Tìm ra mô hình lây nhiễm tế bào thích hợp để nghiên cứu sinh bệnh học của Burkholderia pseudomallei cụ thể là quan sát và nghiên cứu sự hình thành tế bào lớn đa nhân ở ký chủ (được cho là một trong những độc tính của vi khuẩn).
Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 21 * Số * 2017 THIẾT LẬP MƠ HÌNH LÂY NHIỄM BURKHOLDERIA PSEUDOMALLEI VỚI DỊNG TẾ BÀO MONOCYTE-LIKE U937 VÀ DÒNG TẾ BÀO MONOCYTE-LIKERAW 264.7 Đường Thị Hồng Diệp* TĨM TẮT Mở đầu: Mơ hình lây nhiễm Burkholderia pseudomallei với dòng tế bào khác đặc biệt macrophage để nghiên cứu sinh bệnh học vi khuẩn nhà khoa học giới quan tâm Mục tiêu: Tìm mơ hình lây nhiễm tế bào thích hợp để nghiên cứu sinh bệnh học Burkholderia pseudomallei cụ thể quan sát nghiên cứu hình thành tế bào lớn đa nhân ký chủ (được cho độc tính vi khuẩn) Đối tượng - phương pháp nghiên cứu: Burkholderia pseudomallei chủng PP844, phân lập từ bệnh nhân mắc bệnh melioidosis, cho lây nhiễm với dòng tế bào: U937 RAW 264.7 nhiều MOI khác để khảo sát khả xâm lấn kích thích tạo thành tế bào lớn đa nhân tế bào ký chủ Kết quả: B pseudomallei có khả xâm lấn vào dòng tế bào chuột RAW 264.7 cao gấp 40 lần so với khả xâm lấn vào dòng tế bào người U937 Sự hình thành tế bào lớn đa nhân tìm thấy RAW 264.7, khơng tìm thấy dòng tế bào U937 Kết luận: Có thể dùng loại tế bào RAW 264.7 U937 để nghiên cứu sinh bệnh học B pseudomallei, nhiên tùy vào mục đích nghiên cứu chọn dòng tế bào thích hợp Từ khóa: Burkholderia pseudomallei, tế bào lớn đa nhân, RAW 264.7, U937 ABSTRACT INFECTION ASSAY IN CELL LINES RAW 264.7 AND U937 WITH BACTERIA BURKHOLDERIA PSEUDOMALLEI Duong Thi Hong Diep * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Supplement of Vol 21 - No - 2017: 90 - 96 Objectives: To establish an infection assay of Burkholderia pseudomallei, causative agent of melioidosis with cell lines RAW 264.7 and U937 in order to study bacterial pathogenicity Material and Method: Infect B pseudomallei PP844, isolated from melioidosis patient, to RAW 264.7 and U937 cell lines to study the invasion capability and to observe multinucleated giant cell (MNGC) formation Results: B pseudomallei can invade into RAW 264.7 cells with 40 folds higher than into U937 MNGC formation after infection assay can be observed in RAW 264.7 cells but not in U937 Conclusion: RAW 264.7 cells are suitable for studying MNGC formation after infection The right infection model should be chosen follow up the purpose of study Key words: Burkholderia pseudomallei, multinucleated giant cell (MNGC), RAW 264.7, U937 ĐẶT VẤN ĐỀ Theo Trung tâm phòng ngừa kiểm sốt dịch bệnh Mỹ (CDC) vi khuẩn gram âm Burkholderia pseudomallei phổ biến khu vực Đơng Nam Á phía Bắc Australia Burkholderia pseudomallei (B.pseudomallei) tác nhân gây nên bệnh Melioidosis hay gọi theo tên nhà khoa học lần phát bệnh Whitmore Bệnh nhân thường có biểu cấp tính sốt cao, nhức đầu, chán ăn, ho, đau ngực đau nhức bắp Khi diễn biến nặng Bộ mơn Hố Sinh – Khoa Y – Đại học Đại học Y Dược TPHCM Tác giả liên lạc: TS Đường Thị Hồng Diệp ĐT: 0989369390 90 Email: diepdh@yahoo.com Chuyên Đề Nội Khoa Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 21 * Số * 2017 gây nhiễm trùng máu, nguy tử vong cao (tới 40% vùng đông bắc Thái lan 15% Úc)(1, 9) dù điều trị thích hợp B pseudomallei kháng với hầu hết kháng sinh thông thường penicillin, ampicillin, kháng sinh cephalosporin hệ 2, gentamicin, tobramycin, streptomycin, polymyxin(7) Khi điều trị bệnh nhân cần điều trị kéo dài, kháng sinh dùng pha cấp tính Ceftazidime 50mg/kg (tối đa 2g) truyền tĩnh mạch 6-8 Meronem 25mg/kg (tối đa 1g) truyền tĩnh mạch Trong pha củng cố , kháng sinh dùng Trimethoprimsulfamethoxazole uống 12 Doxycycline uống 12 Amoxicillin/acid-clavulanic uỗng Thời gian điều trị pha phụ thuộc vào bệnh cảnh lâm sàng kéo dài từ tới tháng(1, 3, 9) Điều nguy hiểm bệnh điều trị lại dễ tái phát vi khuẩn có khả tồn loại tế bào thể kể macrophage, sức khỏe bệnh nhân bị suy kiệt bệnh tái tái lại điều trị không phác đồ Vi khuẩn vào thể người thông qua đường hô hấp (hít phải khí bụi có vi khuẩn) vết trầy xước da tiếp xúc trực tiếp với nước bùn lầy đất đai nông nghiệp nhiễm khuẩn Khi Burkholderia pseudomallei xâm nhập vào thể người chúng gây bệnh (thời gian ủ bệnh 1-21 ngày) nằm yên đến vài chục năm (ghi nhận tới 60 năm) chờ thể suy yếu lúc thuận lợi để gây bệnh(5, 9), bệnh thường gặp bệnh nhân suy giảm miễn dịch, bệnh nhân đái tháo đường, suy thận(1,2,8) Ở Nam Việt nam, ca melioidosis ghi nhận, nhiên khơng phải bệnh nhiễm trùng phổ biến tỉnh thành lân cận thành phố Hồ Chí Minh(6) Điều khác với vùng đông bắc Thái Land (Ubon Ratchathani), cách tây bắc thành phố Hồ Chí Minh 500km, nơi mà B pseudomallei gây nên phần năm số ca nhiễm trùng máu từ cộng đồng Có thể thiếu phương tiện để phân lập chẩn đốn Tiêu Hóa Nghiên cứu Y học xác tác nhân gây bệnh tuyến địa phương, nên bệnh nhân nặng tử vong trước chuyển lên thành phố Hồ Chí Minh, khơng thống kê nghiên cứu Ở Việt Nam, trường hợp bệnh ghi nhận từ thời thuộc Pháp thời kỳ chiến tranh đối tượng lính Pháp sau lính Mỹ tham chiến Việt Nam Đến có vài báo cáo ca bệnh nước melioidosis, nên chưa có nhìn đầy đủ dịch tễ học, bệnh cảnh lâm sàng bệnh nguy hiển (được Trung tâm phòng ngừa kiểm sốt bệnh tật Hòa Kỳ coi vũ khí sinh học tiềm năng) mà Việt Nam nằm vùng dịch tễ Một báo cáo miền Bắc Việt Nam cho thấy, khoảng thời gian từ 1997 – 2005 có 54 bệnh nhân chẩn đốn xác định Melioidosis với kết cấy máu dịch thể dương tính với B pseudomallei, bệnh nhân đến 18 tỉnh thành quanh Hà Nội(7,8) Bệnh Melioidosis điều trị kháng sinh phát chẩn đốn sớm, nhiên bệnh tái phát chưa có vacxin phòng bệnh Với phát triển kỹ thuật phân lập, nuôi cấy sinh học phân tử hiểu biết chế bệnh sinh điều hòa biểu gene B.pseudomallei ngày gia tăng Holden cộng năm 2004 cơng bố trình tự hồn chỉnh gene B.pseudomallei, gồm chromosome vòng: 4.07 Mb (megabase pair) 3.17 Mb(4) Để hiểu biết thêm chế bệnh sinh đóng góp kiến thức cho nghiên cứu vắc xin sau này, dựa vào kiến thức biết chúng tơi mong muốn thiết lập mơ hình lây nhiễm B.pseudomallei dòng tế bào người tế bào chuột ni cấy phòng thí nghiệm Nghiên cứu thiết kế với mục tiêu cụ thể sau: (1) thiết lập mơ hình lây nhiễm B.pseudomallei vớidòng tế bào U937 người dòng tế bào RAW 264.7 chuột (tế bào monocyte-like, tiền thân đại thực bào), so sánh khả xâm nhập vi khuẩn vào loại tế bào; (2) nghiên cứu khả 91 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 21 * Số * 2017 kích thích hình thành tế bào ký chủ khổng lồ đa nhân vi khuẩn để chọn mô hình phù hợp Kết nghiên cứu sử dụng làmmơ hình lây nhiễm nghiên cứu điều hòa biểu gene gây bệnh yếu tố phiên mã RpoS RpoN2 B pseudomallei ĐỐITƯỢNG-PHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU Nuôi cấy vi khuẩn Burkholderia pseudomallei Vi khuẩn Gram-âm B pseudomallei chủng PP844 phân lập từ bệnh nhân mắc bệnh melioidosis bệnh viện Srinagarind, tỉnh Khon Kaen, Thái lan (cung cấp PGS TS Utainsincharoen, đại học Mahidol, Thái lan) B pseudomallei PP844 lưu trữ -80oC LB (Luria-Bertani: Tryptone 10g, NaCl 10g, Yeast extract 5g, nước 950ml)media 60% glycerol (v/v) Trước lần làm thí nghiệm, PP844 lấy từ -80oC nuôi cấy 10ml TSB (Tryptic soy broth) không chứa kháng sinh, 37oC, máy lắc 200rpm Canh cấy qua đêm inoculate 0,1% (v/v) 5ml TSB 37oC, lắc 200rpm thêm Vi khuẩn sau kích hoạt cấy đĩa thạch Ashdown agar (môi trường chọn lọc B.pseudomallei) tủ ấm 37oC để phân lập khuẩn lạc Sau 48 đến 72 khuẩn lạc mọc, dùng que cấy, lấy khuẩn lạc, cho vào 10ml TSB, nuôi cấy môi trường lỏng qua đêm 37oC, lắc 200rpm Inoculate 0,1% (v/v) vào 5ml TSB thêm 6h, để chắn vi khuẩn đủ khỏe để tiến hành thí nghiệm Thu thập tế bào vi khuẩn ly tâm 7000 x g, đổ bỏ môi trường, rửa tế bào vi khuẩn thu lần PBS Mỗi lần rửa ly tâm 7000 x g, đổ bỏ môi trường Cho vi khuẩn thu sang tube 1,5ml, thêm 1ml PBS, trộn đều, sau đo mật độ quang bước sóng 600nm để xác định số lượng tương đối tế bào vi khuẩn 1ml PBS Pha loãng vi khuẩn hiệu chỉnh số lượng vi khuẩn mong muốn để tiến hành lây nhiễm vào tế bào ký chủ, cách đo mật độ quang (OD600) Mối tương quan số lượng vi khuẩn 92 mật độ quang OD600 tiến hành qua thí nghiệm sau Cắn tế bào vi khuẩn sau ly tâm 7000 x g, đổ bỏ PBS, thêm vào 1ml PBS trộn đều, pha loãng dần theo tỷ lệ 1:10; 1:100; 1:1000; 1: 10 000; 1: 100 000; 1: 1000 000 1: 1000 000 đo mật độ quang nồng độ Tiến hành song song, nồng độ cấy đĩa thạch TSA (Tryptic Soy Agar) theo kỹ thuật drop plate technique, ủ tủ ấm 37oC, 48 Đếm số khuẩn lạc CFU (colony forming unit) nhân với hệ số pha loãng Như CFU 1ml tỷ lệ với OD600 đo Nuôi cấy tế bào U937 RAW 264.7 Dòng tế bào người monocyte-like U937 dòng tế bào chuột monocyte-like RAW 264.7 mua từ ATCC (American tissue cell culture) Chuẩn bị mơi trường RPMI: gói RPMI 1640 Gibco (Invitrogen) (Roswell Park Memorial Institute medium)pha 1L nước cất tinh cấp độ 3B (3B grade), bổ sung 2mM Glutamine, 25mM Hepes buffer 2g NaHCO3, điều chỉnh pH 7,4 Cho vào môi trường nuôi cấy 1% (v/v) penstep (Penicillin + streptomycin 15140 Gibco (Invitrogen)) để tránh tế bào bị lây nhiễm Bổ sung FBS (Fetal bovine serum) 10% (v/v) Hòa tan thành phần, sau lọc qua filter 0,02nmpore Lấy 10ml RPMI, để tủ ấm 37oC 24-48h, kiểm tra xem có bị nhiễm khuẩn khơng cách quan sát độ đục cấy thạch agar, trước sử dụng Chuẩn bị tế bào: vial U937 lấy từ nito lỏng, rã đông nhanh phút 37oC (water bath), chuyển sang 10ml RPMI làm ấm 37oC vòng 15 phút, lắc đều, quay ly tâm lạnh 2000 vòng/phút, phút 4oC Thu cặn lắng, rửa lại 1-2 lần 10ml RPMI Lần rửa cuối cùng, thu cặn lắng (tế bào), trộn tế bào 1ml RPMI Đếm tế bào phương pháp trypan blue hematocytometer Điều chỉnh số tế bào thích hợp đưa vào nuối cấy 20ml RPMI flask T75 đặt vào tủ ấm 37oC, 5% CO2 Theo dõi tình trạng tế bào 12 Thay Chuyên Đề Nội Khoa Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 21 * Số * 2017 môi trường ngày, cắt giảm số tế bào sau 24h Làm thí nghiệm tính thời gian số tế bào tăng sinh gấp đôi, ghi nhận Chuẩn bị môi trường DMEM: lọ Hyclone classical DMEM chứa nồng độ glucose caodạng bột khô 67g pha 1L DMEM 5X Bổ sung thêm sodium bicarbonate 7,5g Từ stock 5X pha 1L DMEM 1X sẵn sàng sử dụng Chỉnh pH 7.0 – 7.4 Lọc filter cup 0,02nm tủ hood Kiểm tra tránh nhiễm khuẩn Từ DMEM 1X pha mơi trường hồn chỉnh để sử dụng (cho thêm vào 1L DMEM 1X: 1% (v/v) L-glutamine, 10% (v/v) FBS (Hyclone), ý đổi DMEM FBS hãng khác Vial lưu trữ nito lỏng, rã đông nhanh phút tủ ấm 37oC water bath, chuyển tế bào qua 10ml DMEM, lắc rửa, quay ly tâm lạnh 2000 vòng/phút phút 4oC, thu cặn lắng (tế bào), đổ bỏ môi trường Pha loãng tế bào 1ml DMEM, đếm tế bào phương pháp trypan blue hematocytometer Nuôi cấy 1x 104 tế bào với 5ml DMEM hoàn chỉnh flask T25 Quy trình lây nhiễm Sau tế bào RAW 264.7 nuôi cấy khoảng 10canh cấy (passage) T25 flask, tế bào thu hoạch scraper, quay ly tâm lạnh, lấy tế bào, rửa đếm Tế bào RAW 264.7 chuyển qua đĩa cấy tế bào 12 giếng giếng x 104 cells Đến ngày làm lây nhiễm lớp tế bào bề mặt đĩa rửa lần dung dịch PBS (phosphate buffered saline) pH7.4, trước cho 2ml DMEM hoàn chỉnh Song song vi khuẩn B pseudomallei thu hoạch ly tâm lạnh, rửa, đo mật độ quang OD600 hiệu chỉnh số vi khuẩn cho thích hợp Quá trình lây nhiễm bắt đầu cho vi khuẩn B pseudomallei vào giếng có sẵn tế bào RAW 264.7 vớilần lượt MOI (multiplicity of infection) 1, 10 100 Lắc nhẹ để phân bổ vi khuẩn cho tế bào Trong 12 giếng, giếng có tế bào RAW 264.7 (mock) để kiểm sốt lây nhiễm chéo Để đĩa nuôi cấy 12 giếng vào tủ Tiêu Hóa Nghiên cứu Y học ấm 5% CO2, 37oC để vi khuẩn xâm nhập vào tế bào Sau lớp tế bào RAW 264.7 bị vi khẩn xâm nhập, rửa lần với PBS để loại bỏ hết vi khuẩn bên chưa vào tế bào Mỗi giếng đĩa nuôi cấy tế bào 12 giếng cho vào 2ml DMEM chứa Kanamycin 250 µg/ml, ủ tiếp tủ ấm 5% CO2 để loại bỏ hoàn toàn vi khuẩn bên tế bào Sau 2h, đổ bỏ DMEM, rửa lần với PBS Cho vào giếng 2ml DMEM chứa Kanamycin 50µg/ml nuôi cấy RAW 264.7 bị lây nhiễm thời điểm kết thúc, thu mẫu tế bào sau giờ, sau lây nhiễm Đối với đĩa 12 giếng nuôi cấy U937 tiến hành tương tự Để kiểm tra xem Kanamycin 250 µg/ml có loại bỏ hết vi khuẩn ngồi tế bào RAW 264.7 U937 hay không, trước hút bỏ môi trường, mẫu môi trường cấy đĩa thạch agar để tìm khuẩn lạc vi khuẩn Thí nghiệm lây nhiễm làm lại lần độc lập, lần làm lặp lại giếng MOI để lấy số liệu thống kê Tại thời điểm thu nhận mẫu tế bào giờ, giờ, sau lây nhiễm, môi trường hút bỏ, rửa tế bào RAW 264.7 U937 lần với PBS ly giải tế bào 200µl 0.1% Triton X-100 (Sigma Chemicals, Co) để giải phóng vi khuẩn Để đánh giá mức độ xâm lấn, dịch ly giải tế bào thời điểm giờ, giờ, giờở MOI 2, 10, 20 pha loãng 1:10; 1:100; 1: 1000; 1: 10 000; 1: 100 000 1: 000 000 cấy đĩa thạch TSA đếm số khuẩn lạc CFU sau 48 ủ 37oC tủ ấm Song song với thí nghiệm xác định khả xâm lấn vi khuẩn, thí nghiệm lây nhiễm tiến hành đồng thời đĩa nuôi cấy tế bào 12 giếng khác để quan sát mức độ tạo thành tế bào đa nhân tế bào RAW 264.7 U937 bị nhiễm B pseudomallei Tại thời điểm sau lây nhiễm 0h, 2h, 4h mẫu tế bào thu thập, hút bỏ môi trường DMEM, rửa lần 93 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 21 * Số * 2017 với PBS, nhuộm Giemsa, chụp hình, đếm tế bào đa nhân, thống kê số liệu KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Tại thời điểm sau lây nhiễm giờ, giờ, tế bào RAW 264.7 rửa lần với PBS, để khơ nhiệt độ phòng nhuộm với Giemsa, để quan sát tạo thành tế bào đa nhân Sau lây nhiễm số tế bào đa nhân quan sát nhỏ sau lây nhiễm số tế bào đa nhân tăng lên kích thước số lượng (Hình 2B) B pseudomallei kích thích tạo thành tế bào đa nhân RAW 264.7 khơng kích thích tạo tế bào đa nhân (MNGC) U937 Hình RAW 264.7 mock (A) RAW 264.7 lây nhiễm với B.speudomallei (B,C) Hình Các tế bào U937 mock (A) U937 lây nhiễm với (B), khơng có hình thành tế bào lớn đa nhân Tuỳ thuộc vào MOI (lượng vi khuẩn dùng để tiến hành thí nghiệm lây nhiễm so với số tế bào ký chủ)và tùy thuộc vào thời gian mà hình thành tế bào đa nhân nhiều hay Để quan sát kỹ tế bào lớn đa nhân, thí nghiệm lặp lại làm thêm giếng để tới 16 thu thập tế bào, kết cho thấyởthời điểm 16 sau lây nhiễm, tế bào 94 lớn đa nhân đạt kích thước tối đa, sau tế bào bị ly giải, giải phóng B pseudomallei (Hình 1C) Cùng thời điểm 4giờ sau lây nhiễm tạo thành tế bào lớn đa nhân RAW264.7, lây nhiễm B pseudomalli với MOI 20, thấy rõ lớn kích thước so với tế bào RAW264.7 lây nhiễm B pseudomallei MOI Khi để lâu hơn, quan Chuyên Đề Nội Khoa Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 21 * Số * 2017 sát thấy ly giải tế bào lớn đa nhân Điều phù hợp với kết nghiên cứu khác cho khả kích thích tạo tế bào lớn đa nhân độc tính B pseudomallei mà khơng quan sát thấy vi khuẩn Gram- âm khác Từ kết thí nghiệm đưa nhận xét thời gian kéo dài thí nghiệm lây nhiễm khơng nên q 16giờ MOI 2, 10, 20 Nếu giảm MOI xuống 0.1 kéo dài thời gian lây nhiễm Hoặc rút ngắn thời gian thí nghiệm lây nhiễm với MOI 50 100 để đảm bảo kết có độ tin cậy cao, tế bào lớn đa nhân bị ly giải phóng thích B pseudomallei tiếp tục lây nhiễm sang tế bào bên cạnh, không so sánh với số vi khuẩn đưa vào bắt đầu trình lây nhiễm.Đối với thí nghiệm dòng tế bào U937 người, quan sát thấy rõ B pseudomallei xâm nhập vào tế bào, tăng sinh nội bào, không quan sát thấy tạo thành tế bào lớn đa nhân kính hiển vi Kéo dài thí nghiệm lây nhiễm lâu hơn, thấy ly giải tế bào U937 số vi khuẩn tăng sinh đủ nhiều Điều phù hợp với báo cáo quốc tế giải thích B pseudomallei tồn thể người tới 60 năm phát bệnh, có hội Khả xâm lấn tồn nội bào B pseudomallei báo cáo từ năm 1990 Những năm gần nghiên cứu ảnh hưởng yếu tố vi khuẩn tới hình thành tế bào lớn đa nhân đặc biệt quan tâm(2) Tuy nhiên dùng dòng tế bào làm mơ hình lây nhiễm hiệu để khảo sát hình thành tế bào lớn đa nhân tranh cãi Từ quan sát thí nghiệm này, đưa kết luận, hình thành tế bào lớn đa nhân dễ dàng dòng tế bào kết dính (RAW 264.7 tế bào bán kết dính, U937 tế bào khơng kết dính) Tiêu Hóa Nghiên cứu Y học Khả xâm lấn vi khuẩn B pseudomallei vào RAW 264.7 cao vào U937 Tại thời điểm sau lây nhiễm giờ, giờ, tế bào RAW 264.7 U937 thu thập Tế bào ly giải 200µl 0,1% Triton X-100 (Sigma Chemicals, Co) để giải phóng vi khuẩn Dịch ly giải pha loãngdần 10, 100, 1000, 10 000 lần nuôi cấy đĩa thạch TSA 48 CFU đếm tính tốn dựa phần mềm Sigma stat với p 0.01, kết biểu diễn đồ thịvà bảng (hình bảng 1) Hình Sự xâm lấn B.pseudomallei MOI khác vào RAW 264.7 U937 Như với MOI khác số vi khuẩn vào tế bào chủ khác nhau, nhiên theo tỷ lệ khoảng 4.5% số vi khuẩn lây nhiễm ban đầu vào RAW 264.7 0,1% B pseudomallei vào U937 sau 4h lây nhiễm (Bảng 1) Khả xâm lấn B pseudomallei vào RAW 264.7 (4,5%) cao vào U937 (0,1%) (Hình 3) Cả hai mơ hình tế bào thích hợp cho thí nghiệm lây nhiễm Tuy nhiên, để quan sát đếm tế bào lớn đa nhân mơ hình tế bào RAW 264.7 thích hợp U937 Tế bào U937 kích hoạt PMAphorbol 12 – myristate 13-acetate để bám dính vào đĩa ni cấy, trước làm lây nhiễm, khảo sát hình thành tế bào đa nhân dòng tế bào cần phải nghiên cứu thêm 95 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 21 * Số * 2017 Bảng So sánh khả lây nhiễm B.pseudomallei MOI khác vào RAW 264.7 U937 người.Tuy nhiên khả kích thích tạo thành tế bào đa nhân, cho tính độc B pseudomallei, lại quan sát dòng tế bào RAW 264.7 Vì tùy mục đích nghiên cứu lựa chọn dòng tế bào khác để làm mơ hình lây nhiễm Mơ hình lây nhiễm tác giả sử dụng để khảo sát vai trò yếu tố phiên mã RpoS RpoN2 B pseudomallei điều hòa biểu gene gây bệnh dùng để so sánh khả lây nhiễm vi khuẩn vào dòng tế bào gan người Cám ơn: Trân trọng cám ơn GS.TS Sumalee Tungpradabkul, GS.TS Ratchanee đại học Mahidol, Thái lan cung cấp chủng vi khuẩn B pseudomallei giúp đỡ hoàn thành nghiên cứu TÀI LIỆU THAM KHẢO KẾT LUẬN Melioidosis bệnh dịch địa phương, thường gặp vùng nhiệt đới, gây nên vi khuẩn Gram-âm B pseudomallei CDC Hoa kỳ xếp vi khuẩn vào loại B tác nhân sinh học nguy hiểm Tuy nhiên chưa cóvaccine cho bệnh này, biểu bệnh khác bệnh nhân điều trị khó khăn, vi khuẩn kháng với hầu hết loại kháng sinh thông thường Ngay sau điều trị kháng sinh thành cơng, tỷ lệ tái phát 30-40% Vì nghiên cứu sinh bệnh học B pseudomallei quan tâm lớn nhà khoa học Ở Việt nam có ghi nhận ca bệnh melioidosis, nhiên nghiên cứu công bốcủa Việt nam lại vô hạn chế Nghiên cứu nhằm thiết lập mơ hình lây nhiễm hiệu quả, thực phòng thí nghiệm, giúp ích cách thiết thực cho nghiên cứu sinh bệnh học B pseudomallei Nghiên cứu cho thấy B pseudomallei lây nhiễm dòng tế bào RAW 264.7 chuột U937 96 Cheng, AC, and Currie BJ (2005), Melioidosis: epidemiology, pathophysiology, and management Clin Microbiol Rev, 18(2): p 383-416 Currie B (1995), Pseudomonas pseudomallei-insulin interaction Infection and immunity, 63(9): p 3745 Dance D (2014), Treatment and prophylaxis of melioidosis International journal of antimicrobial agents, 43(4): p 310-318 Holden MT, et al (2014), Genomic plasticity of the causative agent of melioidosis, Burkholderia pseudomallei Proc Natl Acad Sci U S A, 101(39): p 14240-5 Ngauy V, et al (2005), Cutaneous melioidosis in a man who was taken as a prisoner of war by the Japanese during World War II Journal of Clinical Microbiology, 43(2): p 970-972 Parry C.M., et al (1999), Melioidosis in Southern Vietnam: clinical surveillance and environmental sampling Clinical Infectious Diseases, 29(5): p1323-1326 Phuong, DM., et al (2008),Clinical and microbiological features of melioidosis in northern Vietnam Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene, 102 (Supplement 1): pS30-S36 Simpson AJ and Wuthiekanun V (2005), Interaction of insulin with Burkholderia pseudomallei may be caused by a preservative Journal of clinical pathology, 53(2): p 159-160 Wiersinga WJ, Currie BJ, and Peacock SJ (2012), Melioidosis N Engl J Med, 367(11): p 1035-44 Ngày nhận báo: 18/11/2016 Ngày phản biện nhận xét báo: 01/12/2016 Ngày báo đăng: 01/03/2017 Chuyên Đề Nội Khoa ... lập mơ hình lây nhiễm B .pseudomallei vớidòng tế bào U937 người dòng tế bào RAW 264.7 chuột (tế bào monocyte- like, tiền thân đại thực bào) , so sánh khả xâm nhập vi khuẩn vào loại tế bào; (2) nghiên... thích tạo tế bào đa nhân (MNGC) U937 Hình RAW 264.7 mock (A) RAW 264.7 lây nhiễm với B.speudomallei (B,C) Hình Các tế bào U937 mock (A) U937 lây nhiễm với (B), khơng có hình thành tế bào lớn đa... forming unit) nhân với hệ số pha loãng Như CFU 1ml tỷ lệ với OD600 đo Nuôi cấy tế bào U937 RAW 264.7 Dòng tế bào người monocyte- like U937 dòng tế bào chuột monocyte- like RAW 264.7 mua từ ATCC