biểu hiện của gen nox4 trên tế bào dây chằng nha chu người dưới tác động của hợp chất dung giải tế bào porphyromonas gingivalis

BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG BIỂU HIỆN CỦA GEN NOX4 TRÊN TẾ BÀO DÂY CHẰNG NHA CHU NGƯỜI DƯỚI TÁC ĐỘNG CỦA HỢP CHẤT DUNG GIẢI TẾ BÀO PORPHYROMONAS GINGIVALIS Mã số: Chủ nhiệm đề tài: TS Nguyễn Thu Thủy Tp Hồ Chí Minh, tháng năm 2018 BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG BIỂU HIỆN CỦA GEN NOX4 TRÊN TẾ BÀO DÂY CHẰNG NHA CHU NGƯỜI DƯỚI TÁC ĐỘNG CỦA HỢP CHẤT DUNG GIẢI TẾ BÀO PORPHYROMONAS GINGIVALIS Mã số: Chủ nhiệm đề tài Tp Hồ Chí Minh, tháng năm 2018 Danh sách thành viên tham gia nghiên cứu đề tài TS BS Nguyễn Thu Thủy Đơn vị công tác: Bộ môn Nha chu, Khoa Răng Hàm Mặt, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh PGS TS Rudee Surarit Đơn vị công tác: Khoa Nha, Đại học Mahidol, Thái Lan Đơn vị phối hợp Khoa Nha, Đại học Mahidol, Thái Lan MỤC LỤC Trang Danh mục bảng Danh mục chữ viết tắt Thông tin kết nghiên cứu Mở đầu Tổng quan Mục tiêu 15 Đối tượng phương pháp nghiên cứu 16 Kết 18 Kết luận kiến nghị 19 Tài liệu tham khảo 21 DANH MỤC BẢNG Trang Bảng Biểu NOX4 sau 12 Bảng Biểu NOX4 sau 24 12 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT BCĐN ROS TBDCNCN Bạch cầu đa nhân Gốc oxy hoạt hóa Tế bào dây chằng nha chu người THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG Thông tin chung: - Tên đề tài: Biểu gen NOX4 tế bào dây chằng nha chu người tác động hợp chất dung giải tế bào Porphyromonas gingivalis - Mã số: - Chủ nhiệm đề tài: Nguyễn Thu Thủy Điện thoại: 01208505265 Email: ngthuthuy20@yahoo.com - Đơn vị quản lý chuyên môn (Khoa, Tổ môn): Bộ môn Nha chu, Khoa Răng Hàm Mặt - Thời gian thực hiện: 01/07/2017 - 31/03/2018 Mục tiêu: - Mục tiêu chung: Đánh giá biểu gen NOX4 tế bào dây chằng nha chu người tác động hợp chất dung giải tế bào Porphyromonas gingivalis - Mục tiêu cụ thể: (1) Xác định biểu gen NOX4 tế bào dây chằng nha chu người tác động hợp chất dung giải tế bào Porphyromonas gingivalis sau (2) Xác định biểu gen NOX4 tế bào dây chằng nha chu người tác động hợp chất dung giải tế bào Porphyromonas gingivalis sau 24 (3) So sánh biểu gen NOX4 tế bào dây chằng nha chu người tác động hợp chất dung giải tế bào Porphyromonas gingivalis sau 24 Nội dung Bệnh nha chu ảnh hưởng đến 10-15% dân số giới lý hàng đầu gây Viêm nha chu bệnh viêm, bắt đầu màng sinh học nướu thay đổi phản ứng viêm/miễn dịch cá nhân bất thường Các bạch cầu đa nhân (BCĐN) tế bào viêm nguyên phát nướu mô nha chu Trong viêm nha chu, BCĐN tự nhiên có khả sản xuất loại oxy phản ứng (ROS) cho kích hoạt chức làm tăng sản xuất ROS Nhiều nghiên cứu gần bệnh nha chu mạn tính có liên quan với bạch cầu trung tính phóng thích với sản xuất ROS gia tăng để đáp ứng kích thích thụ thể Fc-gamma Porphyromonas gingivalis vi khuẩn thường xem tác nhân gây bệnh quan trọng viêm nha chu Nghiên cứu nhằm đánh giá biểu gen NOX4 liên quan đến sản xuất ROS tế bào dây chằng nha chu người tác động hợp chất dung giải tế bào Porphyromonas gingivalis nồng độ khác Kết đạt (khoa học, đào tạo, kinh tế-xã hội, ứng dụng, ):  Cơng bố tạp chí nước quốc tế (tên báo, tên tạp chí, năm xuất bản): Biểu gen NOX4 tế bào dây chằng nha chu người tác động hợp chất dung giải tế bào Porphyromonas gingivalis Y học Thành phố Hồ Chí Minh 2018 Hiệu kinh tế - xã hội đề tài mang lại:  Phạm vi địa ứng dụng kết nghiên cứu (tên đơn vị ứng dụng kết nghiên cứu/tên giảng trích dẫn kết NC sử dụng giảng dạy đại học sau đại học): kết nghiên cứu sử dụng giảm dạy bệnh sinh bệnh nha chu môn Nha chu, khoa Răng Hàm Mặt, Đại học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh MỞ ĐẦU Tổng quan Bệnh nha chu Bệnh nha chu ảnh hưởng đến 10-15% dân số giới lý hàng đầu gây răng(3) Viêm nha chu bệnh viêm, bắt đầu màng sinh học nướu thay đổi phản ứng viêm/miễn dịch cá nhân bất thường(2) Các bạch cầu đa nhân (BCĐN) tế bào viêm nguyên phát nướu mô nha chu (5) Porphyromonas gingivalis vi khuẩn thường xem tác nhân gây bệnh quan trọng viêm nha chu(5) Nhiều nghiên cứu gần bệnh nha chu mạn tính có liên quan với bạch cầu trung tính phóng thích với sản xuất ROS gia tăng để đáp ứng kích thích thụ thể Fc-gamma(6,8,9,10) Stress oxy hóa Stress oxy hóa xảy trạng thái xáo trộn gốc tự tạo khả hệ thống chống oxy hóa để chống lại tình trạng Các gốc tự phân loại loại ôxy phản ứng (ROS) loại nitơ phản ứng (RNS) hai có electron hóa trị khơng ghép Trong viêm nha chu, BCĐN tự nhiên có khả sản xuất gốc oxy tự (ROS) cho kích hoạt chức làm tăng sản xuất ROS (1,2,4,7) ROS phân loại thành gốc oxy trung tâm (các anion superoxide, gốc hydroxyl, gốc alkoxyl gốc peroxyl) oxy không trung hòa (hydrogen peroxide oxy đơn), RNS bao gồm nitric oxide, nitric dioxide peroxynitrite (6,7,8) ROS chất oxy hóa tự nhiên có liên quan đến nhiều kiện sinh hóa tế bào cần thiết cho sống đồng thời có khả gây stress oxy hóa có hại sản xuất mức Các gốc tự gây thiệt hại cho tất chất sinh học thiết yếu DNA, protein lipit màng, gây tế bào chết Những gốc tự chống lại hệ thống chống oxy hóa vốn có tồn hai nhóm chính: enzyme (glutathione peroxidase, myeloperoxidase, superoxide dismutase, catalase) không enzyme (khống chất, vitamin, polyphenol, thiol(6) Stress oxy hóa tạo thành sở ung thư, tiểu đường, viêm khớp dạng thấp, bệnh gan nhiễm mỡ không rượu, viêm mãn tính, đột quỵ, lão hóa nhiều bệnh thối hóa thần kinh Các nghiên cứu lâm sàng dịch tễ học khác cho thấy chứng vai trị quan trọng stress oxy hóa suy giảm hệ thống phịng thủ chống oxy hóa sinh bệnh học, neoangiogenesis, phổ biến bệnh ung thư địa phương xa, chẳng hạn ung thư buồng trứng tuyến tiền liệt Trong bệnh ung thư, stress oxy hóa gây tình trạng thiếu oxy, báo cáo để thúc đẩy thối hóa protein (MUC4) thơng qua autophagy, tăng cường sống cịn tế bào ung thư tuyến tụy Trong bệnh Parkinson, stress oxy hóa tổng hợp protein q trình gây bệnh quan trọng, kết hợp αsynuclein dẫn đến sản sinh gốc tự chết thần kinh Tương tự bệnh Alzheimer, amyloid-β chèn vào hệ thống màng để bắt đầu stress oxy hóa q trình tiến triển bệnh não Ngoài ra, tăng stress oxy hóa giảm mức độ superoxide dismutase quan sát thấy tế bào đơn nhân máu ngoại biên người thu từ bệnh nhân suy giảm nhận thức nhẹ(6) Stress oxy hóa liên quan đến bệnh miệng Các bệnh miệng viêm nha chu, sâu răng, ung thư khoang miệng, HIV / AIDS, bệnh liên quan đến tuyến niêm mạc tuyến nước bọt, đau orofacial, vết lõm, ảnh hưởng đến sức khỏe vệ sinh miệng Trong số tất bệnh miệng, bệnh nha chu (bao gồm viêm nướu viêm nha chu), chiếm 3,5 triệu năm bị khuyết tật, 54 tỷ đô la Mỹ / năm suất bị phần lớn chi phí 442 tỷ la Mỹ / năm cho bệnh miệng) Stress oxy hóa liên quan đến tiến triển viêm nha chu, bệnh viêm mãn tính mơ nha chu, gây xáo trộn việc điều hòa viêm chủ đáp ứng với nhiễm khuẩn Trong viêm nha chu mạn tính, có tổng lượng chất chống oxy hóa khả nước bọt thấp so sánh với cá thể đối chứng Các dấu ấn sinh học trình peroxid hóa lipid (một đường oxy hóa ứng suất trung gian) 8-isoprostane malondialdehyde (MDA) cao bệnh nhân bị viêm xoang mãn tính Ngồi ra, đánh giá máu mơ nướu bệnh nhân viêm nha chu mãn tính tiết lộ việc loại bỏ DNA ty lạp thể Phân tích máu vùng nướu bệnh nhân viêm nha chu đánh dấu mức độ cao 7-8-dihydro-8-ossiguanina (8-oxoG), sở pre-mutagen gây tổn thương DNA qua trung gian ROS Tương tự, nồng độ 8-isoprostan cao (một phương pháp thay để ước lượng lipid peroxidation) dịch tiết nướu phát bệnh nhân viêm nha chu mạn tính so với bệnh nhân viêm nướu khỏe mạnh Mức độ chuyển hóa oxy phản ứng huyết bệnh nhân viêm nha chu có tương quan dương với mức kháng thể vi khuẩn Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia, Eikenella corrodens Sau quy mô quy hoạch gốc sau sử dụng lycopene chống oxy hóa hệ thống, giảm stress oxy hóa cải thiện thơng số lâm sàng, trì đến tháng sau ngưng điều trị chống oxy hóa Sinh bệnh học bệnh viêm mãn tính planen planen miệng (OLP) không hiểu rõ Các nghiên cứu khác cho thấy stress oxy hóa có liên quan đến sinh bệnh học OLP Nồng độ ROS, lipid peroxidation, nitric oxide nitrit cao đáng kể tìm thấy bệnh nhân OLP so với đối chứng Tổng hoạt tính chống oxy hóa giảm đáng kể bệnh nhân OLP với mức độ tăng malondialdehyde nước bọt (MDA) so với nhóm chứng khỏe mạnh cho thấy vai trị chất oxy hóa để dàn trải bệnh thơng qua q trình trung gian peroxidation lipid Stress oxy hóa tương quan với ung thư miệng, tăng lipid peroxidation giảm chất chống oxy hóa báo cáo bệnh nhân bị giai đoạn II, III, ung thư miệng IV Ngoài phát này, tổn thương DNA qua trung gian nitric oxide báo cáo bệnh nhân bị bạch sản miệng Các mẫu biểu mô miệng lấy từ bệnh nhân ghi nhận mức độ cao 8-nitroguanine 8-oxoG(6,7,8) Stress oxy hóa làm trung gian tổn thương tế bào Các tác động có hại ROS trường hợp stress oxy hóa thơng qua q trình oxy hóa lipid thay đổi protein khơng thể đảo ngược dẫn đến trình apoptosis tế bào chết tế bào lập trình Nhiều đường làm trung gian tổn hại tế bào oxy hóa chúng bao gồm đường dẫn caspase, lộ trình PERK / NRF2, đường NADPH oxidase đường kinase protein JNK / mitogen kích hoạt (MAP)(6) Con đường làm trung gian tổn thương tế bào oxy hóa Đường dẫn Caspase Caspases gia đình enzyme protease cysteine thực tế bào chết viêm Trong q trình apoptosis, caspases kích hoạt để đảm bảo chết tế bào lập trình xảy với thiệt hại cho mơ lân cận để đảm bảo suy thoái thành phần tế bào cách kiểm soát tốt Chức năng, caspases phân loại thành hai nhóm apoptosis: Initiator caspases caspase-8 -9, kích hoạt caspases hạ lưu gọi execer Chúng bao gồm caspase-3, -6 -7 chịu trách nhiệm phân hủy protein tế bào Trong viêm nha chu mãn tính, nồng độ caspase-3 tăng lên đáng kể dịch khớp huyết thanh, tương quan đáng kể với độ sâu thăm dò, số nướu mức độ gắn kết lâm sàng, qua cho thấy trình apoptosis đóng vai trị quan trọng việc phá hủy mô nha chu viêm nha chu mãn tính(6) Có hai đường dẫn apoptotic liên quan đến caspase liên quan đến tổn thương oxy hóa (1) đường trung gian ty thể (2) đường trung gian thụ thể tử vong Trong tế bào, caspases tồn zymogens (pro-caspases) kích hoạt có kích thích thích hợp xúc phạm stress oxy hóa Trong q trình kích hoạt, caspases trải qua trình phân giải protein phân giải thành dimerize Trong đường apoptotic qua trung gian ty thể, hydrogen peroxide (H2O2) giải phóng cytochrome C liên kết với yếu tố kích hoạt protease apoptotic (Apaf-1) để bắt đầu kích hoạt caspase-9 Sự biến đổi oxy hóa qua trung gian ROS caspase-9 dư lượng C403 thúc đẩy tương tác caspase-9 với Apaf-1 qua liên kết disulfide dẫn đến hình thành apoptosome dẫn đến hoạt hóa caspase-9 Người thi hành, caspase-3 cho điểm hội tụ hai đường phụ thuộc ty thể độc lập trình apoptosis stress oxy hóa Kích hoạt H2O2 caspase-3 dẫn đến kích hoạt PKC delta điều góp phần vào phân tích DNA hạt nhân tử vong tế bào chết(6,7,8) Trong trình apoptotic qua trung gian thụ thể tử vong, caspase-8 kênh apoptosis sau stress oxy hóa Các thụ thể tử vong (cịn gọi thụ thể miền chết) thúc đẩy phân cắt pro-caspase-8 với kích thích thích hợp Sau đó, caspase-8 kích hoạt caspases thi hành hạ lưu tách protein pro-apoptotic gọi Bid, kích hoạt translocates thành ty thể gây phát hành cytochrome C, phân mảnh DNA apoptosis Thật thú vị, nhiều nghiên cứu báo cáo nhiễu xuyên âm caspase-8 caspase-9 Sử dụng tế bào hội chứng tuyến tụy, nghiên cứu cho thấy Một nghiên cứu tương tự báo cáo tham gia protein lysosome cathedpsin D E (aspartyl protease từ lysosome) kích hoạt caspase-8 (6,7,8) Con đường NADPH oxidase (NOX4) NADPH oxidases (NOX) enzyme biết xúc tác chuyển electron từ NADPH đến oxy phân tử, để tạo ROS microcode đáp ứng miễn dịch (DeLeo Quinn, 1996) Họ protein NOX bao gồm NOX1, -2, -3 -4 Đồng phân NOX4 biểu khắp nơi thể, bao gồm tim, tế bào thần kinh, thận, gan tế bào nội mô NOX4 chủ yếu tạo H2O2 ty thể, nơi thường địa hố Nghiên cứu gần nhấn mạnh tác động học NOX4 stress oxy hóa Khơng giống đồng phân khác NOX, NOX4 không yêu cầu tiểu đơn vị điều chỉnh tế bào cytosolic để kích hoạt Thay vào đó, enzyme điều chỉnh yếu tố phiên mã bao gồm E2F, phức hợp AP-1 / Smad3, protein kinase võng mạc (bằng cách điều chỉnh hoạt động E2F), G- protein thụ thể kinase 2, thông qua điều tiết biểu sinh thông qua tăng liên kết histone H4K16 Tăng cường biểu NOX4 / hoạt động nội địa hóa ty thể tích cực tương quan với sản xuất ROS ty thể ROS tăng ty thể dẫn đến tổn thương DNA ti thể, q trình oxy hóa protein ti thể cuối chết tế bào chết ROS dư thừa có khả xâm nhập vào tế bào chất kích hoạt nhiều protein pro-apoptotic caspase-9 ROS dư thừa gây thay đổi tiền viêm biểu gen thông qua hoạt hóa hạt nhân-kappa-β Mức tăng NOX4 đáng kể quan sát sau kích thích viêm thiếu oxy tế bào dây chằng nha chu, kèm với điều chỉnh tăng nồng độ ROS catalase kích thích dẫn đến giảm mức độ catalase cho thấy sụp đổ chế chống oxy hóa ủng hộ stress oxy hóa đáp ứng viêm quan sát thấy viêm nha chu (6,7,8) Nghiên cứu nhằm đánh giá biểu gen NOX4 liên quan đến sản xuất ROS tế bào dây chằng nha chu người tác động hợp chất dung giải tế bào Porphyromonas gingivalis nồng độ khác 2 Mục tiêu - Mục tiêu chung: Đánh giá biểu gen NOX4 tế bào dây chằng nha chu người tác động hợp chất dung giải tế bào Porphyromonas gingivalis - Mục tiêu cụ thể: (1) Xác định biểu gen NOX4 tế bào dây chằng nha chu người tác động hợp chất dung giải tế bào Porphyromonas gingivalis sau (2) Xác định biểu gen NOX4 tế bào dây chằng nha chu người tác động hợp chất dung giải tế bào Porphyromonas gingivalis sau 24 (3) So sánh biểu gen NOX4 tế bào dây chằng nha chu người tác động hợp chất dung giải tế bào Porphyromonas gingivalis sau 24 3 Đối tượng phương pháp nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu Tế bào dây chằng nha chu người (TBDCNCN) Đơn vị cung cấp tế bào nuôi cấy Hoa Kỳ (American Type Culture Collection, ATCC), nuôi môi trường Dulbecco biến đổi (Dulbecco’s Modified Eagle Medum, DMEM) chứa 90% DMEM, 10% huyết phơi thai bị (Fetal Bovine Sreum, FBS), 1% kháng sinh Phương pháp nghiên cứu Nuôi cấy tế bào TBDCNCN Đơn vị cung cấp tế bào nuôi cấy Hoa Kỳ (American Type Culture Collection, ATCC), nuôi môi trường Dulbecco biến đổi (Dulbecco’s Modified Eagle Medum, DMEM) chứa 90% DMEM, 10% huyết phôi thai bò (Fetal Bovine Sreum, FBS), 1% kháng sinh Cấy chuyển mật độ tế bào dày đặc, tế bào kết dính với Chuẩn bị TBDCNCN gieo vào bảng mẫu siêu nhỏ 96 giếng với mật độ 3x10 tế bào/giếng Các bảng mẫu sau ủ ấm máy ủ CO2 (37o C, 5% CO2, độ ẩm 100%) 24 để đạt 80% mức bão hồ, sau đổi mơi trường ni cấy sang DMEM khơng có huyết chứa nồng độ hợp chất dung giải tế bào Porphyromonas gingivalis 20 μM 50 μM H2O2 50 µM dùng làm nhóm chứng dương môi trường nuôi cấy không huyết dùng làm nhóm chứng âm Thu lại dung dịch tế bào sau 24 để thực thí nghiệm Tách chiết RNA tổng hợp cDNA RNA tổng số tách chiết Trizol (Invitrogen, Hoa Kỳ) Bộ tách chiết RNA (PureLink RNA Mini Kit, Invitrogen, Hoa Kỳ), với loại bỏ DNA DNaseI (On-column PureLink DNase, Invitrogen, Hoa Kỳ) Các mẫu RNA kiểm tra nồng độ máy đo quang phổ (Biotek, Hoa Kỳ) trước μg RNA tổng dùng để tổng hợp cDNA Bộ tổng hợp cDNA (Invitrogen, Hoa Kỳ) Quy trình thao tác thực theo hướng dẫn nhà sản xuất Real-time PCR định lượng ph n tích kết Tổng thể tích m i phản ứng Real-time PCR định lượng 22 μl, bao gồm SYBR Green PCR Master Mix (Thermo Scientific, Hoa Kỳ), khuôn cDNA cặp primer thiết kế đặc hiệu cho NOX4 Các phản ứng (lặp lại mẫu cho m i thiết kế thí nghiệm) thực máy Realplex Eppendorf (Đức) Chu trình chạy phản ứng bao gồm phút 50 C, 15 phút 95 C 40 chu kỳ 90 C (15 giây) 60 C (1 phút) Để kiểm tra số sản phẩm khuếch đại m i phản ứng, phân tích đường cong nóng chảy DNA (dissociation melting curves) thực cách giữ nhiệt độ 95 C 15 giây trước gia tăng nhiệt từ 60 C lên 95 C Số lượng cDNA cụ thể chuẩn hóa với gen housekeeping 18S biểu cDNA tính biểu tương đối kiểm soát tương ứng Biểu NOX4 chuẩn hóa theo biểu gen β-actin Xử lý thống kê Số liệu nhập phân tích phần mềm SPSS 20.0 Mức ý ngh a thống kê p 0,05 phân tích thống kê test one-way ANOVA post-hoc test KẾT QUẢ Bảng Biểu NOX4 sau Dung dịch Tỉ lệ NOX4/ β-actin P 20 μM P gingivalis 0,15 ± 0,09 p0,052 50 μM P gingivalis 2,11 ± 0,98 p