Nghiên cứu hoạt tính sinh học của loài adinandra megaphylla

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM Thongde LOUNNESEKHAMTHONG NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA LỒI Adinandra megaphylla LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC THÁI NGUYÊN - 2021 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM Thongde LOUNNESEKHAMTHONG NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA LỒI Adinandra megaphylla Ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 8420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Hữu Quân THÁI NGUYÊN - 2021 LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu tơi Mọi trích dẫn luận văn ghi rõ nguồn gốc Các số liệu, kết nghiên cứu luận văn trung thực chưa công bố Thái Nguyên, tháng năm 2021 Tác giả luận văn Thongde LOUNNESEKHAMTHONG i LỜI CẢM ƠN Lời em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Hữu Quân, giảng viên Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên tận tình hướng dẫn, bảo tạo điều kiện giúp đỡ em q trình nghiên cứu hồn thành luận văn Em xin chân thành cảm ơn giúp đỡ Trần Thị Hồng, kỹ thuật viên Phịng thí nghiệm Công nghệ tế bào thực vật, cô Cao Thị Phương Thảo, kỹ thuật viên Phịng thí nghiệm Thực vật học thuộc Khoa Sinh học Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên tạo điều kiện giúp em suốt trình nghiên cứu Em xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo thuộc Khoa Sinh học thầy cô giáo thuộc phận sau đại học, Phòng Đào tạo, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên tạo điều kiện thuận lợi cho em trình học tập hoàn thành luận văn Em xin bày tỏ lời biết ơn đến gia đình, bạn bè động viên, khuyến khích giúp đỡ em tiến trình học tập hoàn thành luận văn Em xin cảm ơn h trợ inh ph từ đề tài KH&CN Quỹ Nafosted “Phân tích thành phần hóa học tìm kiếm hợp chất thứ cấp có hoạt tính kháng ung thư háng viêm từ số loài thực vật thuộc chi Dương đồng (Adinandra) Việt Nam” mã số 106.02-2018.338 Thái Nguyên, tháng năm 2021 Tác giả luận văn Thongde LOUNNESEKHAMTHONG ii MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục chữ viết tắt iv Danh mục bảng v Danh mục hình vi MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề Mục tiêu nghiên cứu Nội dung nghiên cứu Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chung thực vật thuộc chi Dương đồng (Adinandra) 1.2 Tình hình nghiên cứu chi Dương đồng (Adinandra) 1.2.1 Ở Việt Nam 1.2.2 Trên giới 1.3 Nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn thuốc Chƣơng 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 10 2.1 Vật liệu, địa điểm thời gian nghiên cứu 10 2.1.1 Vật liệu môi trường nuôi cấy 10 2.1.2 Hóa chất, thiết bị 11 2.1.3 Địa điểm thời gian nghiên cứu 13 2.2 Phương pháp nghiên cứu 13 2.2.1 Phương pháp điều chế mẫu thử hoạt tính 13 2.2.2 Phương pháp định tính cao chiết 14 2.2.3 Phương pháp phân lập hợp chất 16 2.2.4 Phương pháp thử hoạt tính kháng khuẩn cao chiết 17 2.2.5 Phương pháp xác định khả chống oxy hóa DPPH 17 iii 2.2.6 Phương pháp xác định t nh độc tế bào ung thư nuôi cấy dạng đơn lớp 18 Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 19 3.1 Khảo sát hợp chất có cao chiết từ thân lồi A megaphylla 19 3.1.1 Định tính polyphenol 19 3.3.2 Định tính tanin 19 3.3.3 Định tính flavonoid 20 3.3.4 Định tính coumarin 20 3.2 Hoạt tính kháng khuẩn cao chiết từ thân lồi A megaphylla 21 3.3 Hoạt tính chống oxi hóa cao chiết từ thân loài A megaphylla 23 3.4 Hoạt tính ức chế dịng tế bào ung thư cao ethanol từ thân loài A megaphylla điều kiện in vitro 24 3.3.2 Phân lập hợp chất từ cặn của loài Adinandra megaphylla 25 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 35 TÀI LIỆU THAM KHẢO 36 iv DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Nghĩa tiếng việt Tên tiếng Anh DMSO Dimethyl sulfoxide DPPH 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl EtOH Ethanol Hep G2 Hepatocellular human HPLC High Performance Chromatography carcinoma Ung thư gan người Liquid Phương pháp sắc ý lỏng hiệu cao ISSR Inter Simple Sequence Repea Đánh giá sai khác di truyền thực vật LB Luria Bertani Môi trường nuôi cấy chủng vi sinh vật MCF-7 Ardeno carcinoma Ung thư vú MeOH Methanol MIC Minimalinhibitory concentration Nồng độ tối thiểu ức chế MS Mass spectrometry Phương pháp hối phổ NMR Nuclear Magnetic Resonance Cộng hưởng từ hạt nhân OD Mật độ quang học TTC Triphenyl tetrazolium chloride Chỉ thị màu TLC Thin layer chromatography iv Sắc ký lớp mỏng DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Danh sách loài thuộc chi Adinandra phân bố Việt Nam Bảng 1.2 Tác dụng chống ung thư dịch chiết hợp chất phenolic tự dòng tế bào Hep-G2 MCF-7 Bảng 2.1 Các hóa chất sử dụng thí nghiệm 11 Bảng 2.2 Thiết bị sử dụng thí nghiệm 12 Bảng 3.1 Hoạt tính kháng khuẩn cao chiết từ A megaphylla 22 Bảng 3.2 Hoạt tính chống oxy hóa cao chiết từ thân loài A megphylla 24 Bảng 3.3 Hoạt tính ức chế dịng tế bào ung thư cao chiết từ thân loài A megaphylla 25 Bảng 3.4 Cấu trúc hóa học hợp chất phân lập từ thân loài A megaphylla 28 v DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 2.1 Đặc điểm hình thái lồi A megaphylla 10 Hình 2.2 Một số thiết bị sử dụng thí nghiệm 12 Hình 2.3 Quy trình điều chế mẫu cao chiết từ thân cành loài A.megaphylla 14 Hình 3.1 Định tính polyphenol cao ethanol từ thân loài A Megaphylla A Phản ứng với muối sắt (III); B Phản ứng với dung dịch H2SO4 đặc 19 Hình 3.2 Định tính tanin flavonoid cao ethanol từ thân lồi A Megaphylla A Định tính tanin; B Định tính flavonoid (B) 20 Hình 3.3 Định t nh coumarin cao ethanol từ thân loài A Megaphylla A Phản ứng với NaOH (A); B Phản ứng với HCl đặc 21 Hình 3.4 Hoạt tính kháng vi khuẩn B subtilis (A), S marcescens (B), S lutea (C), L plantarum (D) E coli (E) cao chiết từ loài A Megaphylla Giếng ĐC đĩa thạch chứa dung dịch đối chiếu DMSO 22 Hình 3.5 Màu sắc mẫu khử gốc tự DPPH trước hi đo cao ethanol 24 Hình 3.6 Phân lập cặn chiết ethyl acetate từ thân loài A megaphylla 27 vi MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Việt Nam quốc gia có nguồn tài nguyên thực vật phong phú, nơi có tiềm cao lồi dược liệu Tuy nhiên, có nhiều lồi chưa nghiên cứu tầm quan trọng giá trị làm thuốc chúng (đặc biệt loài thuộc chi Dương đồng) Ở Việt Nam, chi Dương đồng có khoảng 15 loài, phân bố rải rác khắp nước Loài Adinandra lienii bước đầu nghiên cứu vị trí phân bố địa lý, đặc điểm thực vật học trình tự gen matK, vùng ITS giúp nhận diện loài Ngoài ra, thành phần hóa học hoạt tính kháng khuẩn từ lồi A lienii chứng minh có hoạt tính kháng khuẩn, chống oxi hóa ức chế dòng tế bào ung thư Như vậy, nghiên cứu Việt Nam tập trung chủ yếu loài A lienii phân bố khu vực miền núi phía Bắc Sum lớn hay Hồng đạm sapa, có tên khoa học Adinandra megaphylla Hu, thuộc chi Dương đồng phân bố tỉnh Lào Cai, Việt Nam Hiện nay, cao chiết từ loài Adinandra megaphylla Hu nghiên cứu chứa hợp chất polyphenol, coumarin; đồng thời cao chiết từ lồi A megaphylla Hu có hoạt tính kháng khuẩn, khử gốc tự ức chế số dòng tế bào ung thư vú, ung thư dày ung thư phổi Tuy nhiên, chất có thân lồi Sum lớn chưa nghiên cứu liệu thân loài Sum lớn có hay khơng có hợp chất có khả háng huẩn, chống oxi hóa, ức chế dịng tế bào ung thư có kết có khác so với chất từ hông? Đây ch nh câu hỏi đặt cho nghiên cứu nghiên cứu loài Sum lớn để trả lời câu hỏi Xuất phát từ sở tiến hành thực đề tài: “Nghiên cứu hoạt tính sinh học loài Adinandra megaphylla” Mục tiêu nghiên cứu Xác định hoạt tính sinh học hợp chất thu từ thân cành loài Adinandra megaphylla Phân đoạn E2 (32 g) lấy 1g tinh chế sắc ký cột silica gel pha thường với hệ dung môi rửa giải n-hexane ethyl acetate (2 1) thu phân đoạn E2.1 (0,12 g); E2.2 (0,57 g ); E2.3 (0,14 g) Từ phân đoạn E2.2 (0,57 g) tinh chế tiếp thu hợp chất CT1 (30 mg) Phân đoạn E3 (3,7 g) tinh chế sắc ký cột silica gel pha thường với hệ dung môi rửa giải H E (1 1) thu phân đoạn E3.1 (0,16 g); E3.2 (0,31 g); E3.3 (0,1 g); E3.4(0,37 g); E3.5 (0,54 g) Từ phân đoạn E3.2 (0,31 g) tinh chế tiếp thu hợp chất CT7(12 mg) Từ phân đoạn E3.4 (0,37 g) tinh chế tiếp thu hợp chất CT8 (6 mg) Phân đoạn E4 (3,2 g) tinh chế sắc ký cột silica gel pha thường với hệ dung môi rửa giải CH2Cl2 MeOH (2 0,2) thu phân đoạn E4.1 (0,37 g); E4.2 (0,44 g ); E4.3 (0,85 g);E4.4 (0,1 g); E4.5 (1,15 g) Từ phân đoạn E4.1 (0,37 g) tinh chế tiếp thu hợp chất CT6 (6 mg) Tiếp tục tinh chế phân đoạn E4.3 (0,85 g) qua cột pha đảo với hệ dung môi rửa giải MeOH/H2O (1 1,5) thu hợp chất CT3 (5 mg) Phân đoạn E5 (2,5 g) tinh chế sắc ký cột silica gel pha thường với hệ dung môi rửa giải H/CH2Cl2/Ac (1/1 0,5) thu phân đoạn E5.1 (0,9 g); E5.2 (0,5 g); E5.3 (1,25 g) Từ phân đoạn E5.1 (0,9 g) tinh chế tiếp thu hợp chất CT10 (13 mg) Từ phân đoạn E5.2 (0,5 g) tinh chế tiếp thu hợp chất CT11 (6mg) 26 Hình 3.6 Phân lập cặn chiết ethyl acetate từ thân loài A megaphylla Bằng phương pháp sử dụng nghiên cứu tách chiết hợp chất hóa học, phân lập chất từ thân loài A megaphylla (Bảng 3.4) 27 Bảng 3.4 Cấu trúc hóa học hợp chất phân lập từ thân lồi A megaphylla TT Cấu trúc hóa học TT Cấu trúc hóa học Betulinic acid (CT1) Myrisene (CT6) Galactitol Betulinal (CT7) b-Sitosterol (CT-8) Epicatechin CT3 Các chất phân lập từ thân có đặc điểm sau: Hợp chất Betulinic (CT1) Chất rắn màu trắng Phổ khối ESI-MS m/z 455 [M+H]+ 28 H-NMR (DMSO-d6, 500 MHz) δ (ppm): 4.67 (1H, d, J = 2.0, Ha-29), 4.55 (1H, br s, Hb-29), 4.30 (1H, br s, OH-3), 2.98-2.91 (2H, m, H-3, Hβ-19), 2.21 (1H, td, J = 3.5; 13 Hz, Hβ-13), 2.11-2.08 (1H, m, Hβ-16), 1.80-1.76 (2H, m, Hβ-21, Hβ-22), 1.63 (3H, s, H-30), 0.92 (3H, s, H-27), 0.86 (3H, s, H-23), 0.86 (3H, s, H-25), 0.75 (3H, s, H-26), 0.64 (3H, s, H-24) 13 C-NMR (DMSO-d6, 125 MHz) δ (ppm): 177.2 (C-28), 150.3 (C-20), 109.6 (C-29), 76.8 (C-3), 55.4 (C-17), 54.9 (C-5), 49.9 (C-9), 48.6 (C-18), 46.6 (C19), 42.0 (C14), 40.3 (C-8), 38.5 (C-4), 38.0 (C-1), 37.6 (C-13), 36.7 (C-10), 36.3 (C-22), 33.9 (C-7), 31.7 (C-16), 30.1 (C-21), 29.2 (C-15), 28.1 (C-23), 27.1 (C-2), 25.1 (C-12), 20.5 (C-11), 18.9 (C-30), 18.0 (C-6), 15.9 (C-26), 15.8 (C-24), 15.7 (C-25), 14.4 (C-27) Chất CT1 phân lập từ dịch chiết ethyl acetate dạng tinh thể màu trắng, điểm nóng chảy 295-298 0C Phổ khối ESI-MS cho pic ion giả phân tử proton hóa m/z 457 [M+H]+, gợi ý cho công thức phân tử C30H48O3 (M= 456) Phổ 1H-NMR cho tín hiệu đặc trưng hợp chất triterpene vòng lupane với tín hiệu hai olefinic proton thuộc nhóm CH2=C vị tr δH 4.67 (1H, d, J = 2.0, Ha-29), 4.55 (1H, br s, Hb-29), với tín hiệu nhóm methyl vị tr δH 1.63 (3H, s, H-30), 0.92 (3H, s, H-27), 0.86 (3H, s, H-23), 0.86 (3H, s, H-25), 0.75 (3H, s, H-26), 0.64 (3H, s, H-24) Bên cạnh cịn có tín hiệu nhóm CHOH vị tr δH 2.98-2.91 (1H, m, H-3), tín hiệu nhóm hydroxyl δH 4.30 (1H, br s, OH-3) Phổ 13C-NMR HSQC cho tín hiệu 30 cacbon có nhóm CH3 δC 28.1 (C-23), 18.9 (C-30), 15.9 (C-26), 15.8 (C-24), 15.7 (C-25), 14.4 (C-27); 12 nhóm CH2 có nhóm CH2=C δC 109.6 (C-29); nhóm CH có nhóm CHOH δC 76.8 (C-3) cacbon bậc bốn, trơng có nhóm C=O vị trí 177.2 (C-28) C=CH2 δC 150.3 (C-20) 29 Các kiện phổ 13C-NMR ESI-MS cho phép gợi ý hợp chất triterpene carboxylic acid So sánh số liệu phổ với tài liệu tham khảo betulinic acid thấy phù hợp Hợp chất CT1 xác định betulinic acid [18] Chất Galactitol (CT2) H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ (ppm): 4.39 (2H, d, J = 5.5 Hz, OH), 4.30 (2H, t, J = 5.5 Hz, OH), 4.12 (2H, t, J = 7.0 Hz, OH), 3.60 (2H, m, H-2, H-5), 3.54 (2H, t, J = 9.5 Hz, H-1, H-6), 3.45 (2H, m, H-3, H-4), 3.38 (2H, m, H-1, H-6) 13 C-NMR (125 MHz, DMSO-d6) δ (ppm): 71.3 (C-3, C-4), 69.7 (C-2, C-5), 63.8 (C-1, C-6) Chất CT2 phân lập từ dịch chiết nước dạng chất rắn màu trắng Phổ khối ESI-MS cho pic ion giả phân tử proton hóa m/z 183 [M+H]+, kết hợp với phổ NMR có tín hiệu carbon gợi ý cho cơng thức phân tử C6H14O6 (M= 182) hợp chất hợp chất có cấu trúc đối xứng, tín hiệu NMR tín hiệu kép Phổ 1H-NMR cho tín hiệu hợp chất nhiều nhóm hydroxyl với nhóm hydroxyl 4.39 (2H, d, J = 5.5 Hz, OH), 4.30 (2H, t, J = 5.5 Hz, OH), 4.12 (2H, t, J = 7.0 Hz, OH), cịn có tín hiệu nhóm oxymethin 3.60 (2H, m, H-2, H-5), 3.45 (2H, m, H-3, H-4) nhóm oxymethylene 3.54 (2H, t, J = 9.5 Hz, H-1, H-6) 3.38 (2H, m, H-1, H-6) Phổ 13C-NMR cho tín hiệu cacbon gồm tín hiệu kép 71.3 (C-3, C-4), 69.7 (C-2, C-5), 63.8 (C-1, C-6) Các kiện phổ NMR ESI-MS cho phép xác định hợp chất hexitol đối xứng So sánh số liệu phổ với tài liệu tham khảo galactitol thấy phù hợp Hợp chất CT2 xác định galactitol [25] 30 Chất Epicatechin (CT3) Chất rắn màu trắng, [α]20D -70 (c 0,20, MeOH) ESI-MS (m/z): 291 [M+H]+ H-NMR (500 MHz, CD3OD) δ (ppm): 6,99 (1H, d, J = 1,5 Hz, H-2′), 6,82 (1H, dd, J = 1,5, 8,0 Hz, H-6′), 6,78 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-5′), 5,96 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-8), 5,94 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-6), 4,83 (1H, br s, H-2), 4,19 (1H, m, H-3), 2,88 (1H, dd, J = 14,0, 4,0 Hz, H-4a), 2,75 (1H, dd, J = 14,0, 2,5 Hz, H4b) 13 C-NMR (125 MHz, CD3OD) δ (ppm): 158,0 (C-9), 157,7 (C-7), 157,4 (C-5), 145,9 (C-4′), 145,8 (C-3′), 132,3 (C-1′), 119,4 (C-6′), 115,9 (C-5′), 115,3 (C-2′), 100,1 (C-10), 96,4 (C-6), 95,9 (C-8), 79,8 (C-2), 67,5 (C-3), 29,2 (C-4) Chất CT3 thu chất rắn màu trắng Phổ khối ESI-MS cho pic ion giả phân tử m/z [M+H]+ 291 gợi ý CT3 có cơng thức phân tử C15H15O6 (M=290) Phổ 1H NMR CT3 cho tín hiệu đặc trưng hợp chất flavanol với tín hiệu hai proton vịng thơm vị trí meta δH 5,96 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-8), 5,94 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-6), proton thuộc hệ ABX δH 6,99 (1H, d, J = 1,5 Hz, H-2′), 6,82 (1H, dd, J = 1,5, 8,0 Hz, H-6′), 6,78 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-5′) t n hiệu thuộc vòng pyran δH 4,83 (1H, br s, H-2), 4,19 (1H, m, H-3), 2,88 (1H, dd, J = 14,0, 4,0 Hz, H-4a), 2,75 (1H, dd, J = 14,0, 2,5 Hz, H-4b) Phổ 13 C-NMR cho 15 tín hiệu carbon bao gồm 12 tín hiệu vịng thơm δC 95,9-158,0 ppm có t n hiệu carbon gắn với oxy δC 158,0 (C-9), 157,7 (C-7), 157,4 (C-5), 145,9 (C-4′), 145,8 (C-3′), t n hiệu vòng pyran δC 79,8 (C-2), 67,4 (C-3) 29,2 (C-4) Tín hiệu proton H-2 xuất dạng singlet rộng gợi ý hai proton H-2 H-3 phía, Trên sở số liệu phổ NMR, MS góc quay cực [α]20D -70, kết hợp so sánh với tài liệu tham khảo [7], chất CT3 xác định (-)-epicatechin [9] 31 Chất Myrisene (CT6) Chất rắn màu trắng Phổ khối ESI-MS m/z [M+H]+ 427 H-NMR (CDCl3, 500 MHz) δ (ppm): 5.55 (1H, dd, J = 2.5, 6.5 Hz, H- 11), 3.21 (1H, m, H-3), 1.11, 1.03, 0.99, 0.95, 0.93, 0.93, 0.83, 0.82 (each 3H, s, H-23, H-24, H-25, H-26, H-27, H-28, H-29, H-30) 13 C-NMR (CDCl3, 125 MHz) δ (ppm): 158.1 (C-9), 116.9 (C-11), 79.1 (C- 3), 55.6 (C-5), 49.3 (C-18), 48.3 (C-13), 41.3 (C-19), 39.0 (C-8), 38.8 (C-14), 38.0 (C-10), 37.8 (C-22), 37.7 (C-21), 37.6 (C-4), 36.7 (C-16), 35.8 (C-17), 35.1 (C-1), 33.7 (C-12), 33.4 (C-29), 33.1 (C-7), 29.9 (C-23), 29.8 (C-30), 29.7 (C-15), 28.8 (C-20), 28.0 (C-28), 27.2 (C-2), 25.9 (C-26), 21.3 (C-25), 17.5 (C6), 15.5 (C-24), 15.4 (C-27) Chất CT6 phân lập dạng tinh thể màu trắng Phổ khối ESI-MS cho pic ion giả phân tử proton hóa m/z 427 [M+H]+, gợi ý cho công thức phân tử C30H50O (M= 426) Phổ 1H-NMR cho tín hiệu đặc trưng hợp chất triterpen vịng oleanan với tín hiệu nhóm methyl singlet vị tr δH 1.11, 1.03, 0.99, 0.95, 0.93, 0.93, 0.83, 0.82 (each 3H, s, H-23, H-24, H-25, H-26, H-27, H-28, H-29, H-30), olefinic proton δH 45.55 (1H, dd, J = 2.5, 6.5 Hz, H11), tín hiệu nhóm oxymethine δH 3.21 (1H, m, H-3) Phổ 13C-NMR DEPT cho tín hiệu cộng hưởng 30 cacbon có nhóm CH3 δC 33.4 (C-29), 29.9 (C-23), 29.8 (C-30), 28.0 (C-28), 25.9 (C-26), 21.3 (C-25), 15.5 (C-24), 15.4 (C-27), olefinic carbon δC 158.1 (C9), 116.9 (C-11), nhóm CHOH δC 79.1 (C-3) Các kiện phổ NMR, MS gợi ý cho biết hợp chất myrisene [6] 32 Chất Betulinal (CT7) Chất rắn màu trắng Phổ khối ESI-MS m/z [M+H]+ 441 H-NMR (CDCl3, 500 MHz) δ (ppm): 9.68 (1H, s, H-28), 4.75 (1H, d, J = 1.5, Ha-29), 4.63 (1H, d, J = 1.5, Hb-29), 3.18 (1H, dd, J =11.5, 4.5 Hz, H-3), 2.86 (1H, m, H-19), 2.09-1.99 (2H, m, Ha-16, Hb-13), 1.69 (3H, s, H-30), 0.97 (3H, s, H-27), 0.96 (3H, s, H-23), 0.91 (3H, s, H-25), 0.82 (3H, s, H26), 0.75 (3H, s, H-24) 13 C-NMR (CDCl3, 125 MHz) δ (ppm): 206.7 (C-28), 149.6 (C-20), 110.1 (C-29), 79.0 (C-3), 59.3 (C-17), 55.3 (C-5), 50.5 (C-9), 48.1 (C-18), 47.5 (C19), 42.6 (C-14), 40.8 (C-8), 38.8 (C-1), 38.7 (C-4), 38.7 (C-13), 37.2 (C-10), 34.3 (C-7), 33.2 (C-22), 29.9 (C-16), 29.3 (C-21), 28.8 (C-15), 28.0 (C-23), 27.4 (C-2), 25.5 (C-12), 20.7 (C-11), 19.0 (C-30), 18.3 (C-6), 16.1 (C-26), 15.9 (C-25), 15.3 (C-24), 14.3 (C-27) Chất CT7 phân lập dạng tinh thể màu trắng Phổ khối ESI-MS cho pic ion giả phân tử proton hóa m/z 441 [M+H]+, gợi ý cho công thức phân tử C30H48O2 (M= 440) Phổ 1H-NMR cho tín hiệu đặc trưng hợp chất triterpen vịng lupane với tín hiệu hai olefinic proton thuộc nhóm CH2=C vị tr δH 4.75 (1H, d, J = 1.5, Ha-29), 4.63 (1H, d, J = 1.5, Hb-29), với tín hiệu nhóm methyl vị tr δH 1.69 (3H, s, H-30), 0.97 (3H, s, H-27), 0.96 (3H, s, H-23), 0.91 (3H, s, H-25), 0.82 (3H, s, H-26), 0.75 (3H, s, H-24) Bên cạnh cón có tín hiệu nhóm aldehyde vị tr δH 9.68 (1H, s, H-28), tín hiệu nhóm CHOH δH 3.18 (1H, dd, J =11.5, 4.5 Hz, H-3) 33 Phổ 13C-NMR DEPT cho tín hiệu cộng hưởng 30 cacbon có nhóm CH3 δC 28.0 (C-23), 19.0 (C-30), 16.1 (C-26), 15.9 (C-25), 15.3 (C-24), 14.3 (C-27), 12 nhóm metylen có nhóm CH2=C δC 149.6 (C-20), 110.1 (C-30), nhóm metin có nhóm CHOH δC 79.0 (C-3), nhóm aldehyde δC 206.7 (C-28) cacbon bậc bốn Các kiện phổ NMR, MS gợi ý cho biết hợp chất betulinal Chất β-Sitosterol (CT8) Chất rắn màu trắng H-NMR (500MHz, CDCl3), δ (ppm): 5,34 (1H, br d, J = 4,5 Hz), 3,52 (1H, m), 2,20-2,31 (2H, m), 1,95-2,02 (2H, m), 1,83-1,86 (3H, m), 1,47-1,70 (9H, m), 1,20-1,38 (6H, m), 0,90-1,20 (8H, m), 1.01 (3H, s), 0,92 (3H, d, J = 6,5 Hz), 0, 84 (3H, t, J = 7,5Hz), 0,83 (3H, d, J = 7,0 Hz), 0,80 (3H, d, J = 7,0 Hz), 0,68 (3H, s) Hợp chất CT8 thu dạng bột màu trắng Trên phổ 1H-NMR CT8 xuất tín hiệu đặc trưng cho hợp chất sterol có nối đơi với tín hiệu proton vị tr δH 5,34 (br d, J = Hz) , có nhóm oxymethin vị trí δH 3,52 (1H, m) nhóm methyl có singlet δH 0,68 (3H, s) 1,01 (3H, s), tín hiệu doublet δ 0,92 (3H, d, J= 6,5 Hz), 0,83 (3H, d, J= 7,3 Hz), 0,80 (3H, d, J= 6,8 Hz), tín hiệu triplet δ 0,84 (3H, t, J= 7,5 Hz) Ngoài tín hiệu khác vịng sterol Từ tính chất vật lý, số liệu phổ NMR, kết hợp so sánh với chất chuẩn có phịng thí nghiện cho phép xác định hợp chất β-sitosterol Dữ liệu phổ phù hợp với tài liệu tham khảo [11] 34 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Trong cao chiết từ thân lồi Adinandra megaphylla có chứa hợp chất polyphenol, coumarin khơng chứa nhóm chất polyphenol Cao ethanol, cao dichloromethane cao ethyl acetate nồng độ nghiên cứu có khả ức chế phát triển vi khuẩn B subtilis, L plantarum, E coli không ức chế phát triển vi khuẩn S marcescens S lutea (ngoại trừ cao dichloromethane nồng độ 60 200 µg/mL) Cao dichloromethane có hoạt tính khử gốc tự DPPH mạnh cao ethanol cao ethyl acetate, giá trị EC50 cao dichloromethane 30,3 µg/mL Cao chiết ethanol từ thân lồi A megaphylla có hoạt tính ức chế dịng tế bào ung thư vú, ung thư dày ung thư phổi, giá trị IC50 đạt 58,24; 56,54 43,52 µg/mL Nghiên cứu tinh hợp chất Betulinic acid (CT1), Galactitol, Epicatechin CT3, Myrisene (CT6), Betulinal (CT7), b-Sitosterol (CT-8) từ thân loài A megaphylla xác định cấu trúc, đặc điểm hợp chất Kiến nghị Tiếp tục xác định hoạt tính kháng khuẩn, chống oxy hóa ức chế dòng tế bào ung thư điều kiện in vitro hợp chất phân lập từ loài A megaphylla 35 TÀI LIỆU THAM KHẢO I TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Phan Văn Cư, Nguyễn Quang Linh, Huỳnh Thị Ngọc Nữ, Huỳnh Thị Thanh Hoa (2019), “Tách chiết hoạt chất sinh học từ cỏ sữa nhỏ (Euphorbia thymifolia burm) đánh giá háng huẩn vi khuẩn E coli Salmonella sp gây tiêu chảy lợn tỉnh Thừa Thiên Huế”, Tạp chí Khoa học Đại học Huế, 128, tr 1-10 Phạm Hoàng Hộ (2000), Cây Cỏ Việt Nam 2, Nxb trẻ Tp Hồ Chí Minh Đồn Thanh Huyền, Lê Minh Trí, Ngơ Thị Thúy Phương, Đ Thị Tuyên (2015), “Đánh giá hoạt t nh háng huẩn flavonoid tách từ chè xanh trầu hơng”, Tạp chí Nghiên cứu KH&CN qn sự, Số đặc san Viện Hóa học - Vật liệu, 10, tr 186-188 Phạm Văn Khang, Nguyễn Thị Thanh Hương, Mai Thanh Nga, Phạm Văn Thỉnh (2018), Giáo trình hợp chất thiên nhiên, Nxb Đại học Thái Nguyên Bùi Thị Lê Minh, Võ Ngọc Duy Hồ Thị Bảo Trân (2015), “Tác dụng kháng khuẩn tỏi (Allium sativum L.) Escherichia coli ảnh hưởng tỏi lên sinh trưởng gà bổ sung tỏi tươi vào phần thức ăn”, Tạp chí khoa phần B: Nơng nghiệp, thủy sản Công nghệ Sinh học, số 40(2), Nxb Trường đại học Cần Thơ II TÀI LIỆU TIẾNG ANH Ahmad, B., Azam, S., Bashir, S., Adhikari, A., & Hussain, F (2011) Antiinflammatory activity and a new compound isolated from aerial parts of Myrsine africana African Journal of Biotechnology, 10(42): 8465-8470 Nguyen Thai An, Bui The Hung (2008), Study on Flavonoid and Coumarin components of drugs in dispersion method, Journal of Pharmacy, 368, pp.37-40 Chen Y., Chen G., Fu X., Liu R H (2015), Phytochemical Profiles and Antioxidant Activity of Different Varieties of Adinandra Tea (Adinandra Jack), Journal of Agricultural and Food Chemistry, 63(1), pp 169-176 36 Davis A L., Cai Y., Davies A P., Lewis J R (1996) “1H and 13C NMR assignments of some green tea polyphenols” Magn Reson Chem, 34(11): 887-890 10.El-Haggar, R Al-Wabli, R.I (2015), “Anti-Inflammatory screening and molecular modeling of some novel coumarin derivatives”, Molecules, 20(4), pp.5374-5391 11.Ewa 31 Ewa Sosinska, Roman Przybylski, Paul Hazendonk, Yuan Yuan Zhao, Jonathan M Curtis, (2013) Characterisation of non-polar dimers formed during thermo-oxidative degradation of b-sitosterol, Food Chemistry, 139: 464-474 12.Gao H., Liu B., Liu F., Chen Y (2010), Anti-proliferative effect of camellianin A in Adinandra nitida leaves and its apoptotic induction in human Hep G2 and MCF-7 cells, Molecules, 15(6), pp 3878-3886 13 Hughes, J.P., S Rees, S.B Kalindjian, and K.L Philpott (2011), Principles of early drug discovery, British journal of pharmacology, 162, pp.1239-1249 14.Huu Quan Nguyen, Thi Tra Giang Kieu (2019), “Use of matK DNA barcode to identify Adinandra samples collected at Lao Cai, Vietnam”, TNU Journal of Science and Technology, 197(4), pp.205-210 15.Huu Quan Nguyen, Phuong Dung Le, Danh Thuong Sy, Quang Tan Tu, Hoang Mau Chu (2019), “Studying of anatomical characteristics and sequence of ITS gene from Adinandra lienii”, CASEAN-6 Proceedings, pp.153-159 16.Huu Quan Nguyen, Thi Kim Phuong Than, Hoang Mau Chu (2019), “Study on chemical composition and antibacteria activity of extracts total from leaves of Adiandra lienii species”, Proceedings National Biotechnology Conference 2019, pp.178-182 17.Jacquot, Y., I Laïos, A Cleeren, D Nonclercq, L Bermont, B Refouvelet, K Boube eur, A Xicluna, G Leclercq, and G Laurent (2007), “Synthesis, 37 structure, and estrogenic activity of 4-amino-3-(2-methylbenzyl)coumarins on human breast carcinoma cells”, Bioorg Med Chem, 15:2269-2282 18.Jalil J., Sabandar C W., Ahmat N et al (2015) “Inhibitory effect of triterpenoids from Dillenia serrata (Dilleniaceae) on prostaglandin E2 production and quantitative HPLC analysis of its koetjapic acid and betulinic acid contents” Molecules, 20(2): 3206-3220 19 Lan Thi Ngoc Nguyen, Quan Huu Nguyen, Nga Thi Thu Nguyen, Thuy Thi Xuan Vi, Thuong Danh Sy, Tam Thi Nguyen, Mau Hoang Chu (2020), “Antibacterial, antioxidant and anti - Cancerous activities of Adiandra megaphylla Hu leaf extracts”, Biosc Biotech Res Comm., 13(3), pp.1015-1020 20.Liu B., Yang J., Ma Y., Yuan E., Chen C (2010), Antioxidant and angiotensin converting enzyme (ACE) inhibitory activities of ethanol extract and pure flavonoid from Adinandra nitida leaves, Pharmaceutical biology, 48(12), pp 1432-1438 21.Liu B G., Ning Z., Zhan Y., Xu K., Gao J (2008), Characterization and Antioxidant Activity of Flavonoid Extract from Leaves of Adinandra nitida Merr, Chemistry and Chemical Engineering, 28(1), pp 6-10 22.Mahesh B, Satish S (2008), Antimicrobial Activity of Some Important Medicinal Plant Against Plant and Human Pathogens, World Journal of Agricultural Sciences, 4, pp 839-843 23 Mirunalini, S., K Deepalakshmi, and J Manimozhi (2014), “Antiproliferative effect of coumarin by modulating oxidant/antioxidant status and inducing apoptosis in Hep2 cells”, Biomed Aging Patho., 4:131-135 24.Monks, A., D Scudiero, P Skehan, R Shoemaker, K Paull, D Vistica, C Hose, J Langley, P Cronise, A Vaigro-Wolff, and M Gray-Goodrich (1991), Feasibility of a high-flux anticancer drug screen using a diverse 38 panel of cultured human tumor cell lines, Journal of the National Cancer Institute, 83, pp 757-766 25.Reyes-Chilpa, R., Jiménez-Estrada, M., Cristóbal-Telésforo, E., TorresColÍn, L., Villavicencio, M A., Pérez-Escandón, B E., & MercadoGonzález, R (2003) Natural insecticides from Hippocratea excelsa and Hippocratea celastroides Economic Botany, 57(1): 54-64 26.Shi, Y., Zhou, C (2011), “Synthesis and evaluation of a class of new coumarin triazole derivatives as potential antimicrobial agents”, Bioorg Med Chem Lett., 21(3), pp.956-960 27.Tabart J., K.C., Pincemail J, Defraigne J O., Dommes J (2009), Comparative antioxidant capacities of phenolic compounds measured by various tests, Food Chem, 113, pp 1226-1233 28.Thanh Son Hoang, Van Dung Luong (2014), Adinandra hongiaoensis (Theaceae) a New Species from Lam Dong, Vietnam, J Jpn Bot., 89, pp 331-334 29.Tsay, S.C., J.R Hwu, R Singha, W.C Huang, Y Hsiung, M.H Chang Hsu, F.K Shieh, C.C Lin, K.C Hwang, J Horng, E De Clercq, I Vliegen, and J.C Neyts (2014), “Coumarins hinged directly on benzimidazoles and their ribofuranosides to inhibit hepatitis C virus”, European Journal of Medicinal Chemistry, 63:290-298 30 Wang Y., Chen S., Ni J., Yao X., Ye W., Zhao S (2003), Chemical studies on the Adinandra nitida, Zhongguo Yaoke Daxue Xuebao, 34(5), pp 407-409 31.Zhang J., Tao D., Duan J., Liang Z., Zhang W., Zhang L., Huo Y., Zhang Y (2006), Separation and identification of compounds in Adinandra nitida by comprehensive two-dienzymesional liquid chromatography coupled to atmospheric pressure chemical ionization source ion trap tandem mass spectrometry, Analytical and Bioanalytical Chemistry, 386(3), pp 586-593 39 III TÀI LIỆU WEB 32 Thực vật chí Trung Quốc, http://www.efloras.org/, 10/8/2019 33 Trung tâm liệu thực vật Việt Nam, http://www.botanyvn.com/ cnt.asp?param=edir&v=Adinandra&list=genus, 20/8/2019 40 ... cho nghiên cứu nghiên cứu loài Sum lớn để trả lời câu hỏi Xuất phát từ sở tiến hành thực đề tài: ? ?Nghiên cứu hoạt tính sinh học lồi Adinandra megaphylla? ?? Mục tiêu nghiên cứu Xác định hoạt tính sinh. ..ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM Thongde LOUNNESEKHAMTHONG NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA LỒI Adinandra megaphylla Ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 8420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC... Tình hình nghiên cứu chi Dƣơng đồng (Adinandra) 1.2.1 Ở Việt Nam Trong nghiên cứu sàng lọc chất có hoạt tính sinh học Việt Nam, loài Sum hải nam (Adinandra hainanensis) phát có hoạt tính chống