3. Nội dung nghiên cứu
2.2.5.Phương pháp xác định khả năng chống oxy hĩa DPPH
Khả năng chống oxy hĩa của cao chiết từ thân của lồi A. megaphylla
được xác định theo phương pháp của Tabart và cộng sự (2009) sử dụng khả năng trung hịa gốc tự do DPPH [27]. 100 µl cao chiết m i loại ở các nồng độ 0,5; 2; 8; 32 và 128 µg/ml được bổ sung 2,9 ml dung dịch DPPH nồng độ 0,1 mM pha trong dung dịch methanol, lắc đều và để yên trong 30 phút sau đĩ đo ở bước sĩng 517 nm.
Khả năng hử gốc tự do DPPH được tính theo cơng thức sau: Khả năng khử gốc tự do DPPH (%) = 100 × (Ac - As)/Ac. Trong đĩ Ac là độ hấp thụ quang của mẫu đối chứng, As là độ hấp thụ quang của mẫu cần xác định.
Khả năng háng oxy hĩa được xác định dựa vào giá trị EC50 (là nồng độ mẫu cĩ khả năng hử gốc tự do DPPH là 50%).
2.2.6. Phương pháp xác định tính độc tế bào ung thư nuơi cấy dạng đơn lớp
Phương pháp thử độ độc tế bào ung thư in vitro được xác định theo phương pháp của Monks (1991) [24]. Cao chiết từ thân của lồi A. megaphylla
được chuẩn bị và thử nghiệm ở 4 nồng độ 100; 20; 4 và 0,8 mg/ml. Chất tham khảo Ellipticine ở các nồng độ 10; 2; 0,4 và 0,08 µg/ml được sử dụng như là chất đối chứng dương. Dimethyl sulfoxide (DMSO) ở nồng độ 10 được sử dụng như là chất đối chứng âm. Hàm lượng protein tổng số của tế bào được xác định dựa vào mật độ quang học (OD) đo được khi thành phần protein của tế bào được nhuộm bằng sulforhodamine B (SRB). Giá trị OD được đọc ở bước sĩng 515 nm trên máy ELISA Plate Reader. Giá trị OD máy đo được tỉ lệ thuận với lượng SRB gắn với phân tử protein. Giá trị OD càng lớn thì hàm lượng tế bào và hàm lượng protein càng nhiều. Khả năng gây độc tế bào được xác định bằng nồng độ của chất mà ức chế 50% sự phát triển của tế bào.
Nồng độ ức chế 50% tế bào (IC50) được xác định là nồng độ của mẫu ức chế được 50% tế bào, các gốc tự do hoặc enzyme. Chất tinh khiết được coi cĩ hoạt tính tốt khi IC50 = 5 μM [13].
Chƣơng 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Khảo sát các hợp chất cĩ trong cao chiết từ thân của lồi A. megaphylla3.1.1. Định tính polyphenol 3.1.1. Định tính polyphenol
Cao chiết ethanol từ thân của lồi A. megaphylla được định tính polyphenol bằng thuốc thử với muối sắt (III), nhận thấy dung dịch trong ống nghiệm II chuyển sang màu xanh lục và khác so với ống nghiệm I (Hình 3.1A). Trong hi định tính bằng dung dịch H2SO4 đặc, dung dịch trong ống nghiệm II chuyển sang màu vàng đậm (Hình 1B). Như vậy, trong cao chiết ethanol từ thân của lồi A. megaphylla cĩ chứa các nhĩm chất polyphenol.
A B
Hình 3.1. Định tính polyphenol của cao ethanol từ thân lồi A. megaphylla
A. Phản ứng với muối sắt (III); B. Phản ứng với dung dịch H2SO4 đặc. I. Dung dịch ban đầu; II. Dung dịch sau phản ứng
3.3.2. Định tính tanin
Về mặt hĩa học tanin được cấu tạo từ các acid tannic và acid gallic phổ biến trong cây ở dạng liên kết với đường. Tanin được chia làm 2 nhĩm, tanin thủy phân được (pyrogallic tanin) và tanin ngưng tụ (condensed tanin). Tanin cĩ tác dụng chống oxy hĩa, kháng khuẩn, giảm khả năng sống sĩt của giun kí sinh, gây tủa protein. Kết quả Hình 3.2A cho thấy cao ethanol từ thân của lồi
A. megaphllya với vanilin trong H2SO4 làm cho dung dịch trong ống nghiệm II cĩ màu đỏ đậm chứng tỏ trong nguyên liệu cĩ chứa nhĩm chất tanin.
3.3.3. Định tính các flavonoid
Cao ethanol từ thân của lồi A. megaphylla được định tính flavonoid bằng dung dịch axit HCl đặc và bột Mg kim loại. Kết quả hình 3.2B nhận thấy, trong 2 ống nghiệm I và II đều cĩ màu đỏ đậm, khơng cĩ sự hác nhau. Như vậy, trong cao ethanol từ thân của lồi A. megaphylla khơng chứa thành phần flavonoid.
A B
Hình 3.2. Định tính tanin và flavonoid của cao ethanol từ thân lồi A. megaphylla
A. Định tính tanin; B. Định tính flavonoid (B) I. Dung dịch ban đầu; II. Dung dịch sau phản ứng
3.3.4. Định tính các coumarin
Cao ethanol từ thân của lồi A. megaphylla được định tính các coumarin bằng dung dịch NaOH 10%. Kết quả nhận thấy, sau khi cho 0,5ml NaOH 10% vào ống nghiệm II, đem đun cả 2 ống nghiệm trên bếp cách thủy, sau khi làm nguội và cho thêm 4ml nước cất vào cả ống thì dung dịch ống II trở lên trong hơn (Hình 3.3A). Tiếp tục thêm vài giọt HCl đặc vào cả 2 ống nghiệm thì ống II mất màu vàng đục (Hình 3.3B). Như vậy, trong cao ethanol từ thân của lồi
A B
Hình 3.3. Định t nh coumarin của cao ethanol từ thân lồi A. megaphylla
A. Phản ứng với NaOH (A); B. Phản ứng với HCl đặc I. Dung dịch ban đầu; II. Dung dịch sau phản ứng
Như vậy, trong cao chiết từ thân của lồi A. megaphylla cĩ chứa nhĩm chất polyphenol, coumarin, tanin và khơng chứa nhĩm chất flavonoid. Nghiên cứu này phù hợp với nghiên cứu của Nguyen và cộng sự (2020) đã chứng minh cao chiết từ lá của lồi A. megaphylla cĩ chứa các hợp chất polyphenol, coumarin và khơng chứa flavonoid [19] và khác so với cao chiết từ lồi A. lienii
chưa cả polyphenol, coumarin và flavonoid [16].
3.2. Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết từ thân của lồi A. megaphylla (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Kết quả nghiên cứu cho thấy cao ethanol, cao dichloromethane và cao ethyl acetate ở các nồng độ khảo sát 20; 60 và 200 µg/mL đều cĩ khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn B. subtilis, L. plantarum và vi khuẩn E. coli. Trong khi, cao ethanol và cao ethyl acetate ở 3 nồng độ khảo sát; cao dichloromethane nồng độ 20 µg/mL khơng cĩ khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn S. marcescens và vi khuẩn S. lutea. Ở nồng độ 60 và 200 µg/mL cao dichloromethane cĩ khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn S. lutea
(Bảng 3.1 và Hình 3.4). Trong đĩ, cao dichloromethane cĩ hả năng ức chế vi khuẩn tốt nhất, tiếp đến là cao ethyl acetate và cao ethanol.
Cao chiết ethanol, etyl acetate và dichloromethane từ lồi A. lienii được chứng minh cĩ hoạt tính ức chế sự phát triển của các lồi vi khuẩn S. aureus, B.
[16]. Cũng ở nồng độ 200µg/mL, cao chiết ethanol, etyl acetate và dichloromethane từ lá của lồi A. megaphylla cũng cĩ hoạt tính ức chế các lồi vi khuẩn S. aureus, B. subtilis, S. marcessens, S. lutea, L. plantarum và
E. coli [19]. Như vậy, kết quả trong nghiên cứu này khác so với các nghiên cứu trên. Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết từ thân của lồi Sum lá lớn yếu hơn so với từ lá và so với lồi A. lienii. Tuy nhiên, cao dichlormethane cĩ hoạt tính tốt nhất, tiếp đến là cao ethyl acetate và cao ethanol.
Hình 3.4. Hoạt tính kháng vi khuẩn B. subtilis (A), S. marcescens (B), S. lutea (C), L. plantarum (D) và E. coli (E) của cao chiết từ lồi A. megaphylla
Giếng ĐC trên đĩa thạch chứa dung dịch đối chiếu là DMSO
Bảng 3.1. Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết từ cây A. megaphylla
TT Vi khuẩn Các loại cao chiết ở nồng độ khảo sát
E1 E2 E3 E4 E5 E6 E7 E8 E9 1 B. subtilis + + + ++ ++ ++ ++ +++ +++ 2 S. marcescens - - - - 3 S. lutea - - - ++ ++ 4 L. plantarum + ++ ++ ++ ++ ++ +++ +++ +++ 5 E. coli + ++ ++ ++ ++ +++ +++ +++ +++
Ghi chú: (-) khơng ức chế (khơng xuất hiện vịng kháng khuẩn); (+) ức chế yếu (đường kính vịng kháng khuẩn từ 1-5 mm); (++) ức chế (đường kính vịng kháng khuẩn từ 6- 10mm); (+++) ức chế mạnh (đường kính vịng kháng khuẩn >10mm).
E1, E2, E3: Cao chiết ethanol ở nồng độ 20; 60 và 200 µg/mL; E4, E5, E6: cao ethyl acetate ở nồng độ 20; 60 và 200 µg/mL; E7, E8, E9: cao dichloromethane ở nồng 20;
60 và 200 µg/mL.
3.3. Hoạt tính chống oxi hĩa của cao chiết từ thân của lồi A. megaphylla
Hiện nay, hoạt tính chống oxy hĩa từ các chất cĩ nguồn gốc sinh học được các nhà khoa học quan tâm nhiều hơn. Các chất chống oxy hĩa được biết đến như vitamin E, vitamin C, lycopen, resveratrol, và một số chất trao đổi thứ cấp khác trong cây. Các chất này được bổ sung vào dược phẩm và thực phẩm chức năng cĩ tác dụng tăng cường khả năng miễn dịch của cơ thể, phịng và điều trị các bệnh do gốc tự do sinh ra như tiểu đường, tim mạch, alzheimer, ung thư…. Các chất chống oxy hĩa nguồn gốc thực vật đang được ưa chuộng do đặc điểm lý hĩa của chúng như thân thiện với cơ thể, bền nhiệt… các chất này thường cĩ bản chất là các polyphenol. Do vậy, chúng tơi tiến hành thử hoạt tính chống oxy hĩa nhằm tìm kiếm các hợp chất cĩ hoạt tính chống oxy hĩa mới cĩ nguồn gốc thực vật.
Kết quả cho thấy, hiệu quả khử gốc tự do DPPH của cao chiết ethanol, cao ethyl acetate và cao dichloromethane tỉ lệ thuận với nồng độ cao chiết, khi nồng độ cao chiết tăng từ 0,5-128 µg/mL thì hiệu quả khử gốc tự do cũng tăng dần từ 0-75,7%. Cao ethyl acetate cĩ hoạt tính mạnh nhất thể hiện ở nồng độ khử gốc tự do DPPH với giá trị EC50 là 28,9 µg/mL. Cao ethanol cĩ hoạt tính khử gốc tự do DPPH với giá trị EC50 là 32,0 µg/mL. Trong khi, cao dichloromethane hoạt tính khử gốc tự do DPPH rất yếu với giá trị EC50 > 128 µg/mL (Bảng 3.2). So sánh với nghiên cứu của Nguyen và cộng sự (2021) nhận thấy, cao dichloromethane đều cĩ hoạt tính chống oxi hĩa rất yếu, giá trị EC50 > 128 µg/mL; tuy nhiên giá trị EC50 của cao ethyl acetate và cao ethanol của thân nhỏ hơn so với của lá. Như vậy, cao chiết từ thân của lồi A.
sắc của dung dịch khử gốc tự do DPPH trước hi đo đối với cao ethanol được minh họa ở hình 3.5.
Bảng 3.2. Hoạt tính chống oxy hĩa của cao chiết từ thân của lồi A. megphylla
Nồng độ (µg/mL)
Khả năng khử gốc tự do DPPH (%)
Cao ethanol Cao dichloromethane Cao ethyl acetate 0,5 0 0 25,4 2,0 6,8 4,3 28,6 8,0 19,7 10,8 37,0 32 50,0 18,3 55,2 128 71,8 40,5 75,7 EC50 32,0 > 128 28,9
Hình 3.5. Màu sắc của mẫu khử gốc tự do DPPH trước hi đo của cao ethanol 3.4. Hoạt tính ức chế dịng tế bào ung thƣ của cao ethanol từ thân của lồi
A. megaphylla trong điều kiện in vitro
Nghiên cứu được thử nghiệm trên ba dịng tế bào ung thư MDA-MB-231 (ung thư vú), AGS (ung thư dạ dày) và A549 (ung thư phổi). Kết quả bảng 3.3 cho thấy cao chiết từ thân của lồi Sum lá lớn cĩ khả năng ức chế sự phát triển của ba dịng tế bào ung thư MDA-MB-231 (ung thư vú), AGS (ung thư dạ dày) và A549 (ung thư phổi) với giá trị IC50 lần lượt đạt 58,24; 56,54 và 43,52 µg/mL. Trong đĩ, hiệu quả ức chế của cao chiết trên dịng tế bào ung thư vú là lớn nhất, tiếp đến là dịng tế bào ung thư dạ dày và thấp nhất là dịng tế bào ung
thư phổi. Như vậy, cao chiết từ thân của lồi Sum lá lớn cĩ hoạt tính chống tế bào ung thư vú, ung thư dạ dày và ung thư phổi.
Một số hợp chất dị vịng chứa coumarin cĩ liên quan đến các đặc tính như chống viêm [10], kháng khuẩn [26], kháng virus [29] và chống ung thư [17]. Ngồi ra, coumarin cũng thể hiện tác dụng gây độc tế bào ung thư đối với các tế bào Hep2 (loại biểu mơ người), ảnh hưởng tới quá trình apoptosis, sự biến mất của lớp màng vi nhung mao, làm giảm hàm lượng huyết tương của tế bào chất và sự phân hủy nhân [23]. Trong nghiên cứu này, cao chiết từ thân của lồi Sum lá lớn được xác định cĩ chứa polyphenol và coumarin là các hợp chất cĩ khả năng ức chế các dịng tế bào ung thư đạt hiệu quả cao. Kết quả nghiên cứu này phù hợp với nghiên cứu của Nguyen và cộng sự (2020), tuy nhiên hoạt tính ức chế các dịng tế bào ung thư của cao chiết từ thân thấp hơn so với cao chiết từ lá.
Bảng 3.3. Hoạt tính ức chế các dịng tế bào ung thư của cao chiết
từ thân của lồi A. megaphylla
Nồng độ (µg/mL)
% ức chế sự phát triển của dịng tế bào (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
A549 AGS MDA-MB-231
100 91,32 ± 2,06 82,09 ± 1,36 80,26 ± 1,42 20 26,66 ± 1,86 20,55 ± 1,04 19,07 ± 1,25
4 5,33 ± 1,43 5,83 ± 0,16 7,97 ± 0,96
0,8 -4,15 ± 0,56 2,12 ± 0,89 0,38 ± 0,29
IC50 43,52 ± 4,05 56,54 ± 5,59 58,24 ± 6,25
3.3.2. Phân lập các hợp chất sạch từ cặn của của lồi Adinandra megaphylla
Cặn chiết EtOAc (62 g) được đưa lên cột sắc ý silica gel pha thường (300 g) rửa giải với hệ dung mơi n-hexane/ethyl acetate (từ 30-100%), các phân đoạn được kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng (SKLM) để thu được 7 phân đoạn tương ứng từ E1- E7 (Sơ đồ 3.1).
Phân đoạn E2 (32 g) lấy 1g tinh chế bằng sắc ký cột silica gel pha thường với hệ dung mơi rửa giải n-hexane ethyl acetate (2 1) thu được 3 phân đoạn E2.1 (0,12 g); E2.2 (0,57 g ); E2.3 (0,14 g). Từ phân đoạn E2.2 (0,57 g) tinh chế tiếp thu được hợp chất sạch là CT1 (30 mg).
Phân đoạn E3 (3,7 g) được tinh chế bằng sắc ký cột silica gel pha thường với hệ dung mơi rửa giải H E (1 1) thu được 5 phân đoạn E3.1 (0,16 g); E3.2 (0,31 g); E3.3 (0,1 g); E3.4(0,37 g); E3.5 (0,54 g). Từ phân đoạn E3.2 (0,31 g) tinh chế tiếp thu được hợp chất sạch là CT7(12 mg). Từ phân đoạn E3.4 (0,37 g) tinh chế tiếp thu được hợp chất sạch là CT8 (6 mg).
Phân đoạn E4 (3,2 g) được tinh chế bằng sắc ký cột silica gel pha thường với hệ dung mơi rửa giải CH2Cl2 MeOH (2 0,2) thu được 5 phân đoạn E4.1 (0,37 g); E4.2 (0,44 g ); E4.3 (0,85 g);E4.4 (0,1 g); E4.5 (1,15 g). Từ phân đoạn E4.1 (0,37 g) tinh chế tiếp thu được hợp chất sạch là CT6 (6 mg). Tiếp tục tinh chế phân đoạn E4.3 (0,85 g) qua cột pha đảo với hệ dung mơi rửa giải MeOH/H2O (1 1,5) thu được hợp chất sạch là CT3 (5 mg).
Phân đoạn E5 (2,5 g) được tinh chế bằng sắc ký cột silica gel pha thường với hệ dung mơi rửa giải H/CH2Cl2/Ac (1/1 0,5) thu được 3 phân đoạn E5.1 (0,9 g); E5.2 (0,5 g); E5.3 (1,25 g). Từ phân đoạn E5.1 (0,9 g) tinh chế tiếp thu được hợp chất sạch là CT10 (13 mg). Từ phân đoạn E5.2 (0,5 g) tinh chế tiếp thu được hợp chất sạch là CT11 (6mg).
Hình 3.6. Phân lập cặn chiết ethyl acetate từ thân của lồi A.megaphylla
Bằng các phương pháp sử dụng trong nghiên cứu tách chiết các hợp chất hĩa học, chúng tơi đã phân lập được 6 chất sạch từ thân của lồi A. megaphylla (Bảng 3.4).
Bảng 3.4. Cấu trúc hĩa học các hợp chất phân lập từ thân
của lồi A. megaphylla
TT Cấu trúc hĩa học TT Cấu trúc hĩa học
1 Betulinic acid (CT1) 4 Myrisene (CT6) 2 Galactitol 5 Betulinal (CT7) 3 Epicatechin CT3 6 b-Sitosterol (CT-8)
Các chất sạch phân lập được từ thân cĩ đặc điểm sau:
Hợp chất Betulinic (CT1)
1 H-NMR (DMSO-d6, 500 MHz) δ (ppm): 4.67 (1H, d, J = 2.0, Ha-29), 4.55 (1H, br s, Hb-29), 4.30 (1H, br s, OH-3), 2.98-2.91 (2H, m, H-3, Hβ-19), 2.21 (1H, td, J = 3.5; 13 Hz, Hβ-13), 2.11-2.08 (1H, m, Hβ-16), 1.80-1.76 (2H, m, Hβ-21, Hβ-22), 1.63 (3H, s, H-30), 0.92 (3H, s, H-27), 0.86 (3H, s, H-23), 0.86 (3H, s, H-25), 0.75 (3H, s, H-26), 0.64 (3H, s, H-24). 13 C-NMR (DMSO-d6, 125 MHz) δ (ppm): 177.2 (C-28), 150.3 (C-20), 109.6 (C-29), 76.8 (C-3), 55.4 (C-17), 54.9 (C-5), 49.9 (C-9), 48.6 (C-18), 46.6 (C- 19), 42.0 (C14), 40.3 (C-8), 38.5 (C-4), 38.0 (C-1), 37.6 (C-13), 36.7 (C-10), 36.3 (C-22), 33.9 (C-7), 31.7 (C-16), 30.1 (C-21), 29.2 (C-15), 28.1 (C-23), 27.1 (C-2), 25.1 (C-12), 20.5 (C-11), 18.9 (C-30), 18.0 (C-6), 15.9 (C-26), 15.8 (C-24), 15.7 (C-25), 14.4 (C-27).
Chất CT1 được phân lập từ dịch chiết ethyl acetate dưới dạng tinh thể màu trắng, điểm nĩng chảy 295-298 0C. Phổ khối ESI-MS cho pic ion giả phân tử proton hĩa ở m/z 457 [M+H]+, gợi ý cho cơng thức phân tử là C30H48O3 (M= 456).
Phổ 1H-NMR cho các tín hiệu đặc trưng của 1 hợp chất triterpene vịng lupane với tín hiệu của hai olefinic proton thuộc nhĩm CH2=C ở vị tr δH
4.67 (1H, d, J = 2.0, Ha-29), 4.55 (1H, br s, Hb-29), cùng với tín hiệu 6 nhĩm thế methyl tại các vị tr δH 1.63 (3H, s, H-30), 0.92 (3H, s, H-27), 0.86 (3H, s, H-23), 0.86 (3H, s, H-25), 0.75 (3H, s, H-26), 0.64 (3H, s, H-24). Bên cạnh đĩ cịn cĩ tín hiệu nhĩm CHOH ở vị tr δH 2.98-2.91 (1H, m, H-3), tín hiệu nhĩm hydroxyl ở δH 4.30 (1H, br s, OH-3).
Phổ 13C-NMR và HSQC cho tín hiệu của 30 cacbon trong đĩ cĩ 6 nhĩm CH3 tại δC 28.1 (C-23), 18.9 (C-30), 15.9 (C-26), 15.8 (C-24), 15.7 (C-25), 14.4 (C-27); 12 nhĩm CH2 trong đĩ cĩ một nhĩm CH2=C tại δC 109.6 (C-29); 6 nhĩm CH trong đĩ cĩ nhĩm CHOH tại δC 76.8 (C-3) và 6 cacbon bậc bốn, trơng đĩ cĩ nhĩm C=O ở vị trí 177.2 (C-28) và C=CH2 ở δC 150.3 (C-20).
Các dữ kiện phổ 13C-NMR và ESI-MS cho phép gợi ý hợp chất này là triterpene carboxylic acid. So sánh số liệu phổ với tài liệu tham khảo của betulinic acid thấy phù hợp. Hợp chất CT1 được xác định là betulinic acid [18].
Chất Galactitol (CT2) 1 H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ (ppm): 4.39 (2H, d, J = 5.5 Hz, OH), 4.30 (2H, t, J = 5.5 Hz, OH), 4.12 (2H, t, J = 7.0 Hz, OH), 3.60 (2H, m, H-2, H-5), 3.54 (2H, t, J = 9.5 Hz, H-1, H-6), 3.45 (2H, m, H-3, H-4), 3.38 (2H, m, H-1, H-6). 13 C-NMR (125 MHz, DMSO-d6) δ (ppm): 71.3 (C-3, C-4), 69.7 (C-2, C-5), 63.8 (C-1, C-6).
Chất CT2 được phân lập từ dịch chiết nước dưới dạng chất rắn màu trắng. Phổ khối ESI-MS cho pic ion giả phân tử proton hĩa ở m/z 183 [M+H]+, kết hợp với phổ NMR cĩ 3 tín hiệu carbon gợi ý cho cơng thức phân tử là C6H14O6 (M= 182) và hợp chất này là một hợp chất cĩ cấu trúc đối xứng, các tín hiệu NMR là các tín hiệu kép.
Phổ 1H-NMR cho các tín hiệu của hợp chất nhiều nhĩm hydroxyl với các nhĩm hydroxyl tại 4.39 (2H, d, J = 5.5 Hz, OH), 4.30 (2H, t, J = 5.5 Hz, OH), 4.12 (2H, t, J = 7.0 Hz, OH), cịn cĩ tín hiệu nhĩm oxymethin tại 3.60 (2H, m,