Đánh giá trữ lượng và hoạt tính sinh học của cây xạ đen ((Ehretia asperula Zoll. & Moritzi) tại tỉnh Hòa Bình

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT - NGUYỄN THỊ HẰNG ĐÁNH GIÁ TRỮ LƯỢNG VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÂY XẠ ĐEN (Ehretia asperula Zoll & Moritzi) TẠI TỈNH HỊA BÌNH LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC Hà Nội, 2018 VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT - NGUYỄN THỊ HẰNG ĐÁNH GIÁ TRỮ LƯỢNG VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÂY XẠ ĐEN (Ehretia asperula Zoll & Moritzi) TẠI TỈNH HỊA BÌNH Chun ngành: SINH HỌC THỰC NGHIỆM Mã số: 42 01 14 LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS TRẦN THỊ HỒNG HÀ Hà Nội, 2018 LỜI CẢM ƠN Trước hết, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới TS Trần Thị Hồng Hà, phòng Sinh học thực nghiệm – Viện Hóa học Hợp chất thiên nhiên,Viện Hàn lâm Khoa Học Công nghệ Việt Nam tận tình bảo, thúc giục hướng dẫn suốt trình học tập thực nghiên cứu Tôi xin cảm ơn Lãnh đạo Viện Di truyền Nông Nghiệp – Trung tâm Nghiên cứu Phát triển Nấm bạn đồng nghiệp, phòng Chọn tạo giống Công nghệ sản xuất Nấm tạo điều kiện giúp đỡ tơi suốt q trình thực hiện, bảo vệ luận văn Tôi xin cảm ơn Lãnh đạo, anh chị đồng nghiệp Bộ môn Vi Sinh vật – Viện Nơng Hóa Thổ Nhưỡng tạo điều kiện giúp đỡ tơi suốt q trình học tập Tơi xin chân thành cảm ơn Ban Lãnh đạo, thầy cô giáo Viện Sinh thái Tài nguyên Sinh vật, cán nghiên cứu phịng Hoạt tính Sinh học - Viện Hóa sinh biển, phịng Sinh học thực nghiệm – Viện Hóa học Hợp chất thiên nhiên, Viện Hàn lâm khoa học Công nghệ Việt Nam nhiệt tình giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi để tơi hồn thành luận văn Tơi xin cảm ơn chị Vũ Thị Nguyệt – Phòng Thủy sinh học môi trường, Viện Công nghệ môi trường, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam tận tình hướng dẫn, bảo tơi suốt q trình làm luận văn Luận văn tiến hành hỗ trợ đề tài: “Nghiên cứu thành phần hóa học, đánh giá hoạt tính sinh học số hợp chất phân lập từ xạ đen tỉnh Hồ Bình Thử nghiệm tạo chế phẩm làm thực phẩm chức từ cao chiết tiềm năng”, GS TS Đặng Đình Kim, Viện Cơng nghệ mơi trường, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam làm chủ nhiệm Cuối xin cảm ơn gia đình thân yêu, bạn bè – người ln bên tơi, ln động viên, khích lệ chỗ dựa vững cho suốt trình học tập nghiên cứu Hà Nội, ngày 01 tháng 09 năm 2018 Học viên Nguyễn Thị Hằng i MỤC LỤC Lời cảm ơn I Ký hiệu viết tắt VI Mở đầu I.TỔNG QUAN 1.1.Đặc điểm phân loại 1.1.1.Chi Cườm rụng (Ehretia P Browne) 1.1.2.Cây xạ đen Ehretia asperula Zoll & Moritzi 1.2.Tình hình nghiên cứu xạ đen Việt Nam giới 13 1.2.1.Tình hình nghiên cứu xạ đen Việt Nam 13 1.2.2.Tình hình nghiên cứu xạ đen giới 17 II.VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.1.Vật liệu nghiên cứu 21 2.2.Thiết bị máy móc 22 2.3 Phương pháp nghiên cứu 23 2.3.1 Phương pháp điều tra 23 2.3.2 Phương pháp nghiên cứu thực vật 23 2.3.3 Phương pháp xử lý mẫu 24 2.3.4 Phương pháp thử nghiệm hoạt tính sinh học 26 III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32 3.1 Giám định loài xạ đen Hịa Bình 32 3.2 Đánh giá phân bố trữ lượng loài xạ đen Hịa Bình 34 3.2.1 Đặc điểm phân bố địa lý 34 3.2.2 Trữ lượng xạ đen Hịa Bình 35 3.3 Kết trình chiết tách 39 3.3.1 Điều chế loại cao 39 3.3.2 Phân lập chất từ cặn etyl axetat phận thân xạ đen 39 3.4 Hoạt tính sinh học xạ đen 43 3.4.1 Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định 43 3.4.2 Hoạt tính chống oxy hóa 46 ii 3.4.3 Hoạt tính gây độc dòng tế bào ung thư 49 IV KẾT LUẬN 58 V KIẾN NGHỊ 59 TÀI LIỆU THAM KHẢO 60 PHỤ LỤC 68 KHĨA PHÂN LOẠI TỚI LỒI 70 PHIẾU ĐIỀU TRA THỰC TRẠNG CÂY XẠ ĐEN TẠI TỈNH HỊA BÌNH 72 iii DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Kết phân bố xạ đen khu vực điều tra Bảng 1.2 Hoạt tính sinh học cao chiết xạ đen vi khuẩn 16 Bảng 3.1 Trữ lượng xạ đen tai tỉnh Hòa Bình năm 2016 35 Bảng 3.2 Khối lượng cao chiết tổng, cao chiết phân đoạn phận xạ đen Hịa Bình 39 bảng 3.3 Cấu trúc hóa học hợp ET1-ET6 42 bảng 3.4 Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định cặn chiết tổng chiết tách từ phận xạ đen 44 Bảng 3.5 Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định cao chiết phân đoạn chiết tách từ phận xạ đen……………………………………… 45 bảng 3.6 Hoạt tính chống ơxy hố cao chiết tổng xạ đen 47 bảng 3.8 Hoạt tính gây độc tế bào cao chiết tổng xạ đen 50 bảng 3.9 Kết xác định giá trị ic50 cao chiết tổng xạ đen 50 bảng 10 Hoạt tính gây độc tế bào cao chiết phân đoạn xạ đen 52 bảng 11 Kết xác định giá trị ic50 cao chiết phân đoạn xạ đen 53 bảng 3.12 Hoạt tính gây độc tế bào chất tinh khiết phân lập 55 bảng 3.13 Hoạt tính gây độc tế bào chất tinh khiết 55 iv DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cấu trúc số hợp chất 17 Hình 1.2 Cấu trúc 2D acid rosmarinic 19 Hình 1.3 Cấu trúc 3D acid rosmarinic 19 Hình 1.4 cấu trúc 2D phân tử amyrin 20 Hình 2.4: Sơ đồ tạo cao chiết tổng quát 25 Hình 2.5: Sơ đồ phân lập chất từ cao etoac thân xạ đen 26 Hình 3.1 Tiêu khô lá, cành xạ đen 34 Hình 3.2 Tiêu khô hoa xạ đen 34 Hình 3.3 Hoa xạ đen 34 Hình 3.4 Quả xạ đen 34 Hình 3.5 Bản đồ xạ đen ni trồng tỉnh Hịa Bình…………………38 v KÝ HIỆU VIẾT TẮT ký hiệu 13 C-NMR Tiếng Anh Tiếng Việt Carbon (13) Nuclear Magnetic Phổ cộng hưởng từ hạt nhân Resonance carbon (13) Hydro (1) Nuclear Magnetic Phổ cộng hưởng từ hạt nhân Resonance proton (1) ppm Part per million Một phần triệu DMEM Dulbecco’s Medium MEME Minimum Essential Medium with Eagle’s salt PSF Penicillin- Streptomycin sulfate – Fungizone NAA Non-Essential Amino Acids BCS Bovine Calf Serum DMSO Dimethyl Sulfoside TCA Trichloro Acetic acid PBS Phosphate Buffered Saline SRB Sulfo Rhodamine B Hep-G2 Human hepatocellular carcinoma Ung thư gan LU-1 Human lung adenocarcinoma Ung thư phổi MCF-7 Human breast adenocarcinoma Ung thư vú HeLa HeLa cervical cancer cells Tế bào ung thư cổ tử cung HeLa H-NMR Vero Modified Eagle Tế bào thận khỉ vi D Dichloromethane H n-Hexane M Methanol EtOAc Ethyl acetate A Acetone W Water Nước XĐ Xạ đen VSVKĐ Vi sinh vật kiểm định VQG Vườn quốc gia viii MỞ ĐẦU Việt Nam quốc gia nằm khu vực nhiệt đới, có nhiều điều kiện thuận lợi cho sinh vật phát triển Theo thống kê "Tiếp cận nguồn gen chia sẻ lợi ích" (của Tổ chức Bảo tồn Thiên nhiên Thế giới - IUCN), Việt Nam có gần 12.000 lồi thực vật bậc cao có mạch thuộc 2.256 chi, 305 họ (chiếm 4% tổng số loài, 15% tổng số chi, 57% tổng số họ thực vật giới) Trong số đó, nguồn tài nguyên có tiềm sử dụng y học chiếm khoảng 30% Theo Danh lục Cây thuốc Việt Nam Viện Dược liệu (2016) điều tra nguồn tài nguyên thuốc cho thấy Việt Nam có tổng số 5.117 lồi lồi, thuộc 1.823 chi, 360 họ ngành thực vật bậc cao có mạch, với số taxon thuộc nhóm rêu, tảo nấm lớn, thuộc nhóm thực vật bậc cao có mạch có tới 5.000 lồi Theo thơng tư số 40/2013/TT-BYT Bộ Y tế có 334 lồi thuộc danh mục thuốc thiết yếu, thuốc đơng y, thuốc từ dược liệu Như vậy, việc sử dụng dược phẩm có nguồn gốc thiên nhiên ngày quan tâm Chi Ehretia P Br (họ Vòi voi, Boraginaceae) chi thực vật bao gồm có lồi, đó, có lồi người dân dùng làm thuốc E acuminata R Br (cườm rụng nhọn) E asperula (dót, xạ đen) để giải độc mát gan, tăng cường chức gan, hỗ trợ điều trị viêm gan, vàng da; điều trị u bướu, mụn nhọt, ung thũng; làm thuốc chống viêm kháng khuẩn cho bệnh nhân mắc bệnh viêm nhiễm Cây xạ đen E asperula thuốc thuộc nhóm nhiệt giải độc có tên khoa học vị thuốc Herba Ehretiae asperulae (thông tư số 40/2013/TT-BYT Bộ Y tế) Tuy nhiên, đến thời điểm nghiên cứu sâu chi Ehretia hay xạ đen E asperula tỉnh Hịa Bình nói riêng mức hạn chế Các cơng trình nghiên cứu thường giai đoạn xác định tên loài, bước đầu xác định số hợp chất hóa học thứ cấp Những nghiên cứu khác đánh giá trạng phân bố trữ lượng, đặc tính sinh học ứng dụng nghiên cứu chữa bệnh cịn khơng ... LƯỢNG VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÂY XẠ ĐEN (Ehretia asperula Zoll & Moritzi) TẠI TỈNH HỊA BÌNH Mục tiêu luận văn giám định lại tên loài xạ đen đồng thời đánh giá tình hình thực trạng xạ đen tỉnh. .. HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT - NGUYỄN THỊ HẰNG ĐÁNH GIÁ TRỮ LƯỢNG VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÂY XẠ ĐEN (Ehretia asperula Zoll & Moritzi) TẠI TỈNH... TRẠNG CÂY XẠ ĐEN TẠI TỈNH HÒA BÌNH 72 iii DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Kết phân bố xạ đen khu vực điều tra Bảng 1.2 Hoạt tính sinh học cao chiết xạ đen vi khuẩn 16 Bảng 3.1 Trữ lượng xạ đen tai tỉnh