XÁC NHẬN GIÁ TRN SỬ DỤNG PHƯƠNG PHÁP & ƯỚC LƯỢNG ĐỘ KHÔNG ĐẢM BẢO ĐO TRONG PHÂN TÍCH VI SINH VẬT

XÁC NHẬN GIÁ TRN SỬ DỤNG PHƯƠNG PHÁP & ƯỚC LƯỢNG ĐỘ KHÔNG ĐẢM BẢO ĐO TRONG PHÂN TÍCH VI SINH VẬT ThS.. LỰA CHỌN PHƯƠNG PHÁP Yêu cầu chung: • PTN cần lựa chọn các phương pháp phân tích

XÁC NHẬN GIÁ TRN SỬ DỤNG PHƯƠNG PHÁP

& ƯỚC LƯỢNG ĐỘ KHÔNG ĐẢM BẢO ĐO

TRONG PHÂN TÍCH VI SINH VẬT

ThS Trương Huỳnh Anh Vũ

Phòng Vi Sinh

NỘI DUNG

1   PHÂN LOẠI PHƯƠNG PHÁP

2   XÁC NHẬN GIÁ TRN SỬ DỤNG PHƯƠNG PHÁP

3   MỘT SỐ THUỘC TÍNH CẦN XÁC ĐNNH

4   ƯỚC LƯỢNG ĐỘ KHÔNG ĐẢM BẢO ĐO

5   ĐẢM BẢO CHẤT LƯỢNG KẾT QUẢ THỬ NGHIỆM

6   THỰC HÀNH ƯỚC LƯỢNG ĐKĐBĐ

PHÂN LOẠI PHƯƠNG PHÁP

PHÂN LOẠI PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH

1 Phương pháp tiêu chuẩn

- Phương pháp thử theo tiêu chuẩn quốc gia, quốc tế, hiệp hội khoa học được chấp nhận rộng rãi trên thế giới

- Phương pháp thử đã được công nhận hiệu lực ở phạm

vi quốc tế hoặc quốc gia và được áp dụng rộng rãi VD: ISO, FDA, BS, TCVN,…

2 Phương pháp không tiêu chuẩn/phương pháp nội bộ

- Phương pháp do phòng thử nghiệm tự xây dựng, phương pháp theo hướng dẫn của nhà sản xuất thiết bị, phương pháp theo các tạp chí, tài liệu chuyên ngành VD: Kit phát hiện, các phương pháp phát hiện/định lượng nhanh VSV,…

PHÂN LOẠI PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH (tt)

LỰA CHỌN PHƯƠNG PHÁP

Yêu cầu chung:

•  PTN cần lựa chọn các phương pháp phân tích có

thể cho kết quả phù hợp với mục đích sử dụng cụ thể, nói cách khác: có thể đưa ra kết quả đáng tin cậy trước một yêu cầu cụ thể

•  Nếu có nhiều hơn một phương pháp thì PTN cần

nêu rõ tiêu chí sử dụng mỗi loại

ISO 17025 nói gì:

Mục 5.4.2

•  PTN phải sử dụng các phương pháp, kể cả phương pháp lấy

mẫu, đáp ứng yêu cầu của khách hàng và thích hợp với phép thử

•  Ưu tiên sử dụng phương pháp tiêu chuẩn quốc tế, quốc gia

hoặc khu vực

•  PTN phải đảm bảo sử dụng bản tiêu chuẩn mới nhất, trừ khi

nó không phù hợp với mục đích hoặc không có khả năng thực hiện

•  PTN cũng có thể sử dụng phương pháp thử nội bộ, phương

pháp thử không tiêu chuẩn nếu thích hợp với mục đích sử

LỰA CHỌN PHƯƠNG PHÁP (tt)

XÁC NHẬN GIÁ TRN SỬ DỤNG

PHƯƠNG PHÁP

XNGTSD CỦA PHƯƠNG PHÁP ?

Theo ISO/TR 13843:2000

Quy trình thực hiện để chứng minh là phương pháp thử

có thể phát hiện hay định lượng vi sinh vật mục tiêu hoặc nhóm vi sinh vật phù hợp với độ chụm và độ chính xác

“XNGTSD của phương pháp phân tích là

một phần không thể thiếu nếu muốn có một kết quả phân tích đáng tin cậy”

TẠI SAO CẦN XNGTSD CỦA PHƯƠNG PHÁP ?

•  Đáp ứng yêu cầu của tổ chức đánh giá

•  Đảm bảo phương pháp cho kết quả đúng

•  Bằng chứng khách quan cho việc kiểm soát chất lượng thử nghiệm

•  Đáp ứng kỳ vọng của khách hàng về chất lượng của kết quả thử nghiệm

Theo ISO 17025, phương pháp phân tích phải

- Sau khoảng một thời gian không sử dụng phương pháp đó

AI XNGTSD PHƯƠNG PHÁP?

•   Thử nghiệm viên/ người phân tích

- Xây dựng một phương pháp thử nội bộ, XNGTSD các phương pháp mới

- Kiểm tra thực nghiệm các thông số của một phương pháp

2/20/19

QUI TRÌNH XNGTSD CỦA PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH

VI SINH VẬT

CHUẨN BN CHO XNGTSD PHƯƠNG PHÁP

- PTN cần biên soạn Qui trình nội bộ (SOP) bằng văn bản, dựa trên phương pháp tham chiếu nhưng mô tả ngắn gọn, chính xác các yêu cầu: hóa chất, thiết bị, điều kiện môi trường … và các bước tiến hành

- Lập kế hoạch chi tiết cho quá trình XNGTSD phương pháp

- Phân công trách nhiệm/ thực hiện

LẬP KẾ HOẠCH XNGTSD PHƯƠNG PHÁP

PTN cần xem xét các đặc điểm:

•  Nhu cầu chi tiết của khách hàng hoặc yêu cầu từ các cơ quan

quản lí liên quan

•  Cái gì thực tế có thể phân tích được/ nền mẫu?

•  Các điều kiện thực nghiệm của PTN

- Điều kiện kỹ thuật cụ thể trong phép thử?

- Thiết bị? Chủng chuẩn/ vật liệu chuẩn?

2/20/19

1.  Mẫu thử

2.  Chủng chuẩn

3.  Kiểm nghiệm viên

4.  Môi trường nuôi cấy Thu thập số liệu

Phương pháp đã được XNGTSD

MỘT SỐ THUỘC TÍNH CẦN XÁC ĐNNH

1 Độ đúng (trueness)

Độ đúng chỉ mức độ gần nhau giữa giá trị trung bình của kết quả thử nghiệm và giá trị thực hoặc giá trị được chấp nhận là đúng

2/20/19

Không chụm‌/Không đúng

Không chính xác

Chụm‌/Không đúng Không chính xác

Đúng/Không chụm Đúng/Chụm

Minh họa khái niệm độ chính xác (độ chụm và độ đúng)

2/20/19

Trong đó:

TP (True Positive): Dương tính đúng (Mẫu chứng có kết quả dương tính, kết quả phân tích cho kết quả dương tính)

FP (False Positive): Dương tính giả (Mẫu chứng có kết quả

âm tính, kết quả phân tích cho kết quả dương tính)

FN (False Negative): Âm tính giả (Mẫu chứng có kết quả dương tính, kết quả phân tích cho kết quả âm tính)

TN (True Negative): Âm tính đúng (Mẫu chứng có kết quả

âm tính, kết quả phân tích cho kết quả âm tính)

N = TP + FP + FN + TN: Tổng số các kết quả

Trong đó:

S r : Độ lệch chuẩn lặp lại n: Số lần thực hiện

x i : Kết quả phân tích của mỗi lần thực hiện

i r

n

x

x S

x_ x = log (CFU)

5.1 Độ lặp lại của phương pháp khi áp dụng tại phòng thí nghiệm

Trong đó: S ri là độ lặp lại của mỗi KNV

5.2 Giới hạn lặp lại (r) của phương pháp

r

S

2/20/19

6 Độ tái lặp reproducibility/ Độ lệch chuẩn tái lặp S R

(Reproducibility standard deviation)

Quá trình thực hiện thử nghiệm trên các mẫu thử đồng nhất thực hiện cùng một phương pháp, trong các phòng thí nghiệm khác nhau, với những người thao tác khác nhau, sử dụng thiết bị khác nhau

Trong đó:

SR: Độ lệch chuẩn tái lập n: Số lần thực hiện

iB

iA R

y

y n

S

1

2

2 1

5.1 Độ tái lặp của phương pháp khi áp dụng tại phòng thí nghiệm

Trong đó: S rj là độ lặp lại của mỗi KNV

5.2 Giới hạn tái lặp (R) của phương pháp

2/20/19

7 Giới hạn phát hiện (limit of detection)

- Giới hạn phát hiện của một phương pháp là nồng độ vi sinh vật thấp nhất trong mẫu có thể xác định được bằng phương pháp đó

- Đối với phương pháp định tính giới hạn phát hiện được tính ở nồng độ có tối thiểu 90% mẫu có kết quả dương tính

ƯỚC LƯỢNG ĐỘ KHÔNG ĐẢM BẢO ĐO

2/20/19

?

2/20/19

2/20/19

1   “ Thông số đặc trưng cho sự phân tán của các giá trị

đo, được qui cho đại lượng đo dựa trên các thông tin

đã sử dụng” (ISO/IEC GUIDE 99:2007)

2   “ Thông số không âm đặc trưng cho độ phân tán của các giá trị định lượng được qui cho đại lượng đo, dựa trên các thông tin được sử dụng” (VIM, JCGM

200:2008, 2010)

TẠI SAO CẦN ƯỚC LƯỢNG ĐKĐBĐ ?

1   Tiêu chuẩn ISO/IEC 17025 yêu cầu ?

2   Khách hàng yêu cầu ?

3   Xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp ?

4   Yêu cầu từ các cơ quan công nhận ?

5   Chính PTN phải biết chất lượng thử nghiệm của mình

để có cải tiến thích hợp

QUI TRÌNH ƯỚC LƯỢNG ĐKĐBĐ

Lựa chọn PP thực hiện

Xác định nguồn gây ra độ

không đảm bảo đo

Tính toán độ không đảm bảo

2.  Lấy mẫu: Lấy mẫu không đại diện, không đồng nhất

3.  Điều kiện bảo quản: Quá trình vận chuyển, bảo quản và thời gian bảo quản mẫu có thể ảnh hưởng lớn đến kết quả phân tích

4.  Chuẩn bị mẫu: Quá trình đồng nhất, cân mẫu, chiết tách

5.  Dung môi và thuốc thử: Độ tinh khiết, tạp chất

6.  Thiết bị: Thiết bị có những sai số trong quá trình hiệu chuẩn hoặc chưa được hiệu chuẩn, sai số ở các khoảng đo khác nhau

7.  Điều kiện môi trường: Các ảnh hưởng của nhiệt độ, độ ẩm

8.  Con người: Kỹ năng, trình độ, sai số tính toán

9.  Nguồn ngẫu nhiên khác

CÁC NGUỒN CHÍNH GÂY ĐKĐBĐ TRONG

PHÂN TÍCH VI SINH

MỘT SỐ LƯU Ý KHI ƯỚC LƯỢNG ĐKĐBĐ

mục đích dự kiến của phép thử và việc sử dụng kết quả thử nghiệm

2   Nên tính toán/ước lượng ĐKĐBĐ tại các nồng độ

“chính yếu”, “nhạy cảm”

ƯỚC LƯỢNG ĐKĐBĐ TRONG PHÂN TÍCH VI SINH

THAM KHẢO ISO/TS 19036:2006

PHẠM VI ÁP DỤNG

1.  Hướng dẫn ước lượng độ không đảm bảo đo cho các

phương pháp định lượng vi sinh vật trong thực phẩm bằng kỹ thuật đếm khuẩn lạc

2.  Các dạng thực phẩm cho người, thức ăn gia súc, các mẫu

môi trường …

3.  Cách tiếp cận tính ĐKĐBĐ dựa trên “standard deviation

of reproducibility of the final result of the measurement

”/ độ lệch chuẩn tái lặp của kết quả đo cuối cùng

4.  Không áp dụng cho trường hợp định lượng bằng kỹ thuật

MPN

5.  Đối với các phép thử kĩ thuật MPN thì giới hạn độ tin cậy

của kết quả đo là 95% (tra bảng)

2/20/19

ƯỚC LƯỢNG ĐỘ LỆCH CHUẨN TÁI LẶP S R

1   Độ lệch chuẩn tái lặp nội bộ PTN

2   Các nghiên cứu thử nghiệm liên phòng

3   Các chương trình thử nghiệm thành thạo

NGUYÊN TẮC CHUNG ƯỚC TÍNH S R

1.  Ước tính cho từng loại vsv đích (hoặc nhóm vsv)

2.  Cho từng loại mẫu/nền mẫu (hoặc nhóm mẫu)

3.  Ít nhất thực hiện với 10 mẫu

4.  Lặp lại qui trình trong các ngày khác nhau

5.  Ưu tiên cho các mẫu nhiễm bẩn tự nhiên

6.  Mẫu được chọn sao cho bao gồm dải nồng độ như

trong thử nghiệm hàng ngày

2/20/19

NGUYÊN TẮC CHUNG ƯỚC TÍNH S R

2/20/19

2 Phân biệt giữa số đếm thấp và cao (tùy chọn)

Đối với các số đếm cao, công thức (1) có thể được đơn giản hóa thành công thức (2):

Giá trị giới hạn, C lim được tính theo công thức (3):

Hai trường hợp có thể được phân biệt:

Nếu ∑C > C lim , sử dụng công thức (2) để tính U Nếu ∑C ≤ C lim , sử dụng công thức (1) để tính U Chú ý: Việc tính toán C là không cần thiết khi công thức

22

2

210lim

75

1 ) 1 )

05 0 1 ((

) (log

2/20/19

3 Biểu diễn độ không đảm bảo đo trong báo cáo kết quả thử nghiệm

x cfu/g [10 y-U , 10 y+U ]

x cfu/ml [10 y-U , 10 y+U ] ƯỚC LƯỢNG ĐKĐBĐ (tt)

ĐẢM BẢO CHẤT LƯỢNG KẾT QUẢ THỬ NGHIỆM

1 KIỂM TRA TAY NGHỀ KNV (S r )

3 ƯỚC LƯỢNG ĐỘ KHÔNG ĐẢM BẢO ĐO (U)

4 THỰC HIỆN MẪU BLANK

5 SỬ DỤNG CHUẨN CHỦNG KHI PHÂN TÍCH

MỘT SỐ TÀI LIỆU LIÊN QUAN

•  ISO/IEC 17025:2005 - General requirements for the

competence of testing and calibration laboratories

•  AGL 04 (BoA) - Yêu cầu bổ sung để công nhận các phòng

thử nghiệm lĩnh vực Sinh

•  ISO/TR 13843:2000 - Water quality - Guidance on

validation of microbiological methods

•  ISO/TS 19036:2006 (TCVN9332:2012): Hướng dẫn về

ước lượng độ không đảm bảo đo định lượng

“Microbiology of food and animal feeding stuffs — Guidelines for the estimation of measurement uncertainty for quantitative determinations” AMENDMENT 1: measurement uncertainty for low counts