Bài viết nghiên cứu tiến hành trên chuột thiếu hụt miễn dịch mang khối ung thư tiền liệt tuyến người để đánh giá hiệu quả của phương pháp trị liệu mới. Trị liệu virut phân giải tế bào ung thư (TBUT) (Oncolytic virus, OLV) được hiểu là sự nhân lên của OLV trong khối u đặc hiệu.
TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2014 - KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CHƢƠNG TRÌNH KHCN KC.10/11-15 NGHIÊN CỨU TRỊ LIỆU UNG THƢ TUYẾN TIỀN LIỆT NGƢỜI BẰNG PHỐI HỢP HAI ONCOLYTIC VIRUT SỞI (MEASLE) VÀ QUAI BỊ (MUMP) TRÊN THỰC NGHIỆM Hồ Anh Sơn*; Bùi Khắc Cường*; Hoàng Văn Lương* Li Feng Zhang**; Naoki Yamamoto**; Nguyễn Lĩnh Tồn* TĨM TẮT Trị liệu virut phân giải tế bào ung thư (TBUT) (Oncolytic virus, OLV) hiểu nhân lên OLV khối u đặc hiệu Kết quả, TBUT bị phân giải phá hủy, đồng thời giải phóng hàng ngàn tiểu phần OLV OLV giải phóng lại lây nhiễm vào TBUT lân cận, đó, tạo sóng cơng OLV vào khối u Nghiên cứu tập trung đánh giá tác dụng điều trị ung thư phức OLV gồm virut dạng vắcxin sởi (measlse) quai bị (mump) chuột thiếu hụt miễn dịch mang khối ung thư tiền liệt tuyến người * Từ khóa: Ung thư tiền liệt tuyến người; Trị liệu virut; Chuột nude STUDY OF HUMAN PROSTATE CANCER TREATMENT BY COMBINED TWO ONCOLYTIC VIRUSES MEASLE AND MUMP ON EXPERIMENT SUMMARY Oncolytic virotherapy is tumor-selective viral replication, resulting in lytic tumor cell destruction and release of thousands of viral particles Newly released viruses go on to infected neighboring tumor cells, theoretically causing and maintaining a wave of virus attack throughout the tumor Our study will evaluate the effectiveness of cancer treatment by complex of OLV of measlse with mump on defficient nude mice xenograft human protate cancer cells * Key words: Human protate cancer; Oncolytic virotherapy; Nude mice ĐẶT VẤN ĐỀ Nhiều nghiên cứu cho thấy, OLV có tế bào đích khác nhau, dòng TBUT bị xâm nhiễm nhiều loài virut khác thời điểm Để làm sáng tỏ chế tăng hiệu trị liệu liệu pháp virut, đề xuất hướng trị liệu gồm phức hợp vắcxin virut điều trị ung thư Vắcxin sởi (Measle virus, MeV) xâm nhập vào nhiều loại TBUT thơng qua thụ thể CD 46 có mặt dày đặc bề mặt nhiều dòng ung thư khác Mặc dù thụ thể virut quai bị (Mump virus, MuV) chưa làm sáng tỏ, nhiều nghiên cứu cho thấy lồi OLV xâm nhập vào TBUT * Học viện Quân y ** Đại học Quốc gia Singapore Người phản hồi: (Corresponding): Hồ Anh Sơn (hoanhsonhp@gmail.com) Ngày nhận bài: 21/12/2013; Ngày phản biện đánh giá báo: 22/1/2014 Ngày báo đăng: 24/1/2014 39 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2014 - KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CHƢƠNG TRÌNH KHCN KC.10/11-15 Hơn nữa, vắcxin hai loại virut sử dụng an toàn khắp giới thời gian dài Dựa hoạt động phân giải TBUT dòng vắcxin khác nhau, lựa chọn phức hợp MeV MuV (MM) cho trị liệu virut Chúng hy vọng phức hợp MM/hóa trị liệu áp dụng thử nghiệm lâm sàng tương lai Tuy nhiên trước đó, cần chứng minh hiệu phương pháp thử nghiệm tiền lâm sàng Để thực nội dung này, nghiên cứu tiến hành chuột thiếu hụt miễn dịch mang khối ung thư tiền liệt tuyến người để đánh giá hiệu phương pháp trị liệu ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tƣợng nghiên cứu Chuột thiếu hụt miễn dịch (nude mice) (Charles River, Mỹ) ni phòng Mỗi nhóm chuột nhốt chung lồng chuột đánh số theo dõi Mỗi lồng chuột có lỗ cấp khí qua màng lọc HEPA riêng Duy trì ánh sáng theo chu kỳ tự nhiên, tự động điều khiển bật lúc giờ, tắt lúc 19 Chuột thay lồng chất lót lần, đồng thời kiểm tra tình trạng tồn thân, phân, tiêu thụ thức ăn, nước uống Thức ăn nhập (Zeigler, Hoa Kỳ), nước uống tinh khiết hấp tiệt trùng Nhiệt độ trì 26 ± 20C, trì độ ẩm khơng khí máy hút ẩm Theo dõi ẩm kế để trì độ ẩm trung bình khoảng 60 ± 5% Hàng tuần, môi trường nuôi chuột cấy khuẩn kiểm tra mức độ nhiễm khuẩn Thực vệ sinh vô khuẩn hàng tuần [1] Phân lập, tăng sinh MeV MuV nguồn gốc vắcxin: MeV MuV tách dòng từ vắcxin Priorix (GlaxoSmithKline, Anh), thực Đại học Quốc gia Singapore Sau đó, lựa chọn dòng virut cách hút μl dung dịch nuôi đĩa nhân lên tế bào Vero đĩa 24 giếng Thu thập dịch tế bào Vero nhiễm ly tâm 3.200 g/15 phút/40C bảo quản -800C (Trung tâm Nghiên cứu Y học Quân sự, Học viện Quân y) Phƣơng pháp nghiên cứu Sau TBUT tiền liệt tuyến người tăng sinh đủ số lượng [1] Tạo khối u da đùi phải chuột nude, tiêm TBUT người với số lượng trung bình 106 tế bào/con Theo dõi xuất kích thước u, tính theo cơng thức: V = D x R2 x 0,5 Trong đó, V: thể tích khối u; D: chiều dài khối u; R: chiều rộng khối u Kích thước khối u đo thước kẹp Khi khối u đạt kích thước trung bình 50 mcl, chia chuột thành nhóm, nhóm 10 con: - Nhóm chứng: mang u, tiêm nước muối sinh lý 0,9% - Nhóm MeV: mang u, điều trị MeV - Nhóm MuV: mang u, điều trị MuV - Nhóm MM: mang u, điều trị MeV + MuV Chuột tiêm trực tiếp vào khối u loại virut đơn lẻ MeV, MuV kết hợp hai MM (gồm MeV MuV có số lượng tương đương) lần, lần/tuần, liều 106cfu/lần/con Theo dõi kích thước khối u, tỷ lệ sống chết tới kết thúc thí nghiệm 40 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2014 - KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CHƢƠNG TRÌNH KHCN KC.10/11-15 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Tác dụng OLV tới kích thƣớc khối u Hình ảnh đại thể chuột mang khối u tiền liệt tuyến ngƣời 1600 1200 Chứng MeV 800 MuV MM 400 Tuần Tuần Tuần Tuần Tuần Tuần Tuần Hình 1: Kích thước khối u tuần điều trị (mm3) Kết nghiên cứu cho thấy, kích thước khối u tiền liệt tuyến nhóm trị liệu MM, MeV MuV nhỏ có ý nghĩa thống kê so với nhóm chứng (p < 0,01) Nhóm chuột trị liệu MM có kích thước khối u nhỏ nhóm MuV có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) Nhóm chuột MM có kích thước khối u nhỏ nhóm MeV, khác biệt chưa có ý nghĩa thống kê Trị liệu virut ảnh hƣởng tới thời gian sống chuột Nhóm chứng thời điểm bắt đầu điều trị Nhóm MeV thời điểm bắt đầu điều trị Kaplan-Meier Cum Survival Plot for Thoi gian song Censor Variable: Song_chet Grouping Variable: Nhom Cum Survival Cum Survival (Control) ,8 Event Times (Control) ,6 Event Times (MeV) Cum Survival (MeV) Nhóm MuV thời điểm bắt đầu điều trị Cum Survival (MM) ,4 Event Times (MM) Cum Survival (MuV) ,2 Event Times (MuV) 0 20 40 60 Time 80 100 120 Hình 2: Thời gian sống nhóm chuột Tại thời điểm 115 ngày sau trị liệu virut, số chuột mang khối ung thư tiền liệt tuyến người, nhóm chứng chuột sống Trong đó, nhóm trị liệu MeV, MuV MM 8, 10 chuột sống Nhóm MM thời điểm bắt đầu điều trị Hình 3: Hình ảnh khối u đồng nhóm chuột 41 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QN SỰ SỐ 2-2014 - KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CHƢƠNG TRÌNH KHCN KC.10/11-15 Sau ghép TBUT tiền liệt tuyến người, khối u hình thành tất chuột ghép chia nhóm cho kích thước khối u tương đồng tất nhóm chuột Nhóm MuV thời điểm tuần sau điều trị Nhóm MM thời điểm tuần sau điều trị Nhóm chứng thời điểm tuần sau điều trị Hình 4: Hình ảnh khối u kích thước khơng đồng nhóm chuột Sau lần trị liệu, kích thước khối u có khác biệt đáng kể thời điểm tuần Trong đó, kích thước khối u nhỏ nhóm chuột trị liệu phức hợp virut MM, tiếp nhóm trị liệu MeV MuV Nhóm chứng có kích thước khối u lớn Bµn ln Nhóm MeV thời điểm tuần sau điều trị Kết nghiên cứu cho thấy trị liệu virut sởi, quai bị phức hợp hai loại virut có hiệu kiềm chế tốc độ phát triển khối ung thư tiền liệt tuyến người ghép chuột nude kéo dài thời gian sống chuột Nghiên cứu tiền lâm sàng khả phân giải TBUT MeV giảm độc lực Peng công bố sớm năm 2001 [6] Nghiên cứu cho thấy khả phân giải TBUT in vitro in vivo mơ hình chuột SCID/NOD mang khối u Kết quả: khối u giảm phát triển điều trị tiêm MeV vào khối u theo đường tĩnh mạch Khi tiêm trực tiếp MeV giảm độc lực vào khối u, gây hoạt động gen beta-galactosidase 42 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2014 - KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CHƢƠNG TRÌNH KHCN KC.10/11-15 reporter gen gây gảm kích thước khối u lympho chuột ghép Virut xâm nhập vào tế bào thông qua thụ thể CD46 có nhiều bề mặt TBUT [7] Do đó, virut sởi sống giảm độc lực có khả phân giải TBUT mà bề mặt bộc lộ nhiều thụ thể CD46 [5] Ong CS đánh giá khả MeV dòng TBUT tủy xương (neoplastic plasma cells, PCs) không ung thư (nonplasma cells, NPCs) 38 BN đa u tủy xương Kết cho thấy: PCs bộc lộ nhiều số lượng thụ thể CD46 so với tế bào NPCs Trung bình số thụ thể CD46 PCs NPCs 49.130/tế bào 7.340/tế bào Khả phân giải tế bào MeV xảy tế bào PCs, không xảy tế bào thường NPCs [5] Härfast CS phát độc tế bào tế bào lympho máu ngoại vi tế bào mô nuôi cấy sau tiếp xúc với MuV Các tế bào có thụ thể với phần Fc IgG, đó, hiệu ứng bị ảnh hưởng loại bỏ thụ thể Fc bề mặt cho tế bào chạy qua cột chứa phức hợp miễn dịch [4] Đối với virut quai bị, MuV thủy phân làm giảm protein nội bào STAT1, đồng nghĩa với việc virut khỏi đáp ứng chống virut interferon Đây protein có vai trò trung gian đáp úng cytokine, yếu tố phát triển, nonreceptor tyrosine kinases số kích thích gây ung thư Protein V virut có đích ảnh hưởng STAT1 STAT3 Kết protein V chống lại đáp ứng tế bào với IL-6 tín hiệu v-Src gây chết tế bào theo chương trình TBUT máu [2, 3] Như vậy, thay đổi cấu trúc MuV dạng vắcxin sống giảm độc lực, virut khả trốn khỏi hệ miễn dịch Khi cytokine gây chết tế bào thơng qua đường STAT1 STAT3 KẾT LUẬN Trị liệu virut vắcxin sởi quai bị có tác dụng hạn chế kích thước khối ung thư tiền liệt tuyến người chuột mang khối u kéo dài thời gian sống nhóm chuột trị liệu đơn loại virut kết hợp hai virut so với nhóm chứng TÀI LIỆU THAM KHẢO Nguyễn Đình Bảng, Hồ Anh Sơn, Bùi Khắc Cường, Nguyễn Lĩnh Toàn Nghiên cứu tạo khối ung thư tuyến tiền liệt người chuột thiếu hụt miễn dịch “nude mice” kỹ thuật ghép dị loài Tạp chí Y-Dược học Quân 2011, tr.90-95 Christina M Ulane, Jason J Rodriguez, JeanPatrick Parisien, and Curt M Horvath STAT3 ubiquitylation and degradation by Mumps virus suppress cytokine and oncogene signaling J Virol 2003, June, Vol 77, No 11, pp.6385-6393 Fujii N, Yokota S, Yokosawa N, Okabayashi T Molecular mechanisms for suppression of interferon signal transduction pathways caused by viral infections Uirusu 2004, Dec, 54 (2), pp.69-78 Härfast B, Andersson T, Alsheikhly A, Perlmann P Effect of Fc-receptor modulation on mumps-virus-dependent lymphocyte-mediated cytotoxicity in vitro Scand J Immunol 1980, 11 (3), pp.357-362 Ong HT, Timm MM, Greipp PR et al Oncolytic measles virus targets high CD46 expression on multiple myeloma cells Experimental Hematology 2006, 34 (6), p.713-720 Peng KW, Ahmann GJ, Pham L, Greipp PR, Cattaneo R, Russell SJ Systemic therapy of myeloma xenografts by an attenuated measles virus Blood 2001, 98 (7), pp.2002-2007 Tatsuo H, Ono N, Tanaka K, Yanagi Y Slam (CDw150) is a cellular receptor for measles virus Nature 2000, 406 (6798), pp.893-897 43 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2014 - KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CHƢƠNG TRÌNH KHCN KC.10/11-15 44 ... thấy trị liệu virut sởi, quai bị phức hợp hai loại virut có hiệu kiềm chế tốc độ phát triển khối ung thư tiền liệt tuyến người ghép chuột nude kéo dài thời gian sống chuột Nghiên cứu tiền lâm... dung này, nghiên cứu tiến hành chuột thiếu hụt miễn dịch mang khối ung thư tiền liệt tuyến người để đánh giá hiệu phương pháp trị liệu ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tƣợng nghiên cứu Chuột... kích thư c khối u nhỏ nhóm chuột trị liệu phức hợp virut MM, tiếp nhóm trị liệu MeV MuV Nhóm chứng có kích thư c khối u lớn Bµn ln Nhóm MeV thời điểm tuần sau điều trị Kết nghiên cứu cho thấy trị