Bài viết trình bày ứng dụng phương pháp thể mỡ để chuyển nạp gien vào tế bào của loài vi tảo lam Spirulina Platensis thông qua sàng lọc các tế bào Spirulina Platensis tái tổ hợp trên môi trường lỏng; so sánh hiệu suất chuyển nạp giữa phương pháp thể mỡ và phương pháp xung điện.
29(1): 70-75 Tạp chí Sinh học 3-2007 ứng dụng phơng pháp thể mỡ Để chuyển nạp gien vào tế bào loài vi tảo lam Spirulina platensis Ngô Hoài Thu, Đặng Diễm Hồng Viện Công nghệ sinh học Sei-ichi Aiba, Yoshikazu Kawata Viện nghiên cứu Khoa học Công nghệ tiên tiến, Osaka, Nhật Bản Spirulina platensis loài vi tảo lam có tính thơng mại cao Hàng năm, sản lợng nuôi trồng thu hoạch loài vi tảo lam toàn giới đạt khoảng 3000 tấn/năm Việc phân tích thành phần dinh dỡng S platensis cho thấy hàm lợng protein chiếm khoảng 50-70%, lipit chiếm 16%, hydratcacbon chiếm khoảng 15% trọng lợng khô tế bào [2] S platensis nguồn cung cấp vitamin, chủ yếu vitamin B [1] Vì thế, S platensis đ đợc dùng làm thực phẩm chức cho ngời động vật Ngoài ra, S platensis đợc dùng để cung cấp số hợp chất có hoạt tính sinh học nh phycoxianin, axit béo không b o hòa cần thiết cho thể nh axit linolenic (C18:2) axit -linolenic (axit 6, 9, 12octadecatrienoic-C18:3) Với tiềm ứng dụng nh việc mở rộng khả ứng dụng S platensis lĩnh vực nh xử lý môi trờng, cung cấp hoạt chất sinh học có giá trị nh axit -linolenic hay chất dẻo sinh học (bioplastic) ®iỊu khả thi HiƯn nay, kü tht ADN t¸i tỉ hợp phơng pháp việc nâng cao khả tổng hợp chất có hoạt tính sinh học Để chuyển nạp gien vào t bào cđa S platensis, ng−êi ta míi chØ sư dơng phơng pháp biến nạp xung điện, nhiên phơng pháp nhiều hạn chế nh gây độc cho tế bào, khả sinh sản tế bào sau thấp màng tế bào bị tổn thơng, không thuận tiện hiệu [8, 9] Hiện nay, có số phơng pháp chuyển nạp đ đợc áp dụng rộng r i nh: DEAE dextran, phốtphát canxi, vi tiêm, xung điện, lipofection-liposome hay thể mỡ Trong đó, 70 chuyển nạp xung điện [3] thể mỡ cho hiệu cao Phơng pháp thể mỡ ® ®−ỵc sư dơng réng r i cho sù chun np; nhng đợc áp dụng chủ yếu cho tế bào động vật, tế bào trần Phơng pháp cho hiệu an toàn so với phơng pháp biến nạp truyền thống- phơng pháp xung điện [5] Trong phơng pháp thể mỡ, có sử dụng DOTAP (N-[1(2,3-dioleoyloxy)propyl]-N, N, N-mêtylsunphát trimêtylammonium) thể mỡ đợc gắn bề mặt plasmit, tích điện âm nên chúng có vai trò hỗ trợ cho việc vận chuyển plasmit vào tế bào thông qua lỗ bề mặt màng tế bào Chính vậy, ảnh hởng đến cấu trúc màng tế bào Gần đây, đ phát thấy sử dụng phơng pháp tế bào Escherichia coli [4, 5] Khi so sánh hiệu suất chuyển nạp tế bào E coli cho thấy phơng pháp thể mỡ có hiệu xuất chuyển nạp cao gấp 10 lần so với phơng pháp xung điện [5, 6] S platensis lại có cấu trúc màng tế bào gần tơng tự nh E coli, sinh vật cha có nhân chuẩn, đ áp dụng phơng pháp thể mỡ đối tợng S platensis Vectơ pHSG397- đợc thiết kế dựa vectơ gốc pBR322 pUC18-/pUC19 [7], có kích thớc tơng ứng khoảng 2,2 kb, vectơ tách dòng: có gen thị-cat (chloramphenicol axêtyltranferaza) kháng chất kháng sinh chloramphenicol (Cm), vùng đa nối tách dòng chứa điểm cắt enzim cắt giới hạn, có khả nhân đôi hoàn toàn độc lập, không phụ thuộc vào trình nhân đôi vi khuẩn E coli nh tế bào S platensis, đ đợc sử dụng Trong báo này, trình bày kết bớc đầu ứng dụng phơng pháp thể mỡ để chuyển nạp gien vào tế bào S platensis, đồng thời so sánh với phơng pháp chuyển nạp truyền thống xung điện thông qua hiệu suất chuyển nạp I Phơng pháp nghiên cứu Vật liệu - VÐct¬ pHSG397 h ng TaKaRa (NhËt Bản) cung cấp, có chứa gien thị cat, kháng chất kháng sinh chloramphenicol (Cm) Véctơ pHSG397 đợc cắt mở vòng nhờ enzim cắt giới hạn EcoRI, có ký hiƯu lµ pHSG397/EcoRI - Hai chủng vi tảo lam Spirulina platensis C1 Viện B¶o tån gièng Pasteur cung cấp S platensis VN1 phòng Công ngh to, Vin Công ngh sinh hc cung cp - Hoá cht dùng cho viƯc biến nạp phương ph¸p thĨ mì h ng Roche cung cấp DOTAP (N-[1-(2, 3-dioleoyloxy) propyl]-N, N, N-mêtylsunphát trimêtylammonium) thể mỡ (Roche, Basel, Switzerland 1,0 àg/àl) - Cặp mồi nhân gien cat với kích thớc tơng ứng khoảng 700 bp, có trình tự nucleotit nh sau: CT-a: accaccttgatatatccca CT-2b: tgttccacgactacggcgac Phương ph¸p a Tạo tế bào Spirulina platensis kh bin theo phơng pháp Toyomizu M cs [8] Tế bào S platensis ủc nuôi lắc môi trng SOT (150 vòng/phút), nhit ủ 28-30oC, víi ¸nh s¸ng 1500 lux, OD600 đạt 0,5-0,8 Vì S platensis loài tảo lam đa bào, có dạng sợi màng tế bào xenluloza, nên để thu đợc dịch đồng thể tế bào một, đ sử dụng máy cắt sợi tảo thành phần nhỏ tế bào (US-300, Nippon Seki Co., Tokyo, Japan, ë ®iỊu kiƯn 50W 30 gi©y) Ly t©m 6000 v/p 10 ®Ĩ thu sinh khối cđa tế bào Sau ®ã, tÕ bào tảo đợc hoà tan trở lại 10 ml môi trờng SOT, đợc nuôi tĩnh khoảng thời gian 12 giờ, nhiệt độ phòng (28o-30oC) với ánh sáng yếu Sau đó, lại ly tâm 8000 v/p phút, 4oC để thu sinh khối tảo Rửa tế bào thu đợc lần nớc cất vô trùng Cuối cùng, hoà tan tế bào tảo ml dung dÞch HEPES (1 mM, pH = 7) cho mật độ tế bào đạt khoảng 3,75 ì 108 đến ì 108 tế bào/ml [9] Dịch tế bào khả biến đợc giữ đá sử dụng (trong vòng 24 giờ) Phản ứng nối ghép gen: trộn àl véctơ pHSG397 véctơ pHSG397/EcoRI (200 ng/µl) vµ µl DOTAP (1 µg/µl) víi nhau, theo tỉ lệ hàm lợng ADN 1: Sau đó, phản ứng đợc ủ 25oC phút b Biến nạp gien vào tế bào S platensis phơng pháp thể mỡ Bổ sung àg vectơ vào 50 àl tế bào S platensis khả bin, đặt đá khoảng phút Sau bổ sung ml môi trờng SOT, nuôi dịch 25oC giờ, không lắc Các tế bào S platensis tái tổ hợp đợc sàng lọc môi trờng rắn láng cã bỉ sung chÊt kh¸ng sinh Cm ë c¸c nồng độ tơng ứng là: 0, 0,1; 0,2; 0,5; 1,0; 2,0; 5,0 10 àg/ml Sau tuần nuôi cấy, thể S platensis tái tổ hợp quan sát thu nhận đợc c Biến nạp gien vào tế bào S platensis phơng pháp xung điện Bổ sung àg véctơ pHSG397 véctơ pHSG397/EcoRI (200ng/ml) vào 50 àl tế bào S platensis kh bin Giữ dịch đá khoảng 510 phút, sau chuyển dịch vào cuvét đ đợc giữ lạnh (có khoảng cách điện cực mm) Biến nạp xung ®iƯn ë ®iỊu kiƯn 200 Ω, 25 µF, kV/cm thêi gian tõ 4-5 mini gi©y Sau biÕn nạp, dịch S platensis tái tổ hợp đợc giữ đá phút bổ sung ml môi trờng SOT Tiếp tục nuôi dịch điều kiện 25oC Sau đó, cấy trải dịch thu đợc môi trờng rắn nuôi môi trờng lỏng có bổ sung Cm với nồng độ tơng ứng từ 0-10 àg/ml - Tạo dòng không chuyển động môi trờng thạch: bổ sung SDS (sodium dodecyl sulphate) với nồng độ khác từ 0,001% đến 1,0% vào môi trờng nuôi cấy tảo S platensis Sau ngày nuôi cấy 150 lux 30C, nồng độ SDS mà S platensis có khả sống sót cao đợc xác định dựa giá 71 trị OD600 Tiếp theo, nồng độ SDS tơng ứng đợc dùng để bổ sung vào môi trờng rắn (1,2% thạch) tiếp tục nuôi cấy 10-15 ngày Trong báo này, đ sử dụng phơng pháp biến nạp nêu với chủng tảo lam S platensis C1 VN1 Hiệu chuyển nạp phơng pháp đợc đánh giá thông qua hiệu suất chuyển nạp nồng độ chất kháng sinh Cm cao mà tế bào S platensis tái tổ hợp sống sót nhiều Các công thức thí nghiệm đợc sử dụng báo đợc bảng Bảng Các công thức thí nghiệm đợc sử dụng báo Ký hiƯu mÉu Tªn mÉu S platensis ĐC âm ĐC âm ĐC âm Mẫu thử nghiệm MÉu thư nghiƯm + + + + + pHSG397 pHSG397/ EcoR I DOTAP thĨ mì + + + + + + Ghi chú: ĐC đối chứng II Kết thảo luận Sng lc tế bào S platensis tái t hp môi trng lng S platensis có cấu tạo dạng sợi, xoắn có khả di chuyển môi trờng lỏng nh môi trờng rắn Vì vậy, chuyển gien vào S platensis, đ gặp khó khăn cần xác định dòng mang gien tái tổ hợp Do đó, trớc chuyển gien vào S platensis, cần phải sàng lọc đợc chủng có khả tạo dòng không chuyển động bề mặt thạch nhờ sử dụng SDS SDS chất tẩy rửa, có vai trò phá vỡ màng tế bào; song, nồng độ định, chúng lại có vai trò ngăn cản chuyển động tế bào S platensis Để kiểm tra khả sống sót hai chủng C1 VN1 nồng độ SDS khác nhau, dải nồng độ từ 0,001% đến 1% đ đợc sử dụng Kết thu đợc cho thấy, S platensis có khả sống sót cao nồng độ SDS 0,002% (kết không đây) nồng độ này, có chng S platensis C1 có khả tạo đợc dòng cố định bề mặt thạch, sau 10-15 ngày nuôi cấy Chuyển nạp gien S platensis Với mô hình thí nghiệm nh đ nêu trên, đ tiến hành biến nạp véctơ pHSG397 72 pHSG397 đ đợc mở vòng EcoRI (pHSG397/EcoRI) vào tế bµo cđa hai chđng S platensis C1 vµ VN1 theo phơng pháp thể mỡ Kết sau tháng chuyển nạp, nhận thấy mẫu đối chứng âm, tế bào S platensis tái tổ hợp khả sống sót môi trờng có bổ sung Cm Điều chứng tỏ tế bào S platensis không chứa gien kháng Cm vectơ pHSG397 đ không đợc chuyển vào tế bào S platensis hỗ trợ DOTAP thể mỡ Đối với mẫu thử nghiệm (bảng 1), tế bào S platensis C1 VN1 tái tổ hợp có khả sống sót đợc môi trờng SOT có bỉ sung Cm víi nång ®é tõ 0,1 ®Õn 0,5 àg/ml từ 0,1 đến 1,0 àg/ml, tơng ứng Kết đ cho thấy vectơ pHSG397 đ đợc chuyển nạp vào tế bào S platensis với hỗ trợ DOTAP thể mỡ Kết thu đợc đợc hình Với tế bào S platensis C1 VN1 tái tổ hợp sống sót nồng độ Cm 0,5 àg/ml, đ tiến hành cố định dòng tế bào S platensis tái tổ hợp môi trờng rắn với có mặt 0,002% SDS Sau tuần nuôi cấy, nhận đợc dòng tái tổ hợp cố định chủng C1 môi trờng thạch Còn với tế bào chủng VN1 tái tổ hợp có khả sống sót môi trờng chọn lọc có nồng độ Cm 0,5 àg/ml nhng chúng lại không tạo đợc dòng cố định bề mặt thạch Do vậy, việc xác định dòng tế bào có mang gien tái tổ hợp khó khăn Kết thu đợc đợc hình 2, cho thấy nồng độ 0,5àg/ml Cm, sau tháng chuyển nạp, đĩa petri thứ thứ bề mặt đĩa có xuất dòng S platensis tái tổ hợp cố định có màu xanh Cm (µg/ml) 0,1 Cm (µg/ml) 0,1 0,2 0,5 1,0 2,0 5,0 10,0 0,2 0,5 1,0 2,0 5,0 10,0 S platensis VN1 S platensis C1 Hình Tế bào S platensis C1 S platensis VN1 tái tổ hợp sau tháng chuyển nạp nồng độ Cm khác tÕ bµo Spirulina platensis ĐC âm tế bào S platensis + DOTAP thĨ mì ĐC âm tế bào S platensis + véctơ pHSG397 ĐC âm tế bào S platensis + véctơ pHSG397 + DOTAP thĨ mì .MÉu thư nghiƯm tÕ bµo S platensis + vÐct¬ pHSG397/EcoRI + DOTAP thĨ mì .MÉu thư nghiệm ĐC âm ĐC âm ĐC âm MÉu thư nghiƯm MÉu thư nghiƯm H×nh Tế bào chủng S platensis C1 tái tổ hợp tạo dòng cố định bề mặt thạch với nồng độ 0,5 àg/ml Cm sau tháng chuyển nạp Để khẳng định cách xác véctơ pHSG397 đ đợc chuyển nạp vào tế bào S platensis hay không, đ tiến hành phân tích mức độ ADN dòng tái tổ hợp thu đợc hình Vì cấu trúc véctơ pHSG397 cã chøa gien chØ thÞ - cat, cã vai trò kháng Cm nên đ kiểm tra có mặt véctơ tế bào S platensis tái tổ hợp nhờ vào có mặt gien cat Kết quả, với cặp mồi CT-a CT-2b, đ khuyếch đại đợc gien cat vectơ pHSG397 tế bào S platensis tái tổ hợp với kích thớc gien khoảng 700 bp (hình 3) Kết hình cho thấy, công thức đối chứng âm (các giếng 1, 3) đ không thu đợc băng có kích thớc 700 bp Trong băng đ thu đợc công thức mẫu thử nghiệm (các giếng 5) Điều đ góp phần khẳng định vectơ pHSG397 đ đợc chuyển nạp vào tế bào S platensis với hỗ trợ DOTAP thể mỡ 73 M C+1 700 bp Hình Kết phân tích gien cat tế bào vi tảo lam tái tổ hợp Ghi chú: giếng M Chỉ thị phân tö Kb Plus DNA Ladder; giÕng C+ gien cat vectơ pHSG397; giếng 1, 2, 3, 4, gien cat tế bào S platensis tái tổ hợp sau tháng chuyển nạp tơng ứng với công thức thí nghiệm bảng Khi so sánh hiệu suất chuyển nạp hai phơng pháp thể mỡ xung điện, nhận thấy phơng pháp thể mỡ có hiệu chuyển nạp cao gấp lần so với phơng pháp xung điện thông thờng véctơ pHSG397 không đợc cắt mở vòng (3,00.103/7,45.102) Còn véctơ đợc cắt mở vòng EcoRI hiệu suất chuyển nạp phơng pháp thể mỡ so với phơng pháp xung điện 15 lần (4,50.104/ 2,98.103) Kết hiệu suất chuyển nạp đợc bảng Ngoài ra, bảng 2, cho thấy véctơ pHSG397 đợc mở vòng enzim EcoRI hiệu suất chuyển nạp đạt đợc cao so với véctơ loại nhng không đợc mở vòng 15 lần (4,50.104/3,00.103) sử dụng phơng pháp thể mỡ Nh vậy, so với phơng pháp chuyển nạp xung điện hiệu suất chuyển nạp phơng pháp thể mỡ đạt cao gấp từ đến 15 lần tơng ứng véctơ chuyển nạp không đợc mở vòng mở vòng Kết đ cho thấy khả ứng dụng phơng pháp thể mỡ việc chuyển nạp gen vào tế bào S platensis cách có hiệu so với phơng pháp truyền thống - phơng pháp xung điện Bảng So sánh hiệu suất chuyển nạp phơng pháp thể mỡ phơng pháp xung điện Plasmit Véctơ pHSG397 Véctơ pHSG397/EcoRI Phơng pháp Thể mỡ Xung điện Thể mỡ Xung điện III Kết luận Đ chuyển nạp thành công véctơ pHSG397 vào tế bào chủng S platensis C1 chủng S platensis VN1 phơng pháp thể mỡ Hiệu suất chuyển nạp phơng pháp thể mỡ cao gấp đến 15 lần so với phơng pháp chuyển nạp xung điện tơng ứng véctơ chuyển nạp không đợc mở vòng mở vòng Các kết thu đợc báo cho thấy khả áp dụng có hiệu phơng pháp chuyển nạp thể mỡ so với phơng pháp xung điện theo định hớng sử dụng kỹ thuật ADN 74 Hiệu suất chuyển nạp (Số khuẩn lạc)/à àg DNA 3,00 103 7,45 102 4,50 104 2,98 103 t¸i tỉ hợp để tạo chủng S platensis tái tổ hợp có khả sinh tổng hợp số chất có hoạt tính sinh học cao nh axit béo không b o hoà hay chất dẻo sinh học TàI LIệU THAM KHảO Đặng Đình Kim, Đặng Hoàng Phớc Hiền, 1999: Công nghệ sinh học vi tảo Nxb N«ng nghiƯp Nguyễn Đức Lượng, 2002: C«ng nghệ vi sinh, Vi sinh vt hc công nghip Nxb Đại học quèc gia thµnh Hå ChÝ Minh, 2: 119-133 3 Hanahan D., 1983: J Mol Biol., 166: 577580 Inoue H et al., 1990: Gene, 96: 23-28 Kawata Y et al., 2003: Biosci Biotechnol Biochem., 67 (5): 1179-1181 Kawata Y et al., 2004: Marine Biotechnol., 6: 355-363 Takeshita S et al., 1987: Gene, 61: 63-74 Thiel and Poo H., 1989: Journal of Bacteriology: 5743-5746 Toyomizu M et al., 2001: Journal of Applied Phycology, 13: 209-214 Application of the lipofection method to transform gene into the cells of the cyanobacterium - species Spirulina platensis Ngo Thi Hoai Thu, Dang Diem Hong, Sei-ichi AIBA, Yoshikazu KAWATA Summary Spirulina platensis was a commercially cultured cyanobacterium spcies, having biomass up to 3.000 tons in a year and used as health food and animal feed If we could draw its potential, we could apply S platensis to solve environment problems S platensis produced valuable materials such as γ-linolenic acid, bioplastic etc To increase the content of these materials, the recombinant DNA technique was most important, but its application has just been started At present, to transform gene into Spirulina cells, only the electroporation method was applied for this purpose The lipofection method was used widely for transfection It had advantages for its convenience, efficiency and safety but its application was limited to culture mammalian cells Recently, we found E coli and S platensis could be transformed by lipofection method We investigated conditions to transform S platensis with DOTAP liposomal transfection reagents We used the pHSG397 vector with cat to transform S platensis The transformed Spirulina cells could survive in the condition of chloramphenicol concentration more than 0.5 µg/ml for weeks The transformation efficiency of the lipofection method was - 15 times better in comparison with the electroporation method, dependently on applied vetors (such as close or open vector cutted used by the enzyme EcoRI) Ngày nhËn bµi: 16-8-2006 75 ... bớc đầu ứng dụng phơng pháp thể mỡ để chuyển nạp gien vào tế bào S platensis, đồng thời so sánh với phơng pháp chuyển nạp truyền thống xung điện thông qua hiệu suất chuyển nạp I Phơng pháp nghiên... chuyển nạp phơng pháp thể mỡ đạt cao gấp từ đến 15 lần tơng ứng véctơ chuyển nạp không đợc mở vòng mở vòng Kết đ cho thấy khả ứng dụng phơng pháp thể mỡ vi c chuyển nạp gen vào tế bào S platensis cách... platensis VN1 S platensis C1 Hình Tế bào S platensis C1 S platensis VN1 tái tổ hợp sau tháng chuyển nạp nồng độ Cm khác tế bào Spirulina platensis ĐC âm tế bào S platensis + DOTAP thể mỡ