biểu hiện của gen arid1a liên quan đến sự tiên lượng trong lâm sàng của unbtk ở trẻ em vn

BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT (TOÀN VĂN) ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG BIỂU HIỆN CỦA GEN ARID1A LIÊN QUAN ĐẾN SỰ TIÊN LƯỢNG TRONG LÂM SÀNG CỦA UNBTK Ở TRẺ EM VN Mã số: Chủ nhiệm đề tài: TS BÙI CHÍ BẢO Tp Hồ Chí Minh, 11/2017 BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT (TĨM TẮT) ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG BIỂU HIỆN CỦA GEN ARID1A LIÊN QUAN ĐẾN SỰ TIÊN LƯỢNG TRONG LÂM SÀNG CỦA UNBTK Ở TRẺ EM VN Mã số: Chủ nhiệm đề tài (ký, họ tên) Tp Hồ Chí Minh, 11/2017 DANH SÁCH NHỮNG THÀNH VIÊN THAM GIA NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI VÀ ĐƠN VỊ PHỐI HỢP CHÍNH Danh sách thành viên tham gia nghiên cứu: STT Họ tên Bùi Chí Bảo Lê Thị Kim Hịa Chuyên ngành Cơ quan công tác Đại Học Y Dược TPHCM Đại học Khoa học tự nhiên TP.HCM Vũ Diễm My Đại Học Y Dược TPHCM Bùi Thị Thanh Huyền Bệnh viện Nhi Đồng II Đơn vị phối hợp chính: -Nơi thực đề tài: Đại Học Y Dược TPHCM -Nơi cung cấp bệnh phẩm: Bệnh viện Nhi Đồng II MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG BIỂU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC HÌNH DANH MỤC BẢNG THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU A MỞ ĐẦU TỔNG QUAN ĐỀ TÀI ĐỐI TƯƠNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 B KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 24 KẾT LUẬN: 33 TÀI LIỆU THAM KHẢO: 34 DANH MỤC BẢNG BIỂU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ALK Anaplastic Lymphoma Receptor Tyrosine Kinase ARID1A/B AT-rich interactive domain 1A and B B2M Beta 2-microglobulin BAF BRG1-associated factor BARD1 BRCA-1 associated RING domain-1 CDKN1A Cyclin Dependent Kinase Inhibitor 1A COG Children’s oncology Group COSMIC the Catalogue Of Somatic Mutations In Cancer CT Computerized Axial Tomography DAB 3, -diaminobenzidine DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium DNA Deoxyribonucleic acid E2F4 E2F Transcription Factor FDA Food and Drug Administration FFPF Formalin-fixed, paraffin-embedded GD-2 Disialoganglioside GM-CSF Granulocyte-macrophage colony-stimulation factor GWAS Genome-wide association studies H&E Hematoxylin and eosin HMMD Hóa mơ miễn dịch HRP Horseradish peroxidase HVA Homovanillic acid IDRF Image-defined risk factors INPC International Neuroblastoma Pathology Classification INRG International Neuroblastoma Risk Group INRGSS INRG staging system INSS International Neuroblastoma Staging System LMO1 LIM-domain only LOH Loss of Heterozygosity MIBG Radioiodine-labeled metaiodobenzylguanidine MLH1 MutL Homolog MRI Magnetic Resonance Imaging mRNA Messenger Ribonucleic acid MYCN V-Myc Avian Myelocytomatosis Viral Oncogene Neuroblastoma Derived Homolog NBPF23 Neuroblastoma breakpoint, family 23 NF1 Neurofibromin NST Nhiễm sắc thể OD Optical density PBAF Polybromo BRG1-associated factor PET Positron Emission Tomography PHOX2B Paired-like homeobox 2B RNA Ribonucleic acid RT-PCR Reverse Transcription – Polymerase Chain Reaction SEER Surveillance, Epidemiology, and End Report SMAD3 SMAD Family Member SNP Single Nucleotide Polymorphism SWI/SNF Sucrose non-fermenting/mating-type switching tRNA Transfer RNA U NBTK U nguyên bào thần kinh VMA Vanillylmandelic acid DANH MỤC HÌNH Hình 1: Đột biến gen ARID1A nhiều loại ung thư khác nhau, có U NBTK (Neuroblastoma) [29] 14 Hình 2: Hình ảnh điện di RNA tổng số mẫu U NBTK M: thang kích thước (kb), mẫu đại diện NB30, NB40, NB55 thể tính nguyên vẹn kích thước RNA tổng số sau tách chiết 26 Hình 3: Biểu đồ Waterfall thể biểu mRNA gen ARID1A mức độ phiên mã 27 Hình 4: Mối tương quan biểu mRNA gen ARID1A yếu tố lâm sàng, phân tử 29 Hình 5: So sánh sống sót hai nhóm bệnh nhân U NBTK biểu mRNA gen ARID1A cao thấp 31 DANH MỤC BẢNG Bảng 1: Phân loại giai đoạn U NBTK theo hệ thông INSS điều chỉnh (Brodeur, 1993) Bảng 2: Giai đoạn U NBTK theo hệ thống INRGSS Bảng 3: Lược đồ phân loại nhóm nguy U NBTK trước điều trị theo hệ thống INRGSS 10 Bảng 4: Thành phần phản ứng tổng hợp Cdna 21 Bảng 5: Thành phần phản ứng tổng hợp cDNA 21 Bảng 6: Chương trình nhiệt tổng hợp cDNA 22 Bảng 7: Thành phần phản ứng real-time RT-PCR 22 Bảng 8: Đặc điểm lâm sàng bệnh nhân U NBTK nghiên cứu (n = 54) 25 Bảng 9: Đánh giá mối tương quan biểu gen ARID1A với đặc điểm lâm sàng yếu tố phân tử 30 THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU A MỞ ĐẦU TỔNG QUAN ĐỀ TÀI U nguyên bào thần kinh (U NBTK) khối u rắn nằm hộp sọ ung thư phổ biến trẻ em Đây u ác tính hệ thần kinh giao cảm có nguồn gốc từ tế bào mào thần kinh thời kỳ phôi thai [1, 2] Khối u khởi phát mô hệ thần kinh giao cảm, điển hình vùng tủy thượng thận hạch cạnh cột sống, biểu tổn thương lớn vùng bụng (60%), sau ngực (15%), xương chậu (5%) chuỗi hạch giao cảm cổ tử cung (5%) [3] Tuổi tác,giai đoạn đặc điểm sinh học có vai trị quan trọng tiên lượng bệnh sử dụng để phân nhóm nguy điều trị bệnh Trẻ em mắc U NBTK thường điều trị đa mô thức, kết hợp phẫu thuật, hóa xạ trị bệnh nhân nguy cao hỗ trợ điều trị chuyên sâu cấy ghép tế bào gốc Tuy nhiên, tỷ lệ sống sót bệnh nhân nguy cao 50% điều trị liều cao U NBTK dạng u đặc ác tính phổ biến trẻ em với khoảng 90% trường hợp chuẩn đoán trước tuổi [4] Bệnh chiếm 20% loại ung thư phát thời kỳ mang thai, khoảng 8-10% trường hợp ung thư trẻ em nguyên nhân gây tử vong cho 15% ung thư trẻ em [2, 5] Bệnh xảy tuổi niên người lớn, khoảng 10% trường hợp chuẩn đoán sau 10 tuổi tỷ lệ mắc phải bệnh nhân độ tuổi 30-39 tuổi khoảng 0,2 trường hợp triệu người năm [6] Tỷ lệ mắc phải trẻ em nam cao so với nữ trẻ em da trắng cao đáng kể so với chủng tộc khác [7] Trên giới, U NBTK chiếm khoảng 7,8% ung thư trẻ em Mỹ có khoảng 650 trường hợp mắc năm Theo SEER (Surveillance, Epidemiology, and End Report), tỷ lệ mắc phải xấp xỉ 9,5 trường hợp triệu trẻ em Các khảo sát U NBTK thực nước công nghiệp khác Tỷ lệ mắc U NBTK cao nước có thu nhập cao châu Âu, Bắc Mỹ thấp nước có thu nhập thấp Châu Phi, Châu Á Mỹ Latin Các nước Đông Á Nam Á Ấn Độ Trung Quốc có tỷ lệ mắc U NBTK thấp so với Nhật Bản [8] Hầu hết bệnh nhân U NBTK giai đoạn di thời điểm chẩn đốn nên có tiên lượng xấu tỷ lệ tử vong cao Ở Việt Nam, hàng năm có khoảng 60 trường hợp chẩn đoán mắc U NBTK bệnh viện Nhi Trung Ương [9] Theo ghi nhận bệnh viện Nhi Đồng từ năm 2005 đến 2010, U NBTK thường phát trễ khoảng 93% trường hợp giai đoạn thời điểm chẩn đoán tỷ lệ sống sót sau năm nhỏ 10% [10] Khoảng 70-80% bệnh nhân U NBTK phát giai đoạn di căn, thường di đến quan hạch bạch huyết, gan, xương, tủy xương da Não phổi hai quan gặp khối u di nhiều bệnh nhân nguy cao chữa trị tái phát thường phát có di vị trí Các biểu triệu chứng lâm sàng có liên quan đến vị trí khối u nguyên phát tiến triển bệnh Đối với U NBTK vùng bụng (30%), bệnh nhân có triệu chứng căng bụng, sưng, đau chí tắc nghẽn đường ruột Trong trường hợp khối u chèn ép mạch máu thận, bệnh nhân thường tăng huyết áp Bệnh di có triệu chứng liên quan đến vị trí khác đau cục bộ, bị đau, sưng bầm quanh hốc mắt khối u di đến xương quanh mắt mô mềm Nhiều bệnh nhân bỏ ăn, giảm cân, suy nhược, đau xương tiêu chảy mạn tính Các khối u xuất phát từ các hạch giao cảm cạnh cột sống tăng trưởng qua lỗ xương sống vào ống tủy làm chèn ép dây thần kinh cột sống, gây triệu chứng liên quan đến thần kinh yếu ớt, khập khiễng, tê liệt bàng quang ruột chức Khi khối u di đến cổ, chúng gây hội chứng Horner (sa mí mắt, co đồng tử, lõm mắt) Trẻ sơ sinh mắc U NBTK thuộc giai đoạn 4S (theo INSS) thường có bụng sưng lên khối u di đến gan; cục bướu nhỏ xuất da da đổi màu Ngược lại, bệnh nhân mắc U NBTK giai đoạn khu trú thường khơng có biểu triệu chứng Khoảng 90% trường hợp U NBTK, tế bào khối u sản xuất kích thích tố catecholamine cao, cụ thể homovanillic acid (HVA) vanillylmandelic acid (VMA) nước tiểu Tỷ lệ HVA:VMA cao khối u khơng biệt hóa, tiên lượng xấu; ngược lại hàm lượng VMA cao khối u biệt hóa tiến triển [11, 12] Tùy thuộc vào vị trí khối u yếu tố khác, bác sĩ sử dụng phương pháp xét nghiệm khác để chẩn đoán U NBTK Thơng thường, xét nghiệm chẩn đốn hình ảnh chụp X-Quang, chụp cắt lớp vi tính (CT – Computerized Axial Tomography), chụp cắt lớp xạ positron (PET-Positron Emission Tomography) chụp cộng hưởng từ (MRI – magnetic Resonance Imaging) thường sử dụng để xác định ví trí khối u, vùng di Ngồi cịn sử dụng chất hóa học có gắn phóng xạ metaiodobenzylguanidine (MIBG – Bảng 6: Chương trình nhiệt tổng hợp cDNA Nhiệt độ Thời gian 30oC 10 phút 50oC 30 phút 70oC 15 phút Sau chạy xong phản ứng phiên mã ngược, cDNA bảo quản -20oC Real-time RT PCR cDNA sau tổng hợp sử dụng để thực phản ứng Real-time PCR sử dụng SYBR® Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus) Kit chạy phản ứng máy MasterCycler® RealPlex (Eppendorf, Đức) Mồi dùng để khuếch đại trình tự gen ARID1A bảng 3-1 Beta 2-microglobulin (B2M ) sử dụng làm đối chứng nội Mẫu đối chứng dương cDNA từ mô hạch đốt sống lưng (human dorsal root ganglion) người bình thường (Clontech, Mỹ) Phản ứng thực với thành phần sau: Bảng 7: Thành phần phản ứng real-time RT-PCR Thành phần SYBRPremix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus) (2X) Thể tích 10 µl Mồi xuôi (5µM) 0.8 µl Mồi ngược (5µM) 0.8 µl cDNA (50ng) µl Nước cất vô trùng 6.4 µl Tổng 20 µl Khuếch đại trình tự gen theo chương trình ln nhiệt: biến tính phút 95oC, sau chạy 40 chu kỳ với biến tính giây 95oC bắt cặp/kéo dài vòng 30 giây 58oC Sau lần chạy xác định độ đặc hiệu mồi phản ứng phân tích nhiệt độ tách mạch Định lượng biểu mRNA Có hai phương pháp định lượng khác Real-time RT-PCR: định lượng tuyệt đối định lượng tương đối Định lượng tuyệt đối xác định số lượng phiên mã mục tiêu đưa vào mối tương quan tín hiệu huỳnh quang với đường chuẩn Trong đó, định lượng tương đối đo lường thay đổi tương đối mức độ biểu mRNA hay thể mối quan hệ tăng giảm số lượng mẫu thử nghiệm so với mẫu đối chứng Định lượng tương đối không cần định lượng gen mục tiêu mà cịn cần có mặt gen “giữ nhà” (housekeeping gene), tức gene biểu ổn định hầu hết tế bào, giai đoạn phát triển, không bị ảnh hưởng việc xử lý thí nghiệm nhằm loại trừ thay đổi khác lượng RNA đưa vào hiệu phiên mã ngược Trong số trường hợp, không cần thiết phải xác định số lượng tuyệt đối, cần báo cáo thay đổi tương đối biểu gen đủ Trong nghiên cứu này, sử dụng phương pháp định lượng tương đối để đánh giá biểu gen ARID1A U NBTK Để so sánh biểu mRNA gen ARID1A so với mẫu đối chứng, sử dụng cơng thức tính tốn biểu gen đơn chuẩn hóa Livak: Mức độ thay đổi biểu gen = 2-∆∆Ct ∆∆𝐶𝑡 = (𝐶𝑡𝐴𝑅𝐼𝐷1𝐴 − 𝐶𝑡𝐵2𝑀 )𝑚ẫ𝑢 𝑈𝑁𝐵𝑇𝐾 − (𝐶𝑡𝐴𝑅𝐼𝐷1𝐴 − 𝐶𝑡𝐵2𝑀 )𝑚ẫ𝑢 𝑐ℎứ𝑛𝑔 Trong đó, Ct chu kỳ ngưỡng B KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN KẾT QUẢ: Đặc điểm lâm sàng mẫu U NBTK Trong nghiên cứu này, tiến hành thu thập khối u sinh thiết từ bệnh nhi U NBTK bệnh viện Nhi Đồng thời gian 27 tháng, từ 05/2014 đến 08/20116 Kết thu 54 mẫu khối u từ 54 bệnh nhân U NBTK khác có ghi nhận đặc điểm lâm sàng sau: giới tính, độ tuổi, giai đoạn bệnh khuếch đại gen MYCN (Bảng 8) Nhóm bệnh nhân U NBTK khảo sát bao gồm 34/54 (62,96%) nam 20/54 (37,04%) nữ Tỷ lệ mắc bệnh giới tính nam cao gần gấp lần so với nữ Độ tuổi trung bình thời điểm chẩn đoán bệnh nhân tham gia nhiên cứu 39,26 tháng, bệnh nhi lớn tuổi 168 tháng nhỏ tuổi tháng Trong 54 trường hợp U NBTK, có 15 trẻ 10 tháng, chiếm 27,78% 39 trẻ 18 tháng, chiếm 72,22% Bệnh nhân U NBTK bệnh viện Nhi Đồng bác sỹ lâm sàng chia giai đoạn theo hệ thống phân loại INSS (Bảng 1-1) bao gồm giai đoạn 1, 2, 3, 4S Trong quần thể bệnh nhân khảo sát, có 45/54 (83,33%) bệnh nhân xác định giai đoạn, 9/54 (16,64%) bênh nhân lại chưa xác định giai đoạn Chúng chia giai đoạn thành hai nhóm nhóm giai đoạn 1, 4s chiếm 22,22% (12/54), nhóm giai đoạn chiếm 61,11% (33/54) Bên cạnh đó, khuếch đại gen MYCN đánh giá tất mẫu U NBTK Trung tâm Y Sinh Học Phân Tử, Đại học Y Dược Trong 54 mẫu U NBTK, 11 mẫu có MYCN khuếch đại, chiếm 20,37%và 45 mẫu không khuếch đại MYCN, chiếm79,63% Dữ liệu khuếch đại MYCN chúng tơi có tương đồng với mức tỷ lệ khuếch đại MYCN từ báo cáo trước khoảng 20-25% [13,15] Trong nghiên cứu này, 9/11 mẫu khối u (81,82%) thuộc giai đoạn muộn theo INSS Tỷ lệ cao gấp lần tỷ lệ liệu nghiên cứu trước 40% [13,15] Bệnh nhân theo dõi qua tái khám, qua điện thoại điện báo lại bệnh nhân từ ngày thu mẫu tháng 11/2016 Thời gian theo dõi 39 tháng Trong thời gian theo dõi, có 23/54 (42,59%) bệnh nhân tử vong; 5/54 (9,26%) bệnh nhân tái phát có bệnh nhân cịn sống, có trường hợp khơng thể liên hệ với bệnh nhân nên khơng xác định tình trạng bệnh thời gian nghiên cứu Bảng 8: Đặc điểm lâm sàng bệnh nhân U NBTK nghiên cứu (n = 54) Đặc điểm lâm sàng phân tử Số lượng mẫu Tỷ lệ (%) Giới tính Nam 34 62.96 Nữ 20 37.04 < 18 tháng 15 27.78  18 tháng 39 72.22 1/2/4s 12 22.22 3/4 33 61.11 Khơng xác định 16.67 Khơng 43 79.63 Có 11 20.37 Độ tuổi Giai đoạn Sự khuếch đại gen MYCN Tách chiết, đánh giá số lượng chất lượng RNA tổng số Tất mẫu mô tươi mô đông lạnh bệnh nhân U NBTK tách chiết RNA tổng số RNeasy Mini Kit (QIAGEN, Đức) có độ tinh cao với OD260nm/280nm nằm khoảng 1,77 – 2,1 A260nm/230nm > 1,7 Hàm lượng RNA tổng số trung bình mẫu U NBTK 128,82 ng/µl Cùng với đo nồng độ RNA, sản phẩm tiến hành điện di gel agarose để đánh giá sơ chất lượng RNA sau tách chiết trước tổng hợp cDNA (Hình 2) Tính ngun vẹn RNA đánh giá dựa vào kích thước độ sáng băng điện di gel Ở tế bào động vật có vú nói chung người nói riêng, hai băng điện di gel agarose đại diện cho hai tiểu phần ribosome RNA (rRNA) Hình 2: Hình ảnh điện di RNA tổng số mẫu U 28S 18S với kích thước NBTK M: thang kích thước (kb), mẫu đại diện khoảng 5kb 1,9kb Kết điện di NB30, NB40, NB55 thể tính nguyên vẹn kích thước RNA tổng số sau tách chiết Hình cho thấy mẫu RNA tách chiết phân làm băng rõ rệt khoảng kích thước 5kp 1,9 kp có vệt sáng đứt gãy lượng nhỏ RNA Ngoài ra, quan sát hình điện di thấy có băng sáng kích thước 5kp sản phẩm RNA lẫn lượng DNA Tuy nhiên, việc thiết kế mồi bắt đặc hiệu mRNA gen ARID1A, không bắt DNA nên đảm bảo tính đặc hiệu phản ứng PCR Trước tiến hành khuếch đại mRNA gen ARID1A, mồi phát mRNA gen ARID1A tối ưu hóa nhiệt độ bắt cặp với cặp mồi bắt mRNA gen giữ nhà B2M nhiệt độ 52oC, 54oC, 56oC, 58oC 60oC Nhiệt độ lai tối ưu hai cặp mồi 58oC phản ứng Real time RT-PCR có sản phẩm đặc hiệu xuất đỉnh chảy phản ứng khuếch đại cDNA gen ARID1A B2M, nhiệt độ khoảng 85oC 82oC (Phụ lục ) Sản phẩm khuếch đại điện di giải trình tự Sanger Kết giải trình đoạn gen khuếch đại với trình tự kích thước với trình tự tham khảo Chính vậy, chúng tơi tiến hành phản ứng với cặp mồi gen ARID1A B2M mẫu U NBTK mẫu đối chứng với chương trình nhiệt thành phần phản ứng Hình 3: Biểu đồ Waterfall thể biểu mRNA gen ARID1A mức độ phiên mã Mức độ biểu mRNA 54 mẫu U NBTK phân tích dựa phương pháp ∆∆Ct Mỗi côt biểu thị giá trị 2- ∆∆Ct biểu ARID1A mô U NBTK mô bình thường, cột màu xanh dương: mẫu biểu mRNA cao, cột màu xanh lá: mẫu hiện mRNA thấp Mối tương quan biểu gen ARID1A với yếu tố tiên lượng lâm sàng Theo hệ thống phân loại nhóm nguy INRG, yếu tố lâm sàng độ tuổi, giai đoạn có vai trị quan trọng tiên lượng bệnh U NBTK Những bệnh nhi nhỏ 18 tháng tuổi có tiên lượng tốt thời gian sống lâu so với bệnh nhi lớn 18 tháng tuổi nên phân chia làm hai quần thể U NBTK nhỏ 18 tháng (15/54 (27,28%) bệnh nhân) lớn 18 tháng (39/54 (72,22%) bệnh nhân để đánh giá mối liên hệ biểu gen ARID1A với độ tuổi Kết cho thấy nhóm bệnh nhân nhỏ 18 tháng biểu mRNA ARID1A trung bình cao nhóm bệnh nhân lớn tuổi hơn; khác biệt có ý nghĩa thống kê với p = 0,015 (hình 4B bảng 9) Về giai đoạn bệnh, chúng tơi phân chia giai đoạn thành hai nhóm nhóm bệnh nhân thuộc giai đoạn 1, 4s thường có tiên lượng tốt bệnh nhân giai đoạn có khối u chưa di xa (giai đoạn 1/2) có khả tự suy thối (giai đoạn 4s), chiếm 22,22% (12/54 mẫu); nhóm bệnh nhân thuộc giai đoạn 3, có tiên lượng xấu khối u di xa, chiếm 61,11% (33/54 mẫu) Nhóm giai đoạn 1, 4s biểu mRNA ARID1A trung bình cao giai đoạn 3, khác biệt có ý nghĩa thống kê (p = 0,032) (hình 4C) Ngồi giới tính nam nữ đánh giá mối tương quan với biểu gen ARID1A Kết cho thấy mối liên quan biểu mRNA ARID1A nhóm bệnh nhân nam nữ (p = 0,312) (hình 4A) Hình 4: Mối tương quan biểu mRNA gen ARID1A yếu tố lâm sàng, phân tử Mối tương quan biểu ARID1A mRNA với đặc điểm lâm sàng đặc điểm sinh học khác: (A) giới tính (nam nữ); (B) độ tuổi (< 18 tháng  18 tháng); (C) Giai đoạn theo hệ thống phân loại INSS (1,2,3,4 4s); (D) Có khơng có khuếch đại gen MYCN; (Sử dụng kiểm định Student’s t-test; P-value < 0,05 (*), ns: non-significant – khơng có ý nghĩa thống kê) Mối tương quan biểu gen ARID1A với khuếch đại MYCN Ngoài yếu tố lâm sàng, khuếch đại gen MYCN đánh giá thời điểm chẩn đoán xem yếu tố tiên lượng độc lập U NBTK Những mẫu U NBTK có khuếch đại gen MYCN xếp vào nhóm nguy cao với tỷ lệ sống sót 50% độ tuổi giai đoạn bệnh Trong nghiên cứu này, tiến hành phân tích mối tương quan biểu mRNA ARID1A với khuếch đại MYCN kiểm định Student’s t-test Kết cho thấy khơng có mối tương quan biểu mRNA ARID1A với khuếch đại MYCN Cụ thể, biểu mRNA ARID1A khơng có khác biệt nhóm khuếch đại MYCN (11/54 mẫu; 20,37%) không khuếch đại MYCN (43/54 mẫu; 79,63%) (p= 0,653) (hình 4D bảng 9) Bảng 9: Đánh giá mối tương quan biểu gen ARID1A với đặc điểm lâm sàng yếu tố phân tử Đặc điểm lâm sàng Số lượng Biểu mRNA ARID1A phân tử mẫu Thấp (n=41 ) Cao (n=13) Nam 34 26 Nữ 20 < 18 tháng 15  18 tháng 39 32 1/2/4s 12 3/4 33 25 P-value (*) Giới tính 0.312 Độ tuổi 0.015 Giai đoạn Không xác định Sự khuếch đại gen 0.032 MYCN Khơng 43 34 Có 11 0.653 (*) Sử dụng Student’s T-test Mối liên quan biểu gen ARID1A với sống sót Bệnh nhân U NBTK theo dõi sau chẩn đoán trình điều trị bệnh Kết so sánh sống sót hai nhóm bệnh nhân U NBTK biểu mRNA gen ARID1A cao thấp thể hình Hình 5: So sánh sống sót hai nhóm bệnh nhân U NBTK biểu mRNA gen ARID1A cao thấp So sánh tỷ lệ sống sót nhóm bệnh nhân có biểu ARID1A cao (n=13) nhóm biểu thấp (n=41) phương pháp Kaplan-Meier, đồng thời đánh giá khác biệt thời gian sống hai nhóm kiểm định Gehan-Breslow Wilcoxon (p=0.151) Trục tung biểu thị tỷ lệ sống sót (%) bệnh nhân trục hồnh thời gian sống (tháng) trình theo dõi BÀN LUẬN: Sự biểu mRNA gen ARID1A mô U NBTK so với mơ bình thường phân tích dựa phương pháp 2-∆∆Ct Livak Giá trị 2-∆∆Ct lớn nghĩa mRNA gen ARID1A U NBTK cao so với mơ bình thường ngược lại, giá trị nhỏ biểu thấp Kết đánh giá biểu mRNA ARID1A mẫu U NBTK trình bày Hình Mức độ biểu trung bình ARID1A mRNA mô u 0,862  1,33 (mean  s.d, tiêu chuẩn hóa gen B2M) Mẫu biểu mRNA cao NB40 cao khoảng lần so với mẫu bình thường mẫu biểu mRNA thấp NB53, thấp mẫu đối chứng khoảng 17 lần Trong 54 mẫu khối u, có 13/54 (24,07%) mẫu biểu mRNA cao 41/54 (75,92%) mẫu biểu thấp mRNA thấp so với mẫu đối chứng Trong nghiên cứu này, thấy biểu mRNA gen ARID1A biểu thấp hầu hết mẫu U NBTK Kết tương đồng với nghiên cứu ung thư vú cho thấy biểu mRNA gen ARID1A mô ung thư thấp so với mơ bình thường tương ứng Trong nghiên cứu này, kết mối tương quan biểu mRNA ARID1A với độ tuổi khác biệt có ý nghĩa thống kê tương đồng với nghiên cứu Huang cộng sự, biểu ARID1A có liên quan đến bệnh nhân trẻ tuổi mắc ung thư tế bào sáng buồng trứng (p = 0,048) Tuy nhiên, mức độ biểu gen ARID1A bệnh nhân 18 tháng nghiên cứu cao Thời gian theo dõi bệnh nhân kiện xảy ghi nhận cụ thể thời điểm kết thúc nghiên cứu Thời gian sống trung bình tất bệnh nhân tham gia nghiên cứu 12,41  8,08 tháng, từ đến 49 tháng Trong 54 bệnh nhân, 24/54 (44,44%) trường hợp tử vong với thời gian sống trung bình 12,4 tháng 30/54 (55,56%) trường hợp sống thời điểm kết thúc nghiên cứu Có 5/54 (9,26%) ca tái phát, ca tái phát tử vong ca tái phát sống Thời gian sống trung bình nhóm biểu ARID1A mRNA cao thấp 13,55  8,59 tháng 12,41  8,08 tháng Chúng so sánh tỷ lệ sống sót nhóm bệnh nhân có biểu mRNA ARID1A cao thấp phương pháp Kaplan-Meier, đồng thời đánh giá khác biệt thời gian sống hai nhóm kiểm định Gehan-Breslow Wilcoxon Kết cho thấy khơng có khác biệt thời gian sống sót nhóm bệnh nhân biểu mRNA ARID1A cao nhóm biểu thấp (p =0,151) KẾT LUẬN: Nghiên cứu đánh giá biểu gen ARID1A mức độ phiên mã dịch mã 54 mẫu U NBTK Tỷ lệ mẫu biểu mRNA ARID1A thấp cao gấp lần tỷ lệ mẫu biểu cao với tỷ lệ 75,92% (41/54 ) 24,07% (13/54) mẫu biểu thấp mRNA thấp so với mẫu đối chứng Hơn nữa,80% mẫu mô U NBTK không biểu ARID1A Điều thú vị hầu hết mô U NBTK biểu biểu thấp protein ARID1A có tương đồng với kết đánh giá biểu mRNA Ngồi ra, có mối liên hệ biểu gen ARID1A với độ tuổi giai đoạn khơng có mối liên hệ với giới tính, khuếch đại gen MYCN Sự sống sót hai nhóm bệnh nhân có biểu mRNA ARID1A cao thấp khơng có khác biệt Mặc dù nghiên cứu đạt kết định đánh giá biểu gen ARID1A nhóm bệnh nhân U NBTK cịn số hạn chế mang tính khách quan Trong nghiên cứu, thiếu thông tin giai đoạn mẫu nên số lượng mẫu đựa đưa vào đánh giá mối tương thấp Hơn nữa, nhóm mẫu thuộc yếu tố lâm sàng khách chưa cân đối mặt số lượng nên có khả dẫn đến đánh giá mối tương quan biểu mRNA ARID1A với đặc điểm lâm sàng khuếch đại MYCN mang tính tương đối Nghiên cứu hạn chế số lượng mẫu U NBTK để khảo sát biểu protein ARID1A nên chưa thể so sánh biểu protein với mRNA gen ARID1A để đến đánh giá mối liên hệ biểu protein ARID1A với yếu tố lâm sàng Nhận khuyết điểm nghiên cứu mình, chúng tơi có vài kiến nghị để cải thiện độ tin cậy đề tài phát triển rộng để có sở liệu tồn diện vai trị ARID1A U NBTK, cụ thể sau: - Thu thập đầy đủ thông tin yếu tố lâm sàng bệnh nhân theo dõi sống sót bệnh nhân - Đánh giá biểu protein ARID1A mối liên hệ biểu ARID1A với đặc điểm lâm sàng - Nghiên cứu vai trò hoạt động ARID1A U NBTK vai trò biệt hóa, tăng sinh TÀI LIỆU THAM KHẢO: Abe, H., Hayashi, A., Kunita, A., Sakamoto, Y., Hasegawa, K., Shibahara, J., Fukayama, M (2015) Altered expression of AT-rich interactive domain 1A in hepatocellular carcinoma Int J Clin Exp Pathol, 8(3), 2763-2770 Bosse, K R., & Maris, J M (2015) Advances in the translational genomics of neuroblastoma: From improving risk stratification and revealing novel biology to identifying actionable genomic alterations Cancer doi: 10.1002/cncr.29706 Bosse, K R., & Maris, J M (2016) Advances in the translational genomics of neuroblastoma: From improving risk stratification and revealing novel biology to identifying actionable genomic alterations Cancer, 122(1), 20-33 doi: 10.1002/cncr.29706 Bui Chi Bao, N D V., Chau Gia Cac, Nguyen Thi Hiep (2016, summitted) A study of Expression mRNA Tropomyosin Receptor Kinase B (TrkB) in Neuroblastoma of Vietnamese Patients Cho, H., Kim, J S., Chung, H., Perry, C., Lee, H., & Kim, J H (2013) Loss of ARID1A/BAF250a expression is linked to tumor progression and adverse prognosis in cervical cancer Hum Pathol, 44(7), 1365-1374 doi: 10.1016/j.humpath.2012.11.007 Cho, H D., Lee, J E., Jung, H Y., Oh, M H., Lee, J H., Jang, S H., Lee, H J (2015) Loss of Tumor Suppressor ARID1A Protein Expression Correlates with Poor Prognosis in Patients with Primary Breast Cancer J Breast Cancer, 18(4), 339-346 doi: 10.4048/jbc.2015.18.4.339 Cohn, S L., Pearson, A D., London, W B., Monclair, T., Ambros, P F., Brodeur, G M., Force, I T (2009) The International Neuroblastoma Risk Group (INRG) classification system: an INRG Task Force report J Clin Oncol, 27(2), 289-297 doi: 10.1200/JCO.2008.16.6785 D.D.K.Truong, N N Q N., N.V.T.Vo, G.T.H.Nguyen,H.T.T.Huyen, N.T.To, N.T.Vu, V.D.Nguyen, B.T.Ho, K.D.Truong, Carol J.Thiele, CB.Bui (2015) MYCN stratification of risk in neuroblastoma by q-PCR 19(ISSN 1859 – 1779), 1-72 Esiashvili, N., Anderson, C., & Katzenstein, H M (2009) Neuroblastoma Curr Probl Cancer, 33(6), 333-360 doi: 10.1016/j.currproblcancer.2009.12.001 10 Esiashvili, N., Goodman, M., Ward, K., Marcus, R B., Jr., & Johnstone, P A (2007) Neuroblastoma in adults: Incidence and survival analysis based on SEER data Pediatr Blood Cancer, 49(1), 41-46 doi: 10.1002/pbc.20859 11 Guan, B., Gao, M., Wu, C H., Wang, T L., & Shih Ie, M (2012) Functional analysis of in-frame indel ARID1A mutations reveals new regulatory mechanisms of its tumor suppressor functions Neoplasia, 14(10), 986-993 12 Guan, B., Wang, T L., & Shih Ie, M (2011) ARID1A, a factor that promotes formation of SWI/SNF-mediated chromatin remodeling, is a tumor suppressor in gynecologic cancers Cancer Res, 71(21), 6718-6727 doi: 10.1158/0008-5472.CAN-11-1562 13 Ham, J., Costa, C., Sano, R., Lochmann, T L., Sennott, E M., Patel, N U., Faber, A C (2016) Exploitation of the Apoptosis-Primed State of MYCN-Amplified Neuroblastoma to Develop a Potent and Specific Targeted Therapy Combination Cancer Cell, 29(2), 159-172 doi: 10.1016/j.ccell.2016.01.002 14 He, F., Li, J., Xu, J., Zhang, S., Xu, Y., Zhao, W., Wang, X (2015) Decreased expression of ARID1A associates with poor prognosis and promotes metastases of hepatocellular carcinoma J Exp Clin Cancer Res, 34, 47 doi: 10.1186/s13046-015-0164-3 15 Irwin, M S., & Park, J R (2015) Neuroblastoma: paradigm for precision medicine Pediatr Clin North Am, 62(1), 225-256 doi: 10.1016/j.pcl.2014.09.015 16 Iyer, R., Wehrmann, L., Golden, R L., Naraparaju, K., Croucher, J L., MacFarland, S P., Brodeur, G M (2016) Entrectinib is a potent inhibitor of Trk-driven neuroblastomas in a xenograft mouse model Cancer Lett, 372(2), 179-186 doi: 10.1016/j.canlet.2016.01.018 17 Jones, S., Wang, T L., Shih Ie, M., Mao, T L., Nakayama, K., Roden, R., Papadopoulos, N (2010) Frequent mutations of chromatin remodeling gene ARID1A in ovarian clear cell carcinoma Science, 330(6001), 228-231 doi: 10.1126/science.1196333 18 Katagiri, A., Nakayama, K., Rahman, M T., Rahman, M., Katagiri, H., Nakayama, N., Miyazaki, K (2012) Loss of ARID1A expression is related to shorter progression-free survival and chemoresistance in ovarian clear cell carcinoma Mod Pathol, 25(2), 282-288 doi: 10.1038/modpathol.2011.161 19 Lee, L H., Sadot, E., Ivelja, S., Vakiani, E., Hechtman, J F., Sevinsky, C J., Shia, J (2016) ARID1A expression in early stage colorectal adenocarcinoma: an exploration of its prognostic significance Hum Pathol doi: 10.1016/j.humpath.2016.02.004 20 Lin, C., Song, W., Bi, X., Zhao, J., Huang, Z., Li, Z., Zhao, H (2014) Recent advances in the ARID family: focusing on roles in human cancer Onco Targets Ther, 7, 315-324 doi: 10.2147/OTT.S57023 21 Luchini, C., Veronese, N., Solmi, M., Cho, H., Kim, J H., Chou, A., Correll, C U (2015) Prognostic role and implications of mutation status of tumor suppressor gene ARID1A in cancer: a systematic review and meta-analysis Oncotarget, 6(36), 39088-39097 doi: 10.18632/oncotarget.5142 22 Ludwig, J A., & Weinstein, J N (2005) Biomarkers in cancer staging, prognosis and treatment selection Nat Rev Cancer, 5(11), 845-856 doi: 10.1038/nrc1739 23 Maris, J M (2010) Recent advances in neuroblastoma N Engl J Med, 362(23), 2202-2211 doi: 10.1056/NEJMra0804577 24 Maris, J M., White, P S., Beltinger, C P., Sulman, E P., Castleberry, R P., Shuster, J J., Brodeur, G M (1995) Significance of chromosome 1p loss of heterozygosity in neuroblastoma Cancer Res, 55(20), 4664-4669 25 Pinto, N R., Applebaum, M A., Volchenboum, S L., Matthay, K K., London, W B., Ambros, P F., Cohn, S L (2015) Advances in Risk Classification and Treatment Strategies for Neuroblastoma J Clin Oncol, 33(27), 3008-3017 doi: 10.1200/JCO.2014.59.4648 26 Sausen, M., Leary, R J., Jones, S., Wu, J., Reynolds, C P., Liu, X., Hogarty, M D (2013) Integrated genomic analyses identify ARID1A and ARID1B alterations in the childhood cancer neuroblastoma Nat Genet, 45(1), 12-17 doi: 10.1038/ng.2493 27 Schleiermacher, G., Janoueix-Lerosey, I., & Delattre, O (2014) Recent insights into the biology of neuroblastoma Int J Cancer, 135(10), 2249-2261 doi: 10.1002/ijc.29077 28 Selcukbiricik, F., Tural, D., Esatoglu, N., Kocak, S., & Mandel, N M (2011) A very rare adult case with neuroblastoma Case Rep Oncol, 4(3), 481-486 doi: 10.1159/000332761 29 Sharp, S E., Gelfand, M J., & Shulkin, B L (2011) Pediatrics: diagnosis of neuroblastoma Semin Nucl Med, 41(5), 345-353 doi: 10.1053/j.semnuclmed.2011.05.001 30 Stiller, C A., & Parkin, D M (1992) International variations in the incidence of neuroblastoma Int J Cancer, 52(4), 538-543 31 T.B.V.Ho, T N T D K., Vietname surveillence of Neuroblastoma 2005 - 2010 (2011) Vietnamese medicine and pharmacy journal(235), 45-50 32 Takeda, T., Banno, K., Okawa, R., Yanokura, M., Iijima, M., Irie-Kunitomi, H., Aoki, D (2016) ARID1A gene mutation in ovarian and endometrial cancers (Review) Oncol Rep, 35(2), 607-613 doi: 10.3892/or.2015.4421 33 Tran, M T., Baglin, J., Tran, T T., Hoang, K T., Phung, L T., Read, A., & Greaves, R F (2014) Development of a new biochemical test to diagnose and monitor neuroblastoma in Vietnam: homovanillic and vanillylmandelic acid by gas chromatography-mass spectrometry Clin Biochem, 47(3), 206-215 doi: 10.1016/j.clinbiochem.2013.11.016 34 Vũ Đình Quang, N X H., Nguyễn Thị Phương Mai,, Phùng Tuyết Lan, T Đ H., Trần Ngọc Sơn, Hoàng Ngọc Thạch, Bùi Khắc Hiếu,, & Ngô Diễm Ngọc, N T L (2013) Đánh giá khuếch đại gen MYCN bệnh nhân u nguyên bào thần kinh Nhi Khoa, (1), 68-67 35 Wang, X., Nagl, N G., Wilsker, D., Van Scoy, M., Pacchione, S., Yaciuk, P., Moran, E (2004) Two related ARID family proteins are alternative subunits of human SWI/SNF complexes Biochem J, 383(Pt 2), 319-325 doi: 10.1042/BJ20040524 36 Wu, J N., & Roberts, C W (2013) ARID1A mutations in cancer: another epigenetic tumor suppressor? Cancer Discov, 3(1), 35-43 doi: 10.1158/2159-8290.CD-12-0361 37 Wu, R C., Wang, T L., & Shih Ie, M (2014) The emerging roles of ARID1A in tumor suppression Cancer Biol Ther, 15(6), 655-664 doi: 10.4161/cbt.28411 38 Zhang, X., Zhang, Y., Yang, Y., Niu, M., Sun, S., Ji, H., Pang, D (2012) Frequent low expression of chromatin remodeling gene ARID1A in breast cancer and its clinical significance Cancer Epidemiol, 36(3), 288-293 doi: 10.1016/j.canep.2011.07.006 ... KẾT (TÓM TẮT) ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG BIỂU HIỆN CỦA GEN ARID1A LIÊN QUAN ĐẾN SỰ TIÊN LƯỢNG TRONG LÂM SÀNG CỦA UNBTK Ở TRẺ EM VN Mã số: Chủ nhiệm đề tài (ký, họ tên) Tp Hồ Chí Minh,... liên quan biểu mRNA ARID1A nhóm bệnh nhân nam nữ (p = 0,312) (hình 4A) Hình 4: Mối tương quan biểu mRNA gen ARID1A yếu tố lâm sàng, phân tử Mối tương quan biểu ARID1A mRNA với đặc điểm lâm sàng. .. nhóm biểu ARID1A cao [23]; ngồi hai nghiên cứu ung thư gan báo cáo 3% trường hợp biểu 17.9% giảm biểu ARID1A liên quan đến tăng kích thước khối u liên quan đến biểu p53 [24]; đồng thời giảm biểu