơn 345 nm, theo thời gian lưu trữ: ellagitannin • Thu 1.5 mg ellagic acid (EA), tinh khiết hóa kết tinh methanol Thử nghiệm in vitro dòng tế bào CaP Nuôi cấy tế bào • Dòng tế bào CaP: LNCaP, PC3 DU 145 lấy từ Trung tâm tài nguyên sinh học toàn cầu - ATCC (Hoa Kỳ) • Nuôi cấy: cấy thạch tăng trưởng (theo khuyến nghị ATCC), cung cấp 10% FBS, mM glutamine 100 U/ml penicillin-streptomycin • Môi trường: nhiệt độ 37 oC, độ ẩm có 5% CO2 • Mật độ: × 104 • Thời gian cấy: 24 trước điều trị • Để ức chế tăng sinh tế bào: thêm kháng sinh đơn dòng Nok-1 peptide ức chế V5 trước điều trị dịch chiết (DC) Thử nghiệm in vitro dòng tế bào CaP Đánh giá khả sống tế bào • Tế bào cấy với mật độ × 104, ủ với DC EA nồng độ khác thời gian quy định (0-24 h) • Môi trường thay đổi, thêm 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5diphenyltetrazolium bromide (MTT, 0.1 mg/ml) h Số tế bào sống tương ứng với sản lượng formazan, hòa tan với isopropanol, đo quang phổ 563 nm • Đánh giá ảnh hưởng thuốc lên phát triển tế bào xác định nồng độ thuốc ức chế 50% tế bào sống (IC50) Thử nghiệm in vitro dòng tế bào CaP Nhuộm TUNEL Tế bào chết đo số lượng pp TUNEL (terminaol deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick endlabelling): kiểm tra mảnh vỡ DNA kit xét nghiệm ApoAlert • Màng TB tẩy dd đệm Dulbecco’s phosphate ổn định với paraformaldehyd 4% 30 ph nhiệt độ phòng • TB ổn định thấm với 0.1% Triton X-100 Na citrat 0.1% • Sau tẩy TB ủ với hỗn hợp phản ứng 60 ph 37 oC • TB nhuộm quan sát kính hiển vi huỳnh quang với màng lọc kích thích 340/380 nm, phóng đại 400× • Có thí nghiệm riêng biệt thực hiện, 300 TB đếm thí ngiệm Thử nghiệm in vitro dòng tế bào CaP Phân tích vòng đời TB lượng hóa chết TB Đo dòng TB LNCaP pp FAScan 24 h nuôi cấy TN nhuộm lần với dd PBS Dịch treo TB ly tâm 1500 vòng/ph ph to phòng Ủ -20 oC 24 h + 1ml dd nhuộm propidium iodide (20 µg/ml PI, 20 µg/ml Rnase A 0.1% Triton X-100), ủ 15 ph bóng tối to phòng PI kích thích 488 nm dấu hiệu huỳnh quang phân tích quy mô logarit với huỳnh quang PI (đỏ) phát 600 nm Dựa cường độ huỳnh quang, đếm số TB có hàm lượng DNA pha subG1, G0/G1, S G2/M với phần mềm CellQuest phiên 3.3 Thử nghiệm in vitro dòng tế bào CaP Phương pháp Western blot = pp lai thấm protein Là pp có độ nhạy cao dựa đặc hiệu kháng thể để phát protein điện di gel SDS-PAGE chuyển lên màng lai Protein phân tách điện di gel 8-15% SDS-polyacrylamic Các protein chuyển đến màng lai nitrocellulose Màng TB tạo khối với 5% sữa đông khô không béo, ủ qua đêm oC với kháng thể (kháng thể kháng caspase 3, caspase 8, caspase 9, Bcl-2, Bcl-XL, Mcl-1, Bax, t-Bid, cytocrom c, TNFα, TNFR1, Fas, FasL, COX IV kháng β-lactin ) Màng TB ủ với kháng thể thứ cấp có enzym horseadish peroxidase kèm Kháng thể thứ cấp bám vào kháng thể sơ cấp Phát thuốc thử phát quang hóa học tăng cường Thử nghiệm in vitro dòng tế bào CaP Thử nghiệm màng điện áp ty thể Thử nghiệm in vivo chuột Nude Nghiên cứu khối u kĩ thuật ghép dị loài Chuột nude tuần tuổi nuôi lồng, nhiệt độ 22 ± độ C độ ẩm 65 ± 5% điều kiện tiện nghi động vật, chu kì sáng tối 12 h, uống nước theo nhu cầu × 106 tế bào LNCaP 100 ml gel protein cấy vào sườn phải chuột, dẫn tới hình thành khối u Chuột chia ngẫu nhiên thành nhóm (mỗi nhóm 12 chuột), nuôi với chế độ ăn g/ngày bao gồm 50 (1%) 100 (2%) µg/ml dịch chiết H sabdariffa 90 ngày Sau chuột bị giết, khối u phân tách cho thể tích cuối đo khối lượng ướt Thực đánh giá mô học Sử dụng phương pháp Western blotting với dịch mô từ chuột Kết Thành phần dịch chiết H sabdariffa Kết thử nghiệm in vitro dòng tế bào CaP Kết thử nghiệm in vivo chuột Nude Cảm ơn ý lắng nghe cô bạn