ỨNG DỤNG LOCUS PCR TRONG PHÂN BIỆT VI SINH VẬT

ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP.HCM Khoa Dược  CHUYÊN ĐỀ HẾT MÔN SINH HỌC PHÂN TỬ ỨNG DỤNG LOCUS – PCR TRONG PHÂN BIỆT VI SINH VẬT Nhóm thực : Ngô Văn Cường Nguyễn Ánh Hồng Trần Thạch Thảo Lớp : Cao học 2015 - 2017 Giảng viên hướng dẫn : PGS.TS Trần Cát Đông TP.HCM - 2015 LỜI MỞ ĐẦU Vi sinh vật (microorganisms) sinh vật nhỏ bé đến mức thấy chúng kính hiển vi quang học hay kính hiển vi điện tử Từ xa xưa người ta biết ứng dụng vi sinh vật có ích (tuy chưa biết tới tồn chúng) để chế biến thực phẩm (như nấu rượu, làm tương, mắm, nước mắm…), ủ phân, ngâm vỏ lấy sợi, trồng luân canh với họ đậu…; sử dụng biện pháp để ngăn chặn tác hại vi sinh vật (như ướp muối thịt, phơi khô cá, làm mứt…) Bên cạnh đó, có vi sinh vật có hại gây bệnh hiểm nghèo cho người, cho gia súc, gia cầm chiếm tỉ lệ nhỏ giới vi sinh vật Định danh vi sinh vật ngày đòi hỏi cấp thiết để hỗ trợ cho ngành: nông nghiệp, lâm nghiệp, y tế… Có nhiều phương pháp truyền thống sử dụng nhiều nghiên cứu phân loại phương pháp tỏ vạn thích hợp cho đối tượng vi sinh vật, tính xác đạt kết hợp nhiều phương pháp khác Ngày nay, tiến sinh học phân tử mở khả ứng dụng hữu hiệu phân loại học nghiên cứu đa dạng vi sinh vật Một yếu tố phát triển nhanh sinh học phân tử tính bao quát đặc trưng kỹ thuật theo đuổi táo bạo vấn đề tạo hội áp dụng chúng Phản ứng chuỗi polymerase (polymerase chain reaction PCR) kỹ thuật ứng dụng rộng rãi sinh học phân tử với lý sau: phương tiện nhanh, rẻ, đơn giản để tạo số lượng tương đối lớn phân tử DNA từ lượng nhỏ vật liệu DNA gốc, nguồn DNA có số lượng tương đối thấp Trong kỹ thuật PCR, MLST (multilocus sequence typing) đánh giá kỹ thuật tốt để phân loại kiểu gen nhiều loại vi khuẩn như: Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae S.aureus Ví dụ: Bartual cộng sử sử dụng kỹ thuật để phân loại chủng A baumannii dựa vào trình tự gen có độ dài từ 305 đến 513bP vùng bảo tồn (conserved regions) loại gen: gltA, gyrB, gdhB, recA, cpn60, gpi, rpoD Kỹ thuật MLST đánh giá để phân loại kiểu gen tốt kỹ thuật PFGE RFLP số kỹ thuật gọi “thư viện” để xếp, phân loại sử dụng nghiên cứu dịch tễ học chủng A.baumannii, qua xác định chủng gây dịch, kháng kháng sinh, hay kháng độc tố nhằm giám sát lây truyền chúng phạm vi quốc gia giới [6] Để hiểu rõ kỹ thuật MSLT việc định danh vi sinh vật, nhóm lựa chọn thực tiểu luận “Ứng dụng Locus – PCR phân biệt vi sinh vật” hướng dẫn PGS.TS Trần Cát Đông MỤC LỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT A : Adenin ARN : Acid ribonucleic DNA : Desoxyribonucleic acid dNTP : Deoxyribonucleoside triphosphate EDTA : Ethylene Diaminetetra acetic Acid PCR : Polymerase Chain Reaction PEG : Polyethylene glycol RELP : Restriction Length Fragment Polymorphism rep – PCR : Repetitive Sequence – Based PCR PFGE : Pulsed Field Gel Electrophoresis MLSA : Multilocus Sequence Analysis MLST : Multilocus Sequence – Typing MLEE : Multilocus enzyme electrophoresis MST : Minimum spanning tree ST : Sequence type UPHMA : Unweighted pair group method with arithmetic mean DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Quy trình nuôi cấy vi sinh vật Hình 1.2: Chu trình PCR dạng sơ đồ .8 Hình 1.3 Quy trình RFLP – PCR để định danh vi sinh vật 10 Hình 1.4 Quy trình rep-PCR định danh vi sinh vật 11 Hình 3.1 Nhiễm sắc thể đồ sau lai hóa .27 Hình 3.2 Biểu đồ mối liên hệ gene 107 chủng dựa đoạn gen .30 Hình 3.3 Cây phân loài dựa trình tự gen rpoA 92 chủng Enterococcus Listeria monocytogenes coi nhóm bên .35 Hình 3.4 Cây phân loài dựa trình tự gen pheS 92 chủng Enterococcus Listeria monocytogenes coi nhóm bên .36 Hình 3.5 Cây xác định trình tự locus xây dựng cho Streptococcus nhóm B 42 DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Các đoạn gen sử dụng phân tích MLST 28 Bảng 3.2 Thuộc tính chủng 49 kiểu chuỗi xác định alen đoạn gene 30 Bảng 3.3 Các trình tự mồi sử dụng để khuếch đại giải trình tự gen pheS rpoA 33 Bảng 3.4 Số lượng dòng vi khuẩn Streptococcus nhóm B quốc gia 37 Bảng 3.5 Đặc tính locus hệ thống GBS MLST .41 Bảng 3.6 Chuỗi nucleotid mồi cho GBS MLST 41 I TỔNG QUAN 1.1 1.1.1 Đại cương vi sinh vật [55] Định nghĩa vi sinh vật Vi sinh vật sinh vật đơn bào đa bào nhân sơ nhân thực có kích thước nhỏ, không quan sát mắt thường mà phải sử dụng kính hiển vi Vi sinh vật bao gồm vi khuẩn (bao gồm cổ khuẩn), virus, nấm, tảo, nguyên sinh động vật 1.1.2 • • Đặc điểm chung vi sinh vật Kích thước nhỏ, kích thước vi sinh vật thường đo micromet Hấp thu nhiều, chuyển hóa nhanh Phân giải hầu hết loại chất có giới, kể chất khó phân giải, chất gây hại đến nhóm sinh vật khác Bên cạnh khả phân giải, vi sinh vật có khả tổng hợp nhiều hợp chất hữu phức tạp, điều kiện nhiệt độ, áp suất bình • • • thường Sinh trưởng nhanh, phát triển mạnh Năng lực thích ứng mạnh dễ phát sinh biến dị Phân bố rộng, chủng loại nhiều Số lượng chủng loại thay đổi theo thời gian Hệ sinh thái vi khuẩn phong phú, đa dạng, từ lạnh đến nóng, từ chua đến kiềm, từ háo khí đến kị khí 1.1.3 Ứng dụng vi sinh vật [3] • Trong tự nhiên: tham gia vào trình phân giải xác hữu tự nhiên, chất thải công nghiệp sinh hoạt • Trong lượng: tăng sinh khối dầu hỏa, khí đốt, than đá • Trong công nghiệp lên men: sinh nhiều sản phẩm trao đổi chất acid, enzym, cồn, chất kháng sinh, acid amin, vitamin… • Trong di truyền học: chuyển gen, DNA tái tổi hợp… 1.2 1.2.1 • Định danh vi sinh vật Mục đích việc định danh [3] Việc định danh vi sinh vật nhằm xác định nhanh chủng loài, đánh giá mức độ nguy hiểm, khả lây truyền vi sinh vật, nắm hình thái phát • triển vi sinh vật nhằm đưa giải pháp hợp lý Xây dựng sở liệu quan trọng nghiên cứu vacxin, đánh giá chất lượng, vệ sinh, an toàn thực phẩm • Định danh vi sinh vật ngày đánh giá ngành kỹ thuật then chốt hỗ trợ cho ngành sản xuất như: nông nghiệp, lâm nghiệp, y tế, dược phẩm… 1.2.2 Nguyên lý định danh vi sinh vật [3] Trong định danh vi sinh vật phương pháp truyền thống, vi khuẩn định danh dựa vào đặc tinh hình thái, sinh lý hóa vi sinh vật: nhuộm, hình dạng tế bào khuẩn lạc, khả di động, nhu cầu dinh dưỡng, khả sinh acid môi trường sắc tố tạo thành Trong địnhdanh vi sinh vật công nghệ phân tử, việc định danh sử dung phương pháp so sánh Để xác định vi sinh vật chưa biết, ta so sánh chuỗi tương ứng với chuỗi xác định Sự tương đồng hai chuỗi cho kết dương tính Việc xây dựng sở liệu cho chuỗi then chốt tính độc bộc lộ đặc tính vi sinh vật Chuỗi sử dụng vào hai trường hợp: • Đoạn mẫu trích từ chủ động, thể mã vùng hệ gen • Đoạn mẫu không hoạt động không giải mã vùng hệ gen Trong hai trường hợp trên, gen không hoạt động có khả thích ứng tốt nên có khả thể biến thiên cao 1.3 Định danh phương pháp truyền thống [5], [54] 1.3.1 Các bước tiến hành a Nuôi cấy môi trường chọn lọc đĩa thạch Hình 1.1 Quy trình nuôi cấy vi sinh vật b Nhận diện đặc điểm khuẩn lạc điển hình c Nhuộm đánh giá hình dạng, cách xếp tính bắt màu vi khuẩn d Thực thử nghiệm sinh hóa định danh kĩ thuật kháng sinh đồ Một số phản ứng sinh hóa thường dùng cho định danh • Thử nghiệm khả chuyển hóa citrat: E coli, Enterobacter • • aerogenes Thử nghiệm catalase Thử nghiệm oxydase: Pseudomonas aeruginosa, Neisseria • • • • • • • • • • gonorrhoeae Thử nghiệm phân giải Ure Thử nghiệm coagulase Thử nghiệm idol Thử nghiệm MR Thử nghiệm VP Thử nghiệm lên men đường Thử nghiệm khử citrat Thử nghiệm phân giải hồng cầu Thử nghiệm khả di động Thử nghiệm hóa lỏng gelatin Các Kit thuốc thử dùng cho việc định danh: API20E KIT Phân biệt thực khuẩn thể: vi khuẩn có độ mẫn cảm với thực khuẩn thể khác Phân biệt theo Typ huyết thanh: dựa vào nhóm định kháng nguyên tế bào vi sinh vật Phân biệt loại hoạt chất kháng khuẩn (Bactericin): loại vi khuẩn tạo loại bateriocin có khả kháng lại bacteriocin 1.3.2 Ưu điểm • • • Đơn giản, dễ thực quy mô nhỏ Tiết kiệm chi phí Định danh vi khuẩn thường gặp 1.3.3 Nhược điểm • • • Chỉ định danh số vi sinh vật có đặc trưng riêng Khó nhận biết xác loài vi khuẩn Tốn thời gian 10 3.3 Xác định trình tự locus Streptococcus nhóm B [41] Một hệ thống xác định trình tự locus xây dựng cho Streptococcus nhóm B (GBS) Hệ thống sử dụng để mô tả (n=152) chủng tụ cầu nhóm B đại diện tuýp huyết Ia, Ib, II, III, V, VI, VIII Các đoạn (459-519 bp) bảy gen “giữ nhà” khuếch đại PCR cho chủng giải trình tự Sự kết hợp alen bảy locus cung cấp hồ sơ alen kiểu trình tự cho chủng Có 29 kiểu trình tự (ST), 66% chủng thuộc bốn kiểu trình tự phổ biến ST-1 ST-19 có liên quan đáng kể với vật chủ mang mầm không triệu chứng, ST-23 bao gồm chủng mang mầm xâm lấn Tất 44 dòng phân lập ST-17 nhóm huyết III, kiểu trình tự xuất dòng nhiễm khuẩn xâm lấn trẻ sơ sinh Các dòng phân lập với týp huyết vỏ khác có kiểu trình tự gen cho mà tái tổ hợp xảy locus vỏ Một trang web cho trình tự liên cầu nhóm B (GBS MLST) thiết truy cập http://sagalactiae.mlst.net 3.3.1 Chủng vi khuẩn 152 dòng phân lập, thu thập từ nhiều quốc gia, minh họa bảng sau Bảng 3.4 Số lượng dòng vi khuẩn Streptococcus nhóm B quốc gia Quốc gia Anh Mỹ Nhật New Zealand Israel Singapore Thai land Không xác định * Tổng Số dòng phân lập (%) Trẻ sơ sinh Người trưởng thành Mang mầm Mắc bệnh Mang mầm Mắc bệnh 21 (13,9) 20 (13,2) 0 14 (9,2) (4,0) (1,2) 15 (9,9) 30 (19,7) (1,2) (4,0) (3,3) 10 (6,6) Tổng 41 (27,1) 22 (14,4) 45 (29,6) 23 (15,1) 0 0 (0,6) (0,6) (2,0) (2,0) (4,6) (4,0) 0 10 (6,6) (4,6) (2,0) 0,6) (1,2) 58 (38,32) 67 (44,2) 25 (16,4) 152 *NEM316: ATCC 12403 49 3.3.2 Xác định GBS Các chủng phát triển môi trường thạch máu xác định liên cầu nhóm B qua tiêu chuẩn sau: Tiêu huyết hoàn toàn thạch Columbia chứa 5% máu ngựa (hai 152 chủng phân tích không tiêu huyết), nhuộm Gram cho thấy cầu khuẩn gram dương xếp thành đôi chuỗi ngắn, phản ứng catalase âm tính Đặc tính chủng Huyết vỏ mang tất chủng phòng thí nghiệm John Bohnsack Huyết vỏ lặp lại phòng thí nghiệm thứ hai với phương pháp khác cho 25 (16,5%) dòng phân lập lựa chọn ngẫu nhiên (Trung tâm nghiên cứu Streptococcus, Phòng xét nghiệm Y tế công cộng Trung ương, Colindale, Vương quốc Anh [n=20], Phòng thí nghiệm Vi sinh lâm sàng, Singapore [n=5]) Bốn mươi chủng trước xác định RDP (restriction digest pattern, mẫu cắt giới hạn) 3.3.3 Chiết xuất DNA Các kit DNeasy (Qiagen GmbH) sử dụng để chiết xuất DNA Một khóm khuẩn lạc chủng cấy ria thạch Columbia có chứa 5% máu ngựa Một số khóm khuẩn lạc cho vào đệm muối phosphat ly tâm 5.500 vòng/phút Dịch tế bào hòa tan lại cách thêm vào 180 µL đệm enzyme thủy giải có chứa lysozyme (20 mg/ml) ủ 30 phút 37 °C Sau 25 µL proteinase K (10 mg / ml) bổ sung, ủ tiếp tục 70 °C 30 phút DNA dịch thủy giải bị kết tủa với ethanol 95% (vol / vol) Ethanol 70% (vol / vol) đệm AW1 AW2 bổ sung ly tâm 5500 vòng/phút Phần nước loại bỏ, DNA hòa tan lại nước vô trùng bảo quản -20 °C 3.3.4 Lựa chọn locus cho MLST 10 locus mã hóa enzym tham gia vào trình chuyển hóa trung gian, xác định cách tìm kiếm trình tự gen chủng GBS NEM316 với trình tự tương đồng vi khuẩn khác Gen phù hợp lựa chọn sở vị trí nhiễm sắc thể đa dạng trình tự quan sát nghiên cứu thí điểm với tập hạn chế chủng GBS Ba gen bị loại trừ, hai chúng phân biệt 50 chủng GBS không khuếch đại đáng tin cậy Bảy locus sau lựa chọn để xác định trình tự MLST (Bảng 2): alcohol dehydrogenase gbs0054 (adhP), phenylalanyl tRNA synthetase (pheS), amino axit vận chuyển gbs0538 (atr), glutamine synthetase (glnA), serine gbs2105 dehydratase (sdhA), glucose gbs0518 kinase (glcK), transketolase gbs2105 (tkt) Các vị trí nhiễm sắc thể locus “giữ nhà” (Bảng 2) cho khó cho locus để di truyền trình tái tổ hợp, khoảng cách tối thiểu hai locus 20 kb 3.3.5 Khuếch đại xác định trình tự nucleotide Sản phẩm PCR khuếch đại với cặp mồi oligonucleotide thiết kế từ trình tự gen chủng GBS NEM316 Một loạt mồi thử nghiệm, (dữ liệu thể Bảng 3) cung cấp khuếch đại đáng tin cậy từ phạm vi lớn dòng phân lập GBS Hỗn hợp phản ứng khuếch đại 50 µL gồm 10 ng ADN GBS 100 pmol mồi PCR (MWG Biotech, Ebersberg, Đức), 1x đệm PCR với 1,5 mM MgCl (Qiagen GmbH), 0,5 U TaqDNA polymerase (Qiagen GmbH), 1,6 mM deoxynucleoside triphosphate (ABgene, Epsom, United Kingdom) Các điều kiện phản ứng làm biến tính 94 °C phút, ủ mồi 55 °C 45 giây, mở rộng 72 °C phút cho 30 chu kỳ Các sản phẩm khuếch đại tinh chế cách kết tủa với 20% polyethylene glycol 2,5 M NaCl, trình tự nucleotide chúng xác định lần sợi DNA với internal nested primer (mồi nội bộ) (bảng 3) ABI Prism BigDye Terminators phiên 3.0 (Applied Biosystems, Foster City, Calif.) theo hướng dẫn nhà sản xuất Các sản phẩm có màu không hợp loại bỏ cách kết tủa sản phẩm với natri acetate (3 M, pH 5,2) 95% (tt /tt) ethanol, sản phẩm phản ứng tách phát hệ thống phân tích ABI Prism 3700 DNA (Applied Biosystems) Trình tự lắp ráp từ kết sắc ký với chương trình máy tính Staden chỉnh sửa để giải mơ hồ Alen kiểu chuỗi: Mỗi locus, trình tự khác định số alen để nhận biết; đoạn nội gen có số xác codon Bất kỳ thay đổi trình tự nucleotide, có trình tự axit amin thay đổi, định nghĩa 51 alen Do dòng phân lập định bảy số nguyên, tạo thành hồ sơ alen Các dòng phân lập có alen định có loại trình tự (ST), đánh số theo thứ tự xác định (ST-1, ST-2, vv) chúng Các liệu gửi vào sở liệu truy cập Internet http://sagalactiae.mlst.net 3.3.6 Tính toán phân tích Xác định số lượng vị trí nucleotide đa hình, tính toán tỷ lệ dn /ds, nơi dn thay không đồng nghĩa ds thay đồng nghĩa, xây dựng biểu đồ với phương pháp nhóm cặp không trọng số với số học trung bình (UPGMA) thực với START (http: // www.mlst.net) kiểu trình tự nhóm lại thành dòng với BURST (START phiên 1.05, http://www.mlst.net ) Các thành viên dòng BURST xác định nhóm hai nhiều chủng độc lập mà dòng phân lập có alen giống hệt sáu nhiều locus với thành viên khác nhóm 3.3.7 Kết 3.3.7.1 Biến thể bảy locus MLST Các trình tự bảy locus chọn xác định cho 152 chủng, hồ sơ alen định Các alen xác định cho MLST dựa độ dài chuỗi từ 459 (glcK) 519 bp (sdhA) Giữa bốn (glcK) 11 alen (adhP) có mặt locus Số lượng trung bình alen vị trí 6.4, cung cấp khả phân biệt 4,4x10 kiểu gen khác Tỷ lệ vị trí nucleotide biến đổi thể gen ‘giữ nhà” dao động từ 1,2% (glnA) đến 2,5% (sdhA) (Bảng Hình 1) Tỷ lệ thay đổi nucleotide làm thay đổi trình tự axit amin (thay không tương đồng, dn) tỷ lệ thay đổi im lặng (thay đồng nghĩa, ds) tính cho gen Với liệu này, tỷ lệ dn/ds tính toán cho tất bảy locus tất < (bảng 2) 3.3.7.2 Quan hệ dòng phân lập GBS 152 dòng phân lập xếp vào 29 kiểu trình tự, 14 số xác định lần (Bảng 4) 101 dòng phân lập (66,5% liệu) đại diện cho bốn kiểu trình tự, ST-1, ST-17, ST-19, ST-23 Kiểu trình tự phổ biến (ST17) xác định 44 lần tập liệu, theo sau ST-1 (21dòng phân lập), ST-19 52 (20 dòng phân lập), ST-23 (16 dòng phân lập) ST-3 không xác định tập liệu xác định nghiên cứu thí điểm UPGMA sử dụng để xây dựng biểu đồ từ ma trận khác biệt cặp alen khác 29 kiểu trình tự tất 152 dòng phân lập (Hình 2) BURST nhóm dòng phân lập thành dòng (Hình 2) 3.3.7.3 Mối quan hệ kiểu trình tự, huyết vỏ, mẫu cắt giới hạn Huyết vỏ biết đến tất 152 chủng (Bảng 5), tương quan kết huyết nang ba phòng thí nghiệm Năm chủng chứng minh không phân loại Kiểu huyết III phổ biến (78 chủng, 44 số thuộc ST-17), týp huyết Ia (19 chủng), Ib (17 chủng), V (15 chủng), II (8 chủng), VI (6 chủng), VIII (4 dòng) Kiểu huyết IV VII không đại diện tập liệu Huyết nang nhìn chung không bị giới hạn kiểu trình tự nào, bốn kiểu huyết chứa dòng phân lập với týp huyết vỏ khác Kết đánh máy RDP biết đến với 40 mẫu phân lập tập liệu (Bảng 6) Loại RDP tương quan chặt chẽ với kiểu trình tự; dòng phân lập loại RDP giống theo MLST khác locus đơn 3.3.7.4 Mối quan hệ dòng, chủ thể, nước xuất xứ Các tập liệu trình bày nghiên cứu không thiết kế đặc biệt để điều tra mối quan hệ dòng phân lập nơi xuất xứ Tuy nhiên, quan sát sau thực ST-1 ST-19 có liên quan đáng kể với người mang bệnh số týp huyết vỏ khác trình bày kiểu trình tự 44 chủng vòng ST-17 tất kiểu huyết III ST-17 có liên quan đáng kể với bệnh xâm nhập trẻ sơ sinh ST-23 chứa chủng có kiểu huyết Ia từ người mang mầm người bệnh ST-1, ST-19, ST-17, ST-23 chứa chủng phân lập từ Úc, châu Âu, châu Á Bắc Mỹ, cho thấy phát tán toàn cầu Bảng 3.5 Đặc tính locus hệ thống GBS MLST 53 Bảng 3.6 Chuỗi nucleotid mồi cho GBS MLST 54 Hình 3.5 Cây xác định trình tự locus xây dựng cho Streptococcus nhóm B 55 IV KẾT LUẬN Nhờ thành tựu to lớn rộng khắp nhiều lĩnh vực, PCR thật làm cách mạng sinh học phân tử thời điểm Với kỹ thuật công nghệ ngày tiến bộ, thuốc thử ngày rẻ tốt hơn, giá máy chu kỳ nhiệt ngày hạ đặc biệt việc sử dụng hệ thống nội chống ngoại nhiễm, thử nghiệm PCR không thử nghiệm cao cấp thực phòng thí nghiệm đại Có thể nói PCR hoàn toàn triển khai phòng thí nghiệm trung bình nước ta Hiện có nhiều loại PCR, với ưu nhược điểm nguyên tắc hoạt động khác Vì áp dụng lĩnh vực sống cần phải linh hoạt chọn lựa phương pháp phù hợp với ưu điểm có lợi Một phương pháp định danh vi sinh vật cách xác định trình tự gen đại MLST (Multilocus Sequence Typing) Ra đời vào năm 1998, kĩ thuật trở nên phổ biến việc xác định chủng loài vi sinh vật dựa đoạn DNA nhiều gen giữ nhà (housekeeping gene) đặc thù cho vi sinh vật Gen giữ nhà gen cấu trúc điển hình, chịu trách nhiệm mã hóa cho sản phẩm cần thiết cho tồn chuyển hóa tế bào, tốc độ thay đổi nucleotide tương đối chậm Đối với gen giữ nhà, trình tự khác alen locus cung cấp hồ sơ alen Một loạt hồ sơ sau dấu hiệu nhận biết cho định danh chủng vi sinh vật Sự chia sẻ hồ sơ alen thông qua mạng vi tính giúp cho việc định danh vi sinh vật toàn cầu trở nên nhanh chóng, hiệu Trong nội dung đề tài phân tích ba ứng dụng quan trọng MLST việc định danh vi sinh vật Xác định dòng vi khuẩn gây bệnh Nesseria meningitidis cách nghiên cứu xác định trình tự đoạn khoảng 470-bp từ 11 gen “giữ nhà” 107 chủng Neisseria meningitidis Nhận dạng nhanh chóng loài Enterococcus dựa gen rpoA pheS Và xác định trình tự locus Streptococcus nhóm B 56 Những thành tựu góp phần chứng minh tầm quan trọng MLST y học khoa học, giúp phát vi sinh vật gây bệnh, nghiên cứu khoa học lĩnh vực vi sinh 57 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT Khuất Hữu Thanh, 2005 Cơ chế di truyền phân tử kỹ thuật gen ĐH Bách khoa Hà Nội, Nhà xuất Khoa học kỹ thuật Lê Thị Thúy Dung, Các kỹ thuật PCR ứng dụng Luận văn tốt nghiệp Đại học Nông lâm – TP HCM Lê Thị Thanh Ngọc (2011), Định danh vi sinh vật phương pháp sinh học phân tử Luận văn tốt nghiệp Đại học Bách khoa – Tp HCM Ngô Như Hải (2010), Kỹ thuật PCR (Polymerase chain reaction) Trường Đại học Sư phạm Hà Nội Phạm Hùng Vân (2002), Cẩm nang Các kỹ thuật xét nghiệm vi sinh lâm làng, trường Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh, tr 39,93 TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG ANH Bartual, S.G., H Seifert, C Hippler, M.A Luzon, H Wisplinghoff, AND F Rodriguez – Valera (2005), Development of a multilocus sequence typing scheme for characterization of clinical isolates of Acinetobacter baumannii, J.Clin Microbiol,43, pp 4382 – 4390 Brehony, C.,Jolley, K A., and Maiden, M.C.(2007) Multilocus sequence typing for global surveillance of meningococcal diease FEMS Microbiol.Rev.(31),15 -26 Bygraves, J.A., Urwin, R., Fox A.J., Gray, S.J., Russel, J/E/ Feaversw, I.M., et al (1999) Population genetic and evolutionary approaches to the analysis of Neisseria meningitidis isolates belonging to the ET – complex J.Bacteriol (181),5551 – 5556 Cartwright, K., Reilly, S., White, D., Stuart, J., Begg, N., and Constantine, C (1993) Management of early meninigococcal disease Lancet 342.985-986 10 Cartwright, K., Reilly, S., White, D., Stuart, J (1992) Early treatment with parenteral penicillin in meningococcal disease BMJ.305, 143 – 147 58 11 Chan, M.S., Maiden, M.C., and Spratt, B.G.(2001) Databse – driven multilocus sequencetyping (MLST) of bacteria pathogens Bioinformatics (17), 1077- 1083 12 Clarke, S C (2002) Nucleotid sequence – based typing of bacteria and the impact of automation Bioessays (24), 858 – 862 13 Diggle, M.A., and Clarke, S.C.(2002) What a load of old sequence J.Clin.Microbiol.(40), 2707 14 DeLeo, F.; et al (2014) Molecular dissection of the evolution of carbapenemresistant multilocus sequence type 258 Klebsiella pneumoniae Proceedings of the National Academy of Sciences 111 (13): 4988 15 Diggle, M.A., Bell, C M., and Clarke, S.C.(2003) Nucleotid sequence - based typing of meningococci directly from clinical samples J.Med Microbiol.(52), 505508 16 Dykhuizen, D.E., Polin, D S., Dunn, J J., Wilske, B., Preac Mursic, V., Dattwyler, R.J., et al (1993) Borrelia burgdorferi is clonal: implications for taxonomy and vaccine development Proc Natl.Acad.Sci U S A (90), 10163 -10167 17 Feavers, I M., S.J., Urwin, R., Ruswell, J.E., Bygraves, J.A., Kaczmarki, E.B., et al (1999) Multilocus sequence typing and antigen gene sequencing in the investigation of a meningococcal disease outbreak J.Clin Microbiol.(37), 3883-3887 18 Field, D., Tiwari, B., and Snape, J (2005) Bioinformatics and data management support for environmental genomics, Plos Biol (3),e297 19 Gevers D, Cohan FM, Lawrence JG, Spratt BG, Coenye T, Feil EJ, Stackebrandt E, Van de Peer Y, Vandamme P, Thompson FL and Swings J (2005) Opinion: Reevaluating prokaryotic species Nat Rev Microbiol (9), 733–739 20 Gupta, S., and Maiden, M.C.J (2001) Exploring the evolution of diversity in pathogen populations Trends Microbiol.(9).181-192 59 21 Holmes, E.C., Urwin, R., and Maiden, M.C.J (1999) The influence of recombination on the population structure and evolution of the human pathogen Neisseria meningitidis Mol.Biol.Evol.(16), 741-749 22 Huson, D H (1998) SplitsTree: analyzing and visualizing evolutionary data Bioinformmatics.(14),68-73 23 Jefferies, J., Clarke, S., Diggle, M., Smith, A., Dowson, C., and Mitchell, T (2002) Automated pneumococcal MLST using liquid – handling robotics and a capillary DNA sequencer Mol.Biotechnol.(24), 303-308 24 Jolley, K A., Feil, E J., Chan, M.S., and Maiden, M.C.(2001) Sequence type analysis and recombinational tests (Start) Bioinformaltics (17), 1230 -1231 25 Jolley, K.A., Chan, M.S., and Maiden, M C (2004) mlstdbNet – distributed multi – locus sequence typing (MLST) databses BMC Bioinformatics (5), 86 26 Jolley, Keith Minimum Spanning Tree pubMLST Retrieved 10 October 2013 27 Kriz, P., Kalmusova, J., and Felsberg, J (2002) Multilocus sequence typing of Neiseria mengingitidis directly from cerebrospinal fluid Epidemiol Infect.128, 157160 28 Kumar, S., Tamura, K., and Nei, M (2004) MeGA3: intergrated solfware for molecular evolutionary genetics analysis and sequence alignment Brief Bioinform.(5), 150 -163 29 Maiden, MC.; Bygraves, JA.; Feil, E.; Morelli, G.; Russell, JE.; Urwin, R.; Zhang, Q.; Zhou, J.; et al (Mar 1998) Multilocus sequence typing: a protable approach to the identification of clones within populations of pathogenic microorganisms Proc Natl Acad Sci U S A 95 (6): 3140–5 30 Maiden MC, et al 1998 Multilocus sequence typing: a portable approach to the identification of clones within populations of pathogenic microorganisms Proc Natl Acad Sci U S A (95):3140–3145 60 31 Maiden, M.C.J (2000) High-throughput sequencing in the population analaysic of bacterial pathogens Int J Med Microbiol (290), 183 -190 32 Maiden, M.C (2006) Multilocus sequence typing of bacteria Annu Rev Microbiol 60.561-588 33 Maniatis, T., Fritsch, E.F., and Sambrook, J.(1982) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY 34 Maniatis, T., Fristsch, E.F., and Sambrook, J.(1982) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY 35 Mantel, N (1967) The detection of disease cluteringand ageneralized regression approach Cancer Res 27, 209 – 220 36 Martinc.J Maiden (1998), Multilocus sequence typing: A portable approach to the identification of clones within populations of pathogenic microorganisms Microbiology (95): 3140–3145 37 Mayanard Smith, J., Smith, N., H., O’Rourke, M., and Spratt B.G (1993) How clonal are bacteria? Pro.Natl Acad Sci USA (90), 4384 - 4388 38 Maynard Smith, J., Dowson, C G., and Spratt, B.G (1991) Localized sex in bacteria Nature (349), 29 -31 39 Maynard Smith, J., Feil, E.J., and Smith, N.H (2000) Population structure and evolutionary dynamics of pathogenic bacteria BioEssay (22), 1115 -1122 40 Ni, H., Knight, A I., Cartwright, K., Palmer, Ư.H., and MCFadden, J (1992) Polymerase chain reaction for diagnosis ò meningococcal meningitis Lancet 340, 1432-1434 41 Nicola Jones et al (2003) Multilocus Sequence Typing System for Group B Streptococcus Journal of Clinical Microbiology, June 2003: 2530-3536 61 42 Sabri M Naser et al (2005) Application of multilocus sequence analysis (MLSA) for rapid identification of Enterococcus species based on rpoA andpheS genes, Midrobiology (151): 2141-2150 43 Schneider, S., Roessli, D., and Excof – fier, L (2000) Arlequin Version 2000: A Software for population Genetic Data Analysis University of Geneva, Geneva, Switzerland 44 Selander, R.K., Caugant, D.A., OchMan, H., Muser, J M., Gilmour, M.N., and Whittam, T.S (1986) Methods of multilocus enzyme electrophoresis for bacterial population genetics and systematics Appl Environ Microbiol (51), 837 -884 45 Spratt, Brian G (1999) Multilocus sequence typing: molecular typing of bacterial pathogens in an era of rapid DNA sequencing and the Internet Current Opinion in Microbiology (3): 312–316 46 Spratt, BG; Maiden, MC (1999) Bacterial population genetics, evolution and epidemiology Philos Trans R Soc Lond B Biol Sc 354 (1384): 701–710 47 Staden, R (1996) The Staden swquence analysis package Mol Biol.(5), 233 -241 48 Woodford N, Turton JF, Livermore DM; Turton; Livermore (2011) Multiresistant Gram-negative bacteria: the role of high-risk clones in the dissemination of antibiotic resistance FEMS Microbiology Reviews 35 (5): 736–755 49 Womble, D.D (2000) GCG: The Wisconsin packaage Mol.Biol.(132), -22 50 Wright,S (1951) The genetical Structure of population Ann Eugen.15,323-354 51 Zhang, X B., Shao, Z.J., Yang, E.,Xu, L., Xu, X Y., Li, M.C., et al (2007) Molecular characterization of serogroup C Neisseriameningitidis isolated in China J.Med.Microbiol.(56), 1224-1229 TRANG WEB 52 http://www.genomicepidemiology.org/ 53 http://microbeinotech.com/Default.aspx?tabid=178 62 54 http://123doc.org/document/3365-mot-so-phan-ung-sinh-hoa-dinh-danh-vi-sinhvat.htm 55 https://vi.wikipedia.org/wiki/Vi_sinh_v%E1%BA%ADt 63 [...]... tiến hành nuôi cấy vi sinh vật Trong một số trường hợp vi c nuôi cấy không thể thực hiện được với nhiều loài vi sinh vật hay virus hoặc trong các trường hợp khác cần có thời gian dài nuôi cấy vi sinh vật để có đủ DNA cho các kỹ thuật lai hay định type Khó khăn này được khắc phục bằng các làm tăng nguồn DNA đích một cách nhanh chóng bằng kỹ thuật nhân gen PCR 1.4.3.1 Kỹ thuật nhân gen PCR (Polymerase Chain... khuếch đại mất đi trong toàn bộ quá trình phản ứng 17 Hình 1.3 Quy trình RFLP – PCR để định danh vi sinh vật Kỹ thuật rep – PCR (Repetitive Sequence – Based PCR) : dựa trên nguyên tắc nhân các đoạn gen lặp lại Thuật ngữ rep – PCR là chỉ phương pháp chung sử dụng cặp mồi đặc hiệu để nhân các chuỗi lặp lại phổ biến trong các vi sinh vật thuộc cơ thể nhân sơ Các chuỗi lặp lại có độ bảo thử cao trong các đối... gen dùng toàn bộ gen của các vi sinh vật có mang các đoạn gen bảo thủ này Sau khi điện di có thể phát hiện được trên agarose các đoạn gen có kích thước khác nhau từ các nguồn vi sinh vật khác nhau Phương pháp này dùng cho phát hiện đa hình các đoạng gen chung cho cả vi sinh vật nhân sơ và nhân chuẩn 18 Hình 1.4 Quy trình rep -PCR trong định danh vi sinh vật Bước 1: Mồi repPCR gắn với những trình tự chuyên... đều Ủ trong 45 phút ở nhiệt độ phòng 3 Sản phẩm Pellet PCR bằng cách quay trong một máy ly tâm ở tốc độ tối đa trong 15 phút Đối với đĩa vi, quay cho 1 h ở 2,750 g 4 Bỏ phần nổi và rửa tủa DNA bằng cách thêm 0,5 ml ethanol 70% và quay ở tốc độ tối đa thêm 5 phút Đối với đĩa vi, bổ sung 150 µL 70% ethanol và quay trong 10 phút ở 2,750g 5 Đổ bỏ phần nổi và bột vi n khô trong máy sấy chân không Đĩa vi có... (Polymerase Chain Reaction) a Định nghĩa PCR Là chữ vi t tắt của cụm từ Polymerase Chain Reaction, được dịch là Phản ứng chuỗi trùng hợp, hay "phản ứng khuếch đại gen" PCR là một kỹ thuật phổ biến trong sinh học phân tử nhằm khuếch đại (tạo ra nhiều bản sao) một đoạn DNA mà không cần sử dụng các sinh vật sống như E coli hay nấm men PCR được sử dụng trong các nghiên cứu sinh học và y học phục vụ nhiều mục... Phương pháp phân tích bao gồm vi c tách DNA của nhiễm sắc thể và cắt bằng enzym cắt hạn chế để phân biệt giữa các vi sinh vật khác nhau Vi c tách các mảnh đó được thực hiện dựa vào kỹ thuật điện di trong trường xung điện (PFGE = Pulsed Field Gel Electrophoresis) Chọn enzym cắt hạn chế: Kỹ thuật BRENDA, dựa vào kết quả nghiên cứu các vị trí cắt bộ gen vi sinh vật Kỹ thuật điện di trong trường điện từ: sự... labeling) i Các kỹ thuật PCR dùng trong định danh vi sinh vật Kỹ thuật PCR - RFLP (Restriction Length Fragment Polymorphism): khai thác những khác biệt trong trình tự DNA Sau khi điện di kiểm tra độ sạch của sản phẩm PCR, tiến hành kết tủa với ethanol Kết tủa được hòa với đệm thích hợp và sau đó được xử lý với enzyme cắt hạn chế thích hợp Kiểm tra kết quả thông thường trên gel agarose, trong một số trường... Đối với đĩa vi, bổ sung 150 µL 70% ethanol và quay trong 10 phút ở 2,750g Lặp lại bước này hai lần khi sử dụng đĩa 5 Đổ bỏ phần nổi và bột vi n khô trong máy sấy chân không Đĩa vi khuẩn có thể được làm khô bằng cách quay ngược cho 1 phút ở 500g 2.3.2.5 Phản ứng mở rộng nucleotide 1 Trộn mồi, khuôn mẫu và thuốc thử trình tự theo các tỷ lệ tối ưu 2 Thực hiện các phản ứng mở rộng trong một Máy PCR, lần đầu... dụng PCR Phát hiện vi sinh vật Tính ưu vi t của nó thể hiện ở chỗ có thể chỉ cần một hạt virus hay một tế bào vi khuẩn nào đó cũng đủ cho phản ứng xảy ra và khuếch đại tới mức có thể phát hiện được trong thời gian ngắn Chuẩn bị DNA làm mẫu dò với số lượng lớn cho phép lai DNA Các mẫu dò có thể được đánh dấu bằng phóng xạ hay phi phóng xạ khi tiến hành phản ứng khuếch đại Mẫu dò đánh dấu với kỹ thuật PCR. .. gen trung tâm của khu phức hợp vô tính Các chương trình eBURST nhóm ST thành các nhóm theo tiêu chí xác định một số alen tương đồng với ít nhất một thành vi n khác của nhóm Các kiểu gen trung tâm của một nhóm Burst sẽ là cá thể có số lượng cao nhất của các biến thể locus đơn (SLVs) Điều này thường sẽ trùng với một trong những phân lập thường xuyên và do đó cung cấp một số ý nghĩa sinh học đến vi c chỉ