Mục tiêu bài viết nhằm trình bày về nghiên cứu tác động của chiết xuất từ hạt nhân trên khả năng sống, di chuyển và tăng trưởng của tế bào dây chằng nha chu bằng các kĩ thuật cơ bản. Mời các bạn cùng tham khảo bài viết.
Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 19 * Phụ Số * 2015 Nghiên cứu Y học TÁC ĐỘNG CỦA CHIẾT XUẤT TỪ HẠT NHÃN TRÊN KHẢ NĂNG SỐNG, DI CHUYỂN VÀ TĂNG TRƯỞNG CỦA TẾ BÀO DÂY CHẰNG NHA CHU Nguyễn Thu Thuỷ*, Aree Wanasuntronwong**, Rudee Surarit** TÓM TẮT Mở đầu: Các loại thuốc cổ truyền có nguồn gốc từ cỏ trở thành hướng quan trọng điều trị bệnh vùng miệng bao gồm viêm nướu viêm nha chu Chiết xuất từ hạt nhãn (CXHN) nghiên cứu khả ứng dụng điều trị nhiều bệnh lí, nhiên chưa có lĩnh vực Mục tiêu: Nghiên cứu tác động CXHN khả sống, di chuyển tăng trưởng tế bào dây chằng nha chu (TBDCNC) kĩ thuật Đối tượng - Phương pháp nghiên cứu: Thử nghiệm MTT dùng để đánh giá khả sống tăng trưởng TBDCNC nuôi cấy; khả di chuyển đánh giá chương trình Image Pro Plus Program đếm tế bào vùng đánh dấu Kết quả: Nồng độ ức chế 50% (IC50) CXHN TBDCNC 1,47 mg/ml sau 24 0,15 mg/ml sau 48 CXHN nồng độ mg/ml ức chế di chuyển tế bào tác động giảm liều lượng giảm Cả hai nơng độ ức chế tăng trưởng TBDCNC Kết luận: CXHN ảnh hưởng khả sống, di chuyển tăng trưởng TBDCNC, tác động giảm nồng độ giảm Với khả kháng viêm, chất tiềm điều trị bệnh nha chu, nhiên cần nghiên cứu khác với nồng độ khác để đến kết luận Từ khoá: chiết xuất từ hạt nhãn, tế bào dây chằng nha chu, khả sống, di chuyển, tăng trưởng ABSTRACT EFFECTS OF LONGAN SEED EXTRACT ON SURVIVAL, MIGRATION AND PROLIFERATION OF PERIODONTAL LIGAMENT CELLS Nguyen Thu Thuy, Aree Wanasuntronwong, Rudee Surarit * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 19 - Supplement of No - 2015: - Background: Traditional herbal medicine has become an important orientation in treatment of oral diseases including gingivitis and periodontitis The Longan seed extract (LSE) has been studied for their potential application in numerous diseases, but not yet in this field Objectives: The aim of this study was to investigate the effects of LSE on the viability, the migration and the proliferation of periodontal ligament cells (PDLCs) by using basic techniques Materials and methods: The MTT assay was used to assess the cytotoxicity and the proliferation of PDLCs in culture; the cell migration was estimated by using Image Pro Plus Program and by counting the number of cells in the migration area Results: The IC50 of LSE on PDLCs was approximately 1.47 mg/ml after 24 hours and 0.15 mg/ml after 48 hours of incubation The LSE at mg/ml inhibited the migration of PDLCs but the effect was reduced with lower dose The LSE both at mg/ml and 0.05 mg/ml seemed to be inhibitive on the proliferation of PDLCs Conclusion: The LSE has effect on the survival, migration and proliferation of PDLCs In considering its * Bộ môn Nha chu, Khoa Răng Hàm Mặt- Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh ** Bộ mơn Sinh học miệng, Khoa Nha, Đại học Mahidol, Thái Lan Tác giả liên lạc: ThS Nguyễn Thu Thuỷ ĐT: 01208505265 Email: ngthuthuy20@yahoo.com Chuyên Đề Răng Hàm Mặt Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 19 * Phụ Số * 2015 anti-inflammatory effect and paying attention to the concentration in use, other studies are in need to explore the application potential of this extract in treatment of periodontal diseases based on inexpensive natural products Key words: Longan seed extract, periodontal ligament cells, survival, migration, proliferation kháng sinh Cấy chuyển mật độ tế bào dày ĐẶT VẤN ĐỀ đặc, tế bào kết dính với Tại Việt Nam, nghiên cứu cho thấy tình Chuẩn bị dung dịch CXHN trạng vệ sinh miệng nhóm tuổi 35 – 44 CXHN Phòng thí nghiệm Đại học với nhiều vơi răng, mảng bám; hầu hết Chulalongkorn, Thái Lan cung cấp, sau đối tượng có vị trí có bám dính ≥ pha lỗng với Dimethyl sulfoxide (DMSO) để tạo mm Ở Thái Lan, tỉ lệ viêm nha chu nhẹ, trung (10) thành dung djch CXHN với nồng độ khác bình nặng 30,5, 53,6 15,9 Ở hai nước, loại thuốc cổ truyền có nguồn gốc từ cỏ trở thành hướng nỗ lực quốc gia nhằm tăng cường sức khoẻ cộng đồng vùng nơng thơn, bao gồm sức khoẻ miệng nói chung mơ nha chu nói riêng(12,9) Chiết xuất từ hạt nhãn (CXHN) chứa polysaccharides có tác động kháng oxy hoá in vitro phụ thuộc vào nồng độ(3) Liều khẩn cấp liều lập lại CXHN dùng theo đường uống kết luận không gây độc, từ sử dụng an tồn kiểm sốt nghiên cứu độc tính dài hạn và/hoặc thử nghiệm lâm sàng(13) CXHN nghiên cứu khả chống ung thư(5,6), kháng nấm(7), chống mệt mỏi(15), chưa tìm hiểu khả ứng dụng điều trị bệnh vùng miệng Mặt khác, tác động CXHN in vitro tế bào nuôi cấy, đặc biệt tế bào dây chằng nha chu (TBDCNC), chưa đánh giá đầy đủ Do đó, mục tiêu nghiên cứu nhằm tìm hiểu tác động CXHN khả sống, di chuyển tăng trưởng TBDCNC thử nghiệm ĐỐI TƯỢNG–PHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU Nuôi cấy tế bào TBDCNC Đơn vị cung cấp tế bào nuôi cấy Hoa Kỳ (American Type Culture Collection, ATCC), nuôi môi trường Dulbecco biến đổi (Dulbecco’s Modified Eagle Medum, DMEM) chứa 90% DMEM, 10% huyết phơi thai bò (Fetal Bovine Sreum, FBS), 1% Tác động CXHN khả sống TBDCNC TBDCNC gieo vào bảng mẫu siêu nhỏ (microtiter plates, 96 well plates) với mật độ 20.000 tế bào/well Đếm tế bào buồng đếm hematocytometer (Improve Neubauer®) Các bảng mẫu sau ủ ấm máy ủ CO2 (37o C, 5% CO2, độ ẩm 100%) 24 để đạt mức bão hoà Dung dịch CXHN với nồng độ mg/ml, mg/ml, 0,1 mg/ml 0,01 mg/ml cho vào well (4 well cho nồng độ) Dung dịch đệm phosphate saline (Phosphate buffer saline, PBS) đặt vào well trắng Chlorhexidine 0,12% dùng làm chứng dương môi trường nuôi dưỡng dùng để làm chứng âm Tiếp tục đặt bảng mẫu vào tủ ủ 24 48 Khả sống tế bào xác định thử nghiệm MTT Đọc kết với quang phổ kế bước sóng 540 nm Lập lại thử nghiệm lần với kết khơng khác biệt có ý nghĩa thống kê Kết chấp nhận hệ số biến thiên 15% Tác động CXHN khả di chuyển TBDCNC TBDCNC cấy vào bảng mẫu 24 well (24 well plates) với mật độ 50.000 tế bào/well, ủ tủ ủ CO2 48 để đạt mức bão hồ Sau đó, dùng đầu pipette 1000 μl vạch đường ngang qua trung tâm đáy well Kiểm tra kính hiển vi cho thấy khơng tế bào vùng vạch Thêm 500 μl dung dịch CXHN với nồng độ mg/ml 0,05 Chuyên Đề Răng Hàm Mặt Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 19 * Phụ Số * 2015 mg/ml vào well (4 well cho nồng độ) Theo dõi di chuyển tế bào sau 3, 24 Sau 24 giờ, rửa tế bào với PBS 1X, cố định với methanol phút, rửa lại lần trước nhuộm với xanh toludine (toludine blue 0,25%) Chụp hình kính hiển vi Đo vùng tế bào di chuyển với chương trình Image Pro Plus Program, sau đếm tế bào vùng xác định đường vạch đầu pipette Tác động CXHN tăng trưởng TBDCNC Cấy TBDCNC vào bảng mẫu 96 well với mật độ 2.000 tế bào/well Sau ủ 24 giờ, cho dung dịch CXHN nồng độ mg/ml 0,05 mg/ml vào well (4 well cho nồng độ) Chlorhexidine 0,12% dược dùng làm chứng âm yếu tố tăng trưởng cho nguyên bào sợi người (human fibroblast growth factor, hFGF basic/FGF2) 0,2 μg/ml dùng làm chứng dương Ủ bảng mẫu tủ ủ thực thử nghiệm MTT sau 1, 3, 6, ngày Đọc kết với quang phổ kế Nghiên cứu Y học với bước sóng 540 nm Lập lại thử nghiệm lần với kết không khác biệt có ý nghĩa thống kê Kết chấp nhận hệ số biến thiên 15% Phân tích số liệu Xác địnhh kiểu phân phối số liệu test Kolmogorov Smirnov Sử dụng test one-way ANOVA test one-way Kruskal-Wallis chương trình SigmaStat version 3.5 để phân tích thống kê Giá trị p ≤ 0,05 xem có ý nghĩa thống kê KẾT QUẢ Tác động CXHN khả sống TBDCNC Nồng độ ức chế 50% (Inhibitory concentration 50%, IC50) nồng độ mẫu ức chế sống 50% số lượng tế bào điều kiện xác định IC50 dung dịch CXHN sau 24 48 1,47 mg/ml 0,15 mg/ml Tác động CXHN khả di chuyển TBDCNC Bảng Diện tích vùng di chuyển TBDCNC sau 24 ủ với dung dịch Dung dịch Nồng độ (mg/ml) Dung dịch dinh dưỡng (DMEM + 10% FBS + 1% kháng sinh) (Chứng âm) hFGF basic/FGF2 (Chứng dương) CXHN Diện tích vùng di chuyển Trung bình sai số chuẩn (mm ) P 0,25 0,05 0,0002 1,00 0,05 0,31 0,03 0,06 0,01 0,19 0,03 * p