Xác định giá trị sử dụng phương pháp PCR để phát hiện Vibrio cholerae trong mẫu thủy hải sản

Vibrio Cholerae là một trong những tác nhân gây bệnh tiêu chảy nguy hiểm lây truyền qua đường nước và thực phẩm. Việc xác định bằng kỹ thuật sinh học phân tử, phương pháp PCR, là cần thiết nhằm đáp ứng nhanh cho công tác phát hiện sớm vi sinh gây bệnh trong thực phẩm, giúp phát hiện kịp thời bệnh tiêu chảy do Vibrio cholerae gây ra thông qua thực phẩm.

Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số * 2016 Nghiên cứu Y học XÁC ĐỊNH GIÁ TRỊ SỬ DỤNG PHƯƠNG PHÁP PCR ĐỂ PHÁT HIỆN VIBRIO CHOLERAE TRONG MẪU THỦY HẢI SẢN Nguyễn Đỗ Phúc* TÓM TẮT Đặt vấn đề: Vibrio Cholerae tác nhân gây bệnh tiêu chảy nguy hiểm lây truyền qua đường nước thực phẩm Việc xác định kỹ thuật sinh học phân tử, phương pháp PCR, cần thiết nhằm đáp ứng nhanh cho công tác phát sớm vi sinh gây bệnh thực phẩm, giúp phát kịp thời bệnh tiêu chảy Vibrio cholerae gây thông qua thực phẩm Mục tiêu nghiên cứu: Xác định giá trị sử dụng phương pháp PCR phát Vibrio choleare thủy hải sản Phương pháp: Khảo sát độ chọn lọc độ đặc hiệu phương pháp PCR Đánh giá thông số kỹ thuật phương pháp PCR: giới hạn phát hiện, độ nhạy tương đối, độ xác tương đối, độ đặc hiệu tương đối, tỷ lệ dương tính giả âm tính giả theo ISO/TS 16140 (2003) NordVal (2009) Kết quả: Giới hạn phát 50% (LOD50) phương pháp PCR mẫu (nghêu: 1-3 CFU/25g, sò: 0-1 CFU/25g hến: 4- CFU/25g) Riêng mẫu hàu chưa đạt yêu cầu (>9 CFU/25g) Các thông số kỹ thuật phương pháp PCR: Độ xác (AC), độ đặc hiệu (SP), độ chọn lọc (SE) mẫu nghêu, sò hến với tỷ lệ dương tính giả (FP) âm tính giả (FN) đạt yêu cầu theo tiêu chuẩn ISO/TS 16140 (2003) NordVal (2009) Kết luận: Phương pháp PCR ứng dụng để phát Vibrio cholerae mẫu thủy hải sản với mẫu nghêu, sò hến Từ khóa: PCR, Vibrio cholerae, thủy hải sản ABSTRACT VALIDATION OF PCR METHOD FOR DETECTION OF VIBRIO CHOLERAE IN SEAFOOD Nguyen Do Phuc * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Supplement of Vol 20 - No - 2016: 369 - 373 Background: Vibrio cholerae is one of the dangerous diarrheal pathogen transmitted through water and food Applying a molecular method, polymerase chain reaction (PCR), is necessary for early detection of Vibrio cholerae infection through foods Objectives: To assess validation of PCR method for detection of Vibrio cholera in seafood Methods: Identify selectivity and validation of PCR method for detection of Vibrio cholerae in seafood with parameters: Limit detection 50 (LOD50), Sensitivity (SE), Specificity (SP), Accuracy (AC) False Positive (FP) and False Negative (FN) according to ISO/TS 16140 (2003) and NordVal (2009) Results: Limit of detection 50 (LOD50) were for clam (1-3 CFU/25 g), mussel (0-1 CFU/25g), baby clam (46 CFU/25g), but oyster did not meet the requirement (>9 CFU/25g) Technical parameters: Accuracy (AC); Specificity (SP); Sensitivity (SE) False Positive (FP) and False Negative (FN) of PCR method on the three samples met the standard requirements Conclusion: PCR is an applicable method for detection of Vibrio cholerae in seafood, especially in clam, mussel and baby clam * Viện Y tế công cộng TP Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: TS Nguyễn Đỗ Phúc ĐT: 0907669008 Chuyên Đề Y Tế Công Cộng Email: nguyendophucihph@gmail.com 369 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số * 2016 Key words: PCR, Vibrio cholerae, seafood ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh tả bệnh truyền nhiễm cấp tính đường tiêu hoá phẩy khuẩn tả (Vibrio cholerae) gây nên Bệnh thường biểu với triệu chứng lâm sàng đột ngột, nhanh nặng Nếu không điều trị kịp thời dẫn tới tử vong vài xếp vào loại bệnh “cực kỳ nguy hiểm” Theo số liệu Tổ chức Y tế giới (WHO), khoảng 30 nước có bệnh tả lưu hành, chủ yếu Châu Á Châu Phi Mỗi năm ước tính trung bình có triệu trường hợp mắc bệnh tả, số tử vong khoảng 200.000 Châu Phi 100.000 Châu Á, 1/3 trẻ em tuổi 1/4 trẻ em từ 5-14 tuổi, số lại người lớn (2) Ở Việt Nam, bệnh tả V cholerae O1 ElTor xuất năm 1964, ước tính có hàng trăm ngàn người mắc bệnh Dịch tả lưu hành chủ yếu miền Nam, miền Trung, miền Bắc lẻ tẻ du nhập từ miền Nam Từ năm sau đó, có ca lẻ tẻ xảy không bùng phát thành dịch lớn Cuối năm 2007 đầu năm 2008, dịch tả quay trở lại nước ta xuất nhiều tỉnh thành nước Những năm sau nay, hàng năm nước ta phải đối mặt với vụ dịch tả lẻ tẻ xuất nước xảy nhiều tỉnh thành Việc phòng chống bệnh tả nước tuyên truyền rộng rãi phương tiện thông tin đại chúng Gần vụ dịch tả xảy nhiều nơi giới Việt Nam quốc gia chịu ảnh hưởng lớn dịch tả với nhiều vụ dịch xảy đặc biệt vùng nông thôn vùng sông nước Do việc giám sát dịch tễ học vi khuẩn V cholerae vấn đề quan trọng cần thiết nhằm phát xử lý dịch kịp thời Việc áp dụng phương pháp nhanh dễ áp dụng để phát V.cholerae, đặc biệt nước thực phẩm cần thiết Phương pháp nuôi cấy truyền thống 370 áp dụng nhiều phòng thí nghiệm AOAC 988-20:2010, FDA (chương 9), TCVN 7905-1:2008 [ISO 21872-1:2007(E)] Tuy nhiên, phương pháp ni cấy đòi hỏi nhiều ngày, chưa đáp ứng nhanh cho cơng tác tìm ngun nhân tiêu chảy tả PCR phương pháp lựa chọn để phát nhanh V cholerae sở phát đoạn gen ctxAB gây bệnh tả với thời gian nhanh vòng 24 Để có sở chứng minh lực phòng thí nghiệm áp dụng phương pháp PCR phát V cholerae hay không, việc xác nhận giá trị sử dụng phương pháp yêu cầu bắt buộc theo ISO 17025 Do đề tài tiến hành với mục tiêu sau (1,3) Mục tiêu nghiên cứu Sử dụng chủng chuẩn Vibrio cholerae để kiểm chứng qui trình ni cấy theo TCVN 7905-1:2008 [ISO 21872-1:2007(E)] (4) Đánh giá thông số phương pháp PCR phát V cholerae nuôi cấy phát V cholerae theo BAM-FDA, chương 28 so với phương pháp nuôi cấy truyền thống theo TCVN 7905-1:2008 [ISO 21872-1:2007 (E)], gồm thông số sau: LOD50, Độ chọn lọc, Độ nhạy, Độ đặc hiệu, Tỷ lệ dương tính giả, Tỷ lệ âm tính giả Độ xác ĐỐITƯỢNG-PHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU Đối tượng nghiên cứu Chủng vi khuẩn Chủng chứng dương (chủng đích): Vibrio choleraee - Ogawa ATCC 17803; Inaba ATCC 17804 Chủng chứng âm (chủng khơng đích): Vibrio parahaemolyticus ATCC 17802, E coli ATCC 25923, Salmonella paratyphi ATCC 9150, Shigella sonnei ATCC 9290, Proteus ATCC 17258, Klebsiella ATCC 27489 Chuyên Đề Y Tế Công Cộng Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số * 2016 Thực phẩm Nghêu, sò, hến hàu Phương pháp nghiên cứu Phương pháp PCR Theo FDA, chương 18 (5) Quy trình PCR: ly trích DNA nhiệt 100 C/10 phút, làm lạnh sau đun khay có đá 10 phút Ly tâm 15.000 vòng/5 phút, hút 1µl dịch chiết DNA cho vào 24µl master mix PCR khuếch đại DNA theo chu kỳ nhiệt Chu kỳ nhiệt: biến tính ban đầu 95oC/15 phút lặp lại 35 chu kỳ: 95oC/1 phút, 55 oC/1 phút, kết thúc kéo dài 72oC/10 phút Sản phẩm sau phản ứng PCR điện di gel agarose 2,5% có bổ sung Gelred Điện di 30 phút Sau quan sát kết máy chụp hình điện di tia UV có bước sóng 312nm Kết kích thước sản phẩm PCR 777bp Phương pháp khảo sát giá trị sử dụng phương pháp Theo ISO/TS 16140 (2003) NordVal (2009) (1,3) Khảo sát độ chọn lọc phương pháp PCR dùng cho phát gene ctx Vibrio cholerae chủng vi khuẩn khơng đích Chủng Vibrio cholerae tăng sinh peptone kiềm chủng khơng đích khác tăng sinh BHI 37oC/20 sau tách chiết DNA để thực PCR Khảo sát thông số kỹ thuật qui trình PCR Giới hạn phát (LOD50), mức chấp nhận ≤ CFU/25g thực phẩm: Chủng Vibrio cholerae tăng sinh peptone kiềm 37oC/20 giờ, pha loãng chủng nồng độ để đạt yêu cầu ≤9 CFU/25 g mẫu thực phẩm gây nhiễm vào mẫu tăng sinh peptone kiềm (khoảng nồng độ, nồng độ pha loãng xác nhận số vi khuẩn thực tế kiểm tra TSA 1% muối) Ủ 37oC/20 giờ, tách chiết DNA chạy PCR Chuyên Đề Y Tế Công Cộng Nghiên cứu Y học Khảo sát độ nhạy tương đối (Se), độ đặc hiệu tương đối (Sp), độ xác tương đối (AC), tỷ lệ dương tính giả (FP) âm tính giả (FN) Trên mẫu: nghêu, sò hến, mẫu chọn 60 mẫu, 30 mẫu nhiễm chủng Vibrio cholerae với mật độ vi khuẩn 10xLOD50 30 mẫu không nhiễm chủng Các mẫu đánh số theo thứ tự, mù mẫu cho kiểm nghiệm viên thực mẫu với hai phương pháp PCR nuôi cấy Kết tổng hợp xử lý số liệu theo ISO/TS 16140 (2003) NordVal (2009) Phương pháp nuôi cấy Theo TCVN 7905-1:2008 [ISO 218721:2007(E)] (4) KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Khảo sát tính chọn lọc phương pháp multiplex- PCR Các chủng đích Vibrio cholera Ogawa Inaba tăng sinh peptone kiềm chủng khơng đích (Vibrio parahaemolyticus, E coli, Salmonella paratyphi, Shigella sonnei, Proteus, Klebsiella) tăng sinh canh thang BHI, ủ 37oC/24h Chủng đích trộn chung để sử dụng làm chứng dương Từ canh khuẩn này, tách chiết DNA tiến hành thực phản ứng PCR với chủng chứng dương, chứng âm Nuclease – free H2O DNA chủng khơng đích, sau tiến hành điện di Kết điện di trình bày hình 1, cho thấy giếng với chủng chứng dương xuất vạch tương ứng với kích thước gene ctx gây bệnh Vibrio cholerae, tất giếng lại (các vi khuẩn khơng đích) không xuất vạch đặc trưng với chứng dương Điều thể khả đặc hiệu phương pháp PCR gene ctx cho Vibrio choleare Khảo sát thông số kỹ thuật phương pháp PCR: giới hạn phát hiện, độ nhạy tương đối, độ xác tương đối, độ đặc hiệu tương 371 Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số * 2016 Nghiên cứu Y học đối, tỷ lệ dương tính giả âm tính giả theo ISO/TS 16140 (2003) nghiệm lần; mức nhiễm khác La1, La2, La3 thực lần Kết PCR thể bảng Bảng 1: Giới hạn phát phương pháp PCR mẫu Nền mẫu Vibrio cholerae Ogawa Vibrio cholerae Inaba 1-3 CFU/25g 1-3 CFU/25g Nghêu 0-1 CFU/25g 0-1 CFU/25g Sò 4-6 CFU/25g 4-6 CFU/25g Hến > CFU/25g > CFU/25g Hàu 10 Hình 1: Kết khảo sát tính chọn lọc phương pháp PCR Chú thích: Giếng 10 MK: Thang DNA chuẩn 100bp; 9, (-): chứng âm; (+): Chứng dương V cholerae Inaba (777bp); (+): Chứng dương V cholerae Ogawa; 6: Salmonella; 5: Shigella; 4: Klebsiella, 3: E coli; 2: Proteus, 1: Vibrio paraheamolyticus Giới hạn phát (LOD50) Khảo sát giới hạn phát phương pháp PCR việc sử dụng chủng đích với mức gây nhiễm khác nhau: Lo- Không gây nhiễm; La1, La2, La3- có mức nhiễm 10 CFU/25g mức nhiễm L50 với khoảng 10-50 CFU/25g Các mức gây nhiễm nhiễm vào mẫu thực phẩm (nghêu, sò, hến hàu) tăng sinh canh thang peptone kiềm, ủ 37oC/20h Tiến hành thử nghiệm phản ứng PCR, với mức nhiễm Lo L50 thử Các mẫu nghêu, sò hến đạt yêu cầu giới hạn phát Riêng mẫu hàu LOD50 là: > CFU/25g chưa đáp ứng giới hạn phát theo ISO/TS 16140 (2003) Do mẫu hàu không tiếp tục khảo sát thông số Xác định độ (accuracy-AC), độ đặc hiệu (specificity-SP), độ nhạy (sensitivitySE) theo ISO/TS 16140 (2003) Tiến hành thử nghiệm với 60 mẫu mẫu (nghêu, sò hến), 30 mẫu gây nhiễm với nồng độ 10xLOD50 30 mẫu không gây nhiễm Sau gây nhiễm, tăng sinh pepton kiềm, tiến hành thực phản ứng multiplex-PCR, thu kết theo bảng Từ kết bảng 2, tiến hành tính tốn thu giá trị thơng số phương pháp PCR (bảng 3) Bảng 2: Kết xác định giá trị sử dụng phương pháp PCR so với phương pháp nuôi cấy Kết phương pháp PCR(FDA-Chương 18) Dương tính (+) Âm tính (-) Kết phương pháp ni cấy (TCVN 7905-1:2008) Nghêu Sò Hến Dương tính (+) Âm tính (-) Dương tính (+) Âm tính (-) Dương tính (+) Âm tính (-) 28/29 1/30 28/30 0/30 27/29 2/30 1/29 29/30 2/30 30/30 2/29 28/30 Bảng 3: Kết xác định giá trị sử dụng phương pháp PCR mẫu khảo sát Nền mẫu Nghêu Sò Hến Tiêu chí 372 Tỷ lệ âm tính giả ND Tỷ lệ dương tính giả Độ xác tương Độ nhạy tương đối (%) PD (%) đối AC (%) SE (%) 3,45 3,33 96,6 96,55 6,67 96,67 93,33 6,9 6,67 93,22 93,1 ≤ 10 ≤ 10 ≥ 90% ≥ 90% Độ đặc hiệu tương đối SP (%) 96,67 100 93,33 ≥ 90% Chuyên Đề Y Tế Cơng Cộng Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số * 2016 Nghiên cứu Y học Giá trị sử dụng phương pháp PCR phát Vibrio cholerae với thơng số: độ xác (AC), độ đặc hiệu (SP), độ xác (SE), tỷ lệ dương tính giả (FP) tỷ lệ âm tính giả (FN) đạt theo qui định ISO/TS 16140 (2003) mẫu nghêu, sò hến giá trị sử dụng phương pháp PCR mẫu (nghêu, sò hến) đạt theo qui định ISO/TS 16140 (2003) KẾT LUẬN TÀI LIỆU THAM KHẢO Tính chọn lọc phương pháp PCR chủng khơng đích: Phương pháp PCR đặc hiệu gene ctx Vibrio choleare Giới hạn phát (LOD50) phương pháp PCR mẫu (nghêu, sò hến): Nghêu: vào khoảng 0-3 CFU/25g Sò: vào khoảng 0-1 CFU/25g Hến: vào khoảng 4-6 CFU/25g Mẫu hàu không đạt LOD50 theo quy định: tiếp tục nghiên cứu để tìm hiểu ảnh hưởng mẫu hàu lên phản ứng PCR Giá trị sử dụng phương pháp PCR mẫu nghêu, sò hến đạt tiêu chí độ xác, độ nhạy, độ đặc hiệu, tỷ lệ dương tính giả tỷ lệ âm tính giả.Kết Chuyên Đề Y Tế Công Cộng Áp dụng phương pháp PCR phát Vibrio cholerae để khảo sát tiếp tục mẫu hải sản để có số liệu thực tế International Standard (2003) ISO/TS 16140- Microbiology of food and animal feeding stuffs –Protocol for the validation of alternative methods, pp 1-64 Laboratory Methods for the Diagnosis of Vibrio cholerae Centers for Disease Control and Prevention (2004) - Detection of Cholera Toxin, pp 64-88 NordVal (2009) Protocol for validation of alternative microbiological methods, pp 1-16 TCVN 7905-1(2008) [ISO 21872-1:2007(E)] Phương pháp phát Vibrio cholerae Vibrio parahaemolyticus, trang 1-13 Walter HK, William LP, Thomas AC (2001) Chapter 28: Detection of Enterotoxigenic Vibrio cholerae in Foods by the Polymerase Chain Reaction Bacteriological Analytical Manual, FDA, pp 1-6 Ngày nhận báo: 22/4/2016 Ngày phản biện nhận xét báo: 19/7/2016 Ngày báo đăng: 05/10/2016 373 ... thu giá trị thơng số phương pháp PCR (bảng 3) Bảng 2: Kết xác định giá trị sử dụng phương pháp PCR so với phương pháp nuôi cấy Kết phương pháp PCR( FDA-Chương 18) Dương tính (+) Âm tính (-) Kết phương. .. thước sản phẩm PCR 777bp Phương pháp khảo sát giá trị sử dụng phương pháp Theo ISO/TS 16140 (2003) NordVal (2009) (1,3) Khảo sát độ chọn lọc phương pháp PCR dùng cho phát gene ctx Vibrio cholerae. .. tả PCR phương pháp lựa chọn để phát nhanh V cholerae sở phát đoạn gen ctxAB gây bệnh tả với thời gian nhanh vòng 24 Để có sở chứng minh lực phòng thí nghiệm áp dụng phương pháp PCR phát V cholerae